肉蓯蓉低分子糖對(duì)巨噬細(xì)胞激活作用的研究

張雨荷　王麗超　屠鵬飛　曾克武　姜勇

[摘要]探究肉蓯蓉低分子糖對(duì)RAW2647小鼠巨噬細(xì)胞的激活作用及潛在機(jī)制。該實(shí)驗(yàn)將RAW2647細(xì)胞分為正常對(duì)照組、細(xì)菌脂多糖（LPS）陽(yáng)性對(duì)照組、肉蓯蓉低分子糖處理組，其中肉蓯蓉低分子糖的給藥濃度為391～625 g·L-1。采用中性紅法檢測(cè)巨噬細(xì)胞吞噬活性，一氧化氮（NO）試劑盒檢測(cè)NO的釋放量，Western blot法檢測(cè)巨噬細(xì)胞激活相關(guān)蛋白（TNFα，IL6，IKKβ，pIKKβ，IκBα，pIκBα，NFκB，pNFκB）的表達(dá)。結(jié)果顯示，肉蓯蓉低分子糖對(duì)巨噬細(xì)胞具有激活作用，具體表現(xiàn)在：其可顯著提高RAW2647細(xì)胞NO的釋放量，并促進(jìn)細(xì)胞因子TNFα和IL6的表達(dá)。同時(shí)，其還可顯著提高NFκB的磷酸化及其上游關(guān)鍵信號(hào)蛋白IKKβ和IκBα的磷酸化水平。另外，低分子糖中的甘露醇可以使巨噬細(xì)胞的吞噬活性顯著提升。以上結(jié)果表明，肉蓯蓉低分子糖對(duì)巨噬細(xì)胞具有激活作用，其潛在機(jī)制是通過NFκB信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，甘露醇可能是其中的一種關(guān)鍵活性單體成分。

[關(guān)鍵詞]肉蓯蓉低分子糖； 免疫激活； 巨噬細(xì)胞； 炎癥因子； NFκB

[Abstract]To investigate the immune activation effect and mechanism of low molecular weight saccharides from Cistanche deserticola（LMSC） on mouse peritoneal macrophages， RAW2647 cells The RAW2647 cells were divided into the normal control group， LPS positive control group， and LMSC treatment groups The RAW2647 cells were treated with various concentrations of LMSC from 391 to 625 g·L-1 The neutral red assay was employed to detect the phagocytic activity of macrophages NO release was detected by using NO kit， and macrophage activation associated protein expression levels （TNFα， IL6， IKKβ， pIKKβ， IκBα， pIκBα， NFκB， and pNFκB） were detected by Western blot Results showed that LMSC had an activation effect on macrophages； it can significantly increase the release of NO in RAW2647 cells and promote the expression of cytokines TNFα and IL6 Moreover， LMSC significantly increased the phosphorylation of IKKβ， IκBα， and NFκB p65 Furthermore， mannitol′s one of the main constituents in LMSC significantly enhanced the phagocytic activity of macrophages These results showed that LMSC could activate macrophages by upregulating the NFκB signaling pathway， and mannitol may be one of the main active components in LMSC.

[Key words]Low molecular weight saccharides； Cistanche deserticola； immune activation； macrophage； inflammatory factor； NFκB

肉蓯蓉Cistanche deserticola Y C Ma為列當(dāng)科肉蓯蓉屬植物，其肉質(zhì)莖可入藥，具有補(bǔ)腎陽(yáng)、益精血、潤(rùn)燥通腸等功效，被譽(yù)為“沙漠人參”。肉蓯蓉的化學(xué)成分包括苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜苷、糖類、木脂素類等多種類型?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉具有神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化等諸多生物學(xué)活性[1]。有研究表明，肉蓯蓉的水煎物以及多糖都可明顯提高巨噬細(xì)胞吞噬能力以及分泌功能[23]。但是，對(duì)于其低分子糖類的活性研究尚未見報(bào)道。因此，本研究利用RAW2647小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，探討了肉蓯蓉低分子糖類的免疫調(diào)節(jié)活性及相關(guān)機(jī)制。該研究可為今后全面理解肉蓯蓉的免疫調(diào)節(jié)作用提供更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，從而進(jìn)一步指導(dǎo)其臨床應(yīng)用。

1材料

RAW2647細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心；胎牛血清（FBS）購(gòu)自德國(guó)PAN Biotech公司；抗生素、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自中科邁晨科技有限公司。大腸桿菌脂多糖（lipopolysaccharide from Escherichia coli O55：B5，LPS）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。一氧化氮（NO）試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；肉蓯蓉總苷、肉蓯蓉低分子糖、肉蓯蓉多糖由本課題組自制，其中肉蓯蓉總苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7876%，肉蓯蓉低分子糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5800%，肉蓯蓉多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6524%。Tanon5200Multi凝膠成像分體系統(tǒng)購(gòu)自上海天能科技有限公司；SunriseBasic酶標(biāo)儀購(gòu)自TECAN公司。endprint

2方法

21中性紅法測(cè)定巨噬細(xì)胞吞噬活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，胰酶消化后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為5×104個(gè)/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μL/孔，于37 ℃，5%CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)上清液，分別加入DMEM培養(yǎng)基（10%FBS+1%P/S），LPS（1 mg·L-1）以及肉蓯蓉總苷、肉蓯蓉總多糖、肉蓯蓉低分子糖（分別為391～625 g·L-1，給藥前用濾膜過濾）進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，每孔加入0075%中性紅生理鹽水溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，用PBS洗3遍，每孔加入細(xì)胞裂解液（冰醋酸乙醇1∶1）100 μL，4 ℃下放置2 h，待細(xì)胞裂解后測(cè)定吸光度（A540 nm）。

22細(xì)胞上清液中NO釋放量檢測(cè)將RAW2647細(xì)胞接種于48孔板（1×105個(gè)/mL，500 μL/孔），過夜孵育后吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，分別加入DMEM培養(yǎng)基（10%FBS+1%P/S），LPS（1 mg·L-1）以及肉蓯蓉總苷、總多糖、低分子糖（分別為391～625 g·L-1）各500 μL。誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后，收集上清液。用NO試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞上清液中NO濃度，按照說(shuō)明書操作，最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度（A570 nm）。

23Western blot將RAW2647細(xì)胞接種于6孔板，過夜孵育后吸棄細(xì)胞培養(yǎng)基，分別加入DMEM培養(yǎng)基（10%FBS+1%P/S），LPS（1 mg·L-1）以及肉蓯蓉總多糖、低分子糖（391～625 g·L-1）各2 mL，誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后，棄去上清液。細(xì)胞用PBS洗2遍，棄去。胰酶消化后，將細(xì)胞吹打下來(lái)。離心，去上清液，加入100 μL NP40裂解液，冰上裂解40 min。離心后取上層清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，并調(diào)勻各組蛋白濃度。

取等量蛋白樣品于12%SDSPAGE，恒壓條件下進(jìn)行分離。然后用BioRad轉(zhuǎn)移電泳槽350 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上（PVDF膜的預(yù)處理：甲醇浸泡后用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡）。室溫下用5%脫脂牛奶（用含有01%吐溫20的TBST配置）封閉1 h后，用TBST洗膜3次，將膜置于蛋白一抗稀釋液中4 ℃過夜孵育。隔天用TBST洗膜3次，加入相應(yīng)二抗稀釋液，孵育1 h，TBST洗膜3次，用ECL化學(xué)發(fā)光顯影液對(duì)條帶顯影。

24數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)均采用±s表示，差異顯著性檢驗(yàn)采用GraphPad Prism 6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析。以P< 001作為具有非常顯著性差異，P<005為具有顯著性差異。

3結(jié)果

31肉蓯蓉低分子糖、總苷以及總多糖對(duì)RAW2647細(xì)胞吞噬活性的影響有關(guān)肉蓯蓉化學(xué)成分的研究表明，肉蓯蓉中主要含有苯乙醇苷、環(huán)烯醚萜苷類和糖類成分，本實(shí)驗(yàn)選擇肉蓯蓉總苷（含苯乙醇苷和環(huán)烯醚萜苷）、低分子糖和總多糖3種活性部位考察其對(duì)RAW2647細(xì)胞激活的影響。肉蓯蓉多糖和肉蓯蓉低分子糖均能顯著提高RAW2647細(xì)胞的吞噬活性，而總苷部位給藥組的細(xì)胞吞噬活性變化不明顯。此外，陽(yáng)性對(duì)照藥LPS也明顯提高了RAW2647細(xì)胞的吞噬活性，見圖1。以上結(jié)果提示，肉蓯蓉低分子糖和多糖可能具有激活RAW2647細(xì)胞的作用。

與對(duì)照組相比1） P<001，2） P<005（圖2～5同）。

32肉蓯蓉總苷、低分子糖和總多糖對(duì)細(xì)胞上清液中一氧化氮（NO）含量的影響為進(jìn)一步考察肉蓯蓉3種活性部位對(duì)RAW2647細(xì)胞的激活作用，分別測(cè)定了不同藥物刺激后的細(xì)胞上清液中NO的含量。結(jié)果顯示，LPS組NO釋放量顯著高于空白對(duì)照組（P<001）；肉蓯蓉低分子糖和多糖5個(gè)劑量的給藥組NO釋放量皆顯著高于對(duì)照組（P<001），且呈劑量依賴性；肉蓯蓉總苷沒有顯著影響。以上結(jié)果表明，肉蓯蓉多糖和低分子糖均有促進(jìn)RAW2647細(xì)胞釋放NO的作用，其中肉蓯蓉低分子糖效果尤其顯著，見圖2。

33肉蓯蓉低分子糖對(duì)RAW2647細(xì)胞TNFα和IL6蛋白表達(dá)的影響TNFα是RAW2647細(xì)胞激活反應(yīng)過程中出現(xiàn)的一種重要的炎性介質(zhì)，可以促使其他細(xì)胞因子（如IL6）的合成和釋放。結(jié)果顯示，肉蓯蓉低分子糖刺激后，TNFα和IL6的表達(dá)量顯著提高，提示肉蓯蓉低分子糖可能通過促進(jìn)RAW2647細(xì)胞表達(dá)TNFα和IL6蛋白，進(jìn)而激活細(xì)胞的免疫吞噬功能，見圖3。

34肉蓯蓉低分子糖對(duì)IKKβ/IκBα/NFκB信號(hào)通路的調(diào)控作用為了探究肉蓯蓉低分子糖激活RAW2647細(xì)胞的潛在作用機(jī)制，作者考察了其對(duì)IKKβ/IκBα/NFκB經(jīng)典信號(hào)通路的調(diào)控作用。肉蓯蓉低分子糖能夠顯著提高NFκB磷酸化以及其上游的關(guān)鍵信號(hào)蛋白IKKβ和IκBα的磷酸化，并且降低IκBα總蛋白的表達(dá)，表明其對(duì)IKKβ/IκBα/NFκB信號(hào)通路具有激活作用。陽(yáng)性對(duì)照藥LPS也具有類似的調(diào)控效果。綜上所述，肉蓯蓉低分子糖可能通過激活I(lǐng)KKβ/IκBα/NFκB信號(hào)通路，進(jìn)而引起TNFα和IL6等細(xì)胞因子的合成與釋放，最終引起RAW2647細(xì)胞的免疫激活，見圖4。

35肉蓯蓉低分子糖中具有巨噬細(xì)胞激活作用的活性成分篩選本實(shí)驗(yàn)室前期已對(duì)肉蓯蓉所含的低分子糖類進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)主要含有甘露醇（1653%）、蔗糖（834%）、果糖（2538%）、葡萄糖（775%）等成分。于是作者利用中性紅法對(duì)上述成分對(duì)巨噬細(xì)胞的激活作用進(jìn)行了篩選。甘露醇可顯著提高巨噬細(xì)胞的吞噬活性，且具有劑量依賴性，而其他成分作用不顯著。這提示甘露醇可能是肉蓯蓉低分子糖中激活巨噬細(xì)胞的關(guān)鍵活性成分之一，見圖5。

4討論

列當(dāng)科寄生植物肉蓯蓉被報(bào)道具有免疫調(diào)節(jié)作用，因此其應(yīng)該含有免疫調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中，作者對(duì)肉蓯蓉的不同純化部位進(jìn)行小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性的篩選后，發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉低分子糖和肉蓯蓉多糖具有巨噬細(xì)胞激活作用，而肉蓯蓉總苷不明顯。同時(shí)作者發(fā)現(xiàn)，低分子糖類在較低濃度下即可對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生激活作用，因此作者選擇肉蓯蓉低分子糖類作為后續(xù)研究重點(diǎn)。endprint

通過檢測(cè)肉蓯蓉低分子糖對(duì)細(xì)胞因子TNFα和IL6表達(dá)的影響，作者發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉低分子糖使TNFα和IL6的表達(dá)量顯著提高，這進(jìn)一步證明肉蓯蓉低分子糖對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞有激活作用。于是作者又進(jìn)一步探究了其潛在的作用機(jī)制。有研究表明，細(xì)菌脂多糖（LPS）可通過JAK2/STAT3，NFκB，p38/ERK，MAPK等信號(hào)通路誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞和小鼠膠質(zhì)細(xì)胞活化[48]。NFκB通路是公認(rèn)的一條經(jīng)典通路，因此本實(shí)驗(yàn)中對(duì)這條通路上的信號(hào)蛋白進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉低分子糖能夠顯著提高NFκB磷酸化以及其上游的關(guān)鍵信號(hào)蛋白IKKβ和IκBα的磷酸化，提示肉蓯蓉低分子糖可能通過IKKβ/IκBα/NFκB信號(hào)通路激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞免疫激活作用。

實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)肉蓯蓉低分子糖提取物的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)分析。發(fā)現(xiàn)低分子糖中主要含有甘露醇、蔗糖、果糖、葡萄糖等單體。進(jìn)一步研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘露醇對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬活性有顯著的提高作用，因此推測(cè)甘露醇可能是低分子糖中具有激活細(xì)胞免疫功能的關(guān)鍵成分。

綜上所述，本研究利用巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，發(fā)現(xiàn)了肉蓯蓉低分子糖對(duì)巨噬細(xì)胞有顯著激活作用，并且可能通過NFκB信號(hào)通路激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮作用。低分子糖中的甘露醇可能對(duì)激活巨噬細(xì)胞的吞噬活性具有重要作用。

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[責(zé)任編輯張寧寧]endprint