黃連提取物的中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)研究

劉洋+尹秀文+王子禹+李雪蓮+潘孟+李彥萍+董玲

[摘要]中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（CMMBCS）的優(yōu)勢之一，是將分類歸屬的研究層面從單成分擴展到中藥多成分，進而從多成分擴展到中藥整體研究層面。該研究以黃連提取物中的生物堿為主要研究對象，探究生物堿單一成分及黃連提取物中各生物堿成分的水溶解性及腸滲透性變化規(guī)律，并對黃連提取物整體做中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)歸屬研究。其中采用經(jīng)典搖瓶法和高效液相色譜法測定生物堿單一成分及提取物中各生物堿成分的溶解度變化及分類，采用在體單向腸灌流法進行生物堿吸收定量研究，同時采用自定義權(quán)重系數(shù)法對黃連提取物整體進行滲透系數(shù)計算。

[關(guān)鍵詞]黃連提取物； 生物堿； 溶解性； 腸滲透性； 中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)

[Abstract]One of the advantages of biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica （CMMBCS） is expanding the classification research level from single ingredient to multicomponents of Chinese herb， and from multicomponents research to holistic research of the Chinese materia medica In present paper， the alkaloids of extract of huanglian were chosen as the main research object to explore their change rules in solubility and intestinal permeability of singlecomponent and multicomponents， and to determine the biopharmaceutical classification of extract of Huanglian from holistic level The typical shakeflask method and HPLC were used to detect the solubility of single ingredient of alkaloids from extract of huanglian The quantitative research of alkaloids in intestinal absorption was measured in singlepass intestinal perfusion experiment while permeability coefficient of extract of huanglian was calculated by selfdefined weight coefficient method.

[Key words]extract of huanglian； alkaloids； solubility； intestinal permeability； biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica

生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)自被提出以來[1]，歷經(jīng)20余年的數(shù)據(jù)積累和科學(xué)研究，已成為化學(xué)藥物基礎(chǔ)研究和研發(fā)中十分重要的工具之一[2]。其依據(jù)水溶解性及腸滲透性高低對藥物進行分類，核心要素溶解度、溶出度和滲透性又分別代表了影響藥物被吸收的程度、藥物從制劑中釋放的速度和藥物穿透腸細胞的轉(zhuǎn)運速度及藥物吸收濃度的依存性[34]。為了貫徹這種以吸收為精髓的分類理念，并充分結(jié)合中藥多成分復(fù)雜體系及中藥臨床療效實際的特點，課題組在2014年提出了“中藥生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica，CMMBCS）”的學(xué)術(shù)理念[5]。CMMBCS的研究以吸收與否為界，先在復(fù)雜多成分環(huán)境下定性鎖定可吸收成分，再定量測定可吸收成分的水溶解性和腸滲透性數(shù)據(jù)從而進行科學(xué)歸類，為揭示中藥多成分吸收的相互影響及相關(guān)機制的基本研究奠定基礎(chǔ)。基于理論背景及“多成分層次差異比較法”的指導(dǎo)，CMMBCS探討中藥代表性目標成分、多成分環(huán)境下目標成分、復(fù)方整體3個層次之間的內(nèi)部規(guī)律，從而建立CMMBCS預(yù)測模型。

課題組以經(jīng)典方 “葛根芩連方”為研究載體，前期已對高含量成分葛根素的BCS屬性[6]及多成分環(huán)境對其溶解度及滲透性的影響做了分析[78]，對小檗堿單一成分、小檗堿在黃連藥材中[9]、小檗堿在葛根芩連復(fù)方中[10]的CMMBCS屬性做了系列研究，同時通過離體法及在體法，初步鎖定了黃連水提液中可透過腸壁吸收并吸收入血的目標成分[11]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，以黃連提取物為研究對象，對中藥提取物CMMBCS屬性進行探索與測定，并對與其相關(guān)的數(shù)學(xué)公式進行了應(yīng)用與驗證，以期為中藥整體乃至中藥復(fù)方的CMMBCS歸屬研究提供數(shù)據(jù)與理論支持。

1材料

11儀器

LC20AT高效液相色譜儀（SPD20A型紫外檢測器，SIL20A自動進樣器，日本島津公司）；BT25S電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；DZKW4電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；981B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；KH7200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；STARTER2100實驗室pH計（奧豪斯儀器上海有限公司）；注射泵（LSP021B，保定蘭格恒流泵有限公司）；高速冷凍離心機（SIGMA，德國）。

12試劑與藥品endprint

鹽酸小檗堿對照品（批號110713201212，中國食品藥品檢定研究院，純度868%）；木蘭花堿對照品（批號M2903S1，上海源葉生物科技有限公司，純度98%）；非洲防己堿對照品（批號Y13M6W1，上海源葉生物科技有限公司，純度98%）；表小檗堿對照品（批號H25F3X1，上海源葉生物科技有限公司，純度98%）；鹽酸藥根堿對照品（批號Z15T4B1，上海源葉生物科技有限公司，純度98%）；鹽酸黃連堿對照品（批號ZS0924BE14，上海源葉生物科技有限公司，純度98%）；鹽酸巴馬汀對照品（批號KS0922CF14，上海源葉生物科技有限公司，純度98%）；鹽酸小檗堿原料（批號130808，陜西中鑫生物技術(shù)有限公司）；乙腈（色譜級，美國Fisher公司）；純凈水（娃哈哈集團公司）；黃連提取物（實驗室自制）；其他試劑均為分析純。

13實驗動物

SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200～250 g，斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，許可證號 SCXK（京）20160002。

2方法

21溶液的制備

211對照品溶液的制備

分別精密稱定木蘭花堿、非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對照品適量置于量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻后得質(zhì)量濃度分別0203，0203，0100 4，0243，0102 4，0264，0400 g·L-1的各對照品儲備液。精密移取木蘭花堿、非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對照品溶液適量置于同一10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻備用，得混合對照品母液。

212不同pH緩沖液的制備

pH 10鹽酸溶液：量取鹽酸溶液9 mL，加水稀釋至1 000 mL，即得；pH 40緩沖液：取一水枸櫞酸1290 g，取磷酸氫二鈉2725 g，加水1 000 mL溶解，即得；pH 68緩沖液：取磷酸二氫鉀170 g和磷酸氫二鉀178 g，加水溶解稀釋至1 000 mL，即得；pH 74緩沖液：取磷酸二氫鉀681 g，加01 mol·L-1氫氧化鈉溶液395 mL稀釋至1 000 mL，即得。KrebsRinger′s營養(yǎng)液（KR液）：稱取NaCl 780 g，KCl 035 g，CaCl2 037 g，NaHCO3 137 g，NaH2PO4 032 g，MgCl2 002 g，葡萄糖140 g；加蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH到739～741，放置備用。

213黃連提取物的制備

課題組前期通過單因素與正交試驗方法，確定黃連提取物的最佳制備方法。取黃連粉末25 g，以10倍量的80%乙醇加熱回流提取2次，每次1 h，得黃連總生物堿粗提物。選用AB8型大孔樹脂，以徑高比1∶7、上樣濃度005 g·mL-1（生藥濃度）、上樣體積45 倍柱體積、吸附流速10 mL·min-1、水洗體積1倍柱體積、50%乙醇洗脫、洗脫劑用量4倍柱體積的工藝參數(shù)對粗提物進行純化，富集黃連中的生物堿總量合計可達4895%。

22方法學(xué)考察

221生物堿單一成分生物樣品的分析方法學(xué)考察

2211色譜條件Waters Atlantis T3色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流動相①木蘭花堿及非洲防己堿：水溶液（03%磷酸05%三乙胺，調(diào)pH 30）乙腈（80∶20）；②表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀及鹽酸小檗堿：水（03%磷酸05%三乙胺，調(diào)pH 30）乙腈（70∶30）；流速10 mL·min-1；檢測波長265 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2212標準曲線的繪制分別精密移取211項下7種生物堿對照品儲備液一定體積于5 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成一系列濃度的生物堿對照品溶液。分別精密吸取上述各對照品溶液10 μL進樣，測定其峰面積。分別以木蘭花堿、非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿各對照品溶液的質(zhì)量濃度（mg·L-1）為橫坐標，峰面積（A）為縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸。

2213精密度試驗取各對照品溶液，按上述色譜條件分別重復(fù)進樣6次，記錄峰面積，分別計算相對標準偏差（RSD）。

2214重復(fù)性試驗精密稱取各對照品制備其溶液各6份，分別精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，分別計算RSD。

2215穩(wěn)定性試驗取各生物堿生物樣品溶液分別于0，2，4，6，12，24 h進樣檢測，記錄峰面積，分別計算RSD。

2216回收率試驗取空白腸灌流液，分別加入不同量各對照品。高效液相測其含量，計算回收率及其RSD。

222黃連提取物生物樣品的分析方法學(xué)考察

2221色譜條件Waters Atlantis T3色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）水（B，含03%磷酸，05%三乙胺，調(diào)pH 30），梯度洗脫（0～2 min，13%A；2～4 min，13%～20%A；4～50 min，20%～25%A；50～55 min，25%～30%A；55～63 min，30%～70%A；63～65 min，70%～95%A；65～70 min，95%～13%A；70～80 min，13%A）；檢測波長265 nm；流速06 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2222標準曲線的繪制精密移取混合對照品母液010，050，100，200 mL分別置于5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，備用，與混合對照品母液共同配制成一系列濃度的混合對照品溶液。過022 μm微孔濾膜，精密取上述溶液10 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積。分別以木蘭花堿、非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿各對照品溶液的濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線并進行回歸。endprint

2223精密度試驗取混合對照品溶液，按色譜條件分別重復(fù)進樣6次，測定峰面積。

2224重復(fù)性試驗取黃連提取物粉末5份，平行制備5份供試品溶液，按色譜條件測定峰面積。

2225穩(wěn)定性試驗精密吸取新配制的供試品溶液，分別在0，2，6，12，24 h按色譜條件測定峰面積。

2226加樣回收率試驗精密稱取黃連提取物粉末700 mg，分別加入精密稱定的7種生物堿對照品，平行操作5份，按色譜條件測定峰面積。

23溶解度測定

231生物堿單一成分平衡溶解度測定

取待測生物堿單一成分適量，置2 mL離心管中，準確加入pH 74緩沖液10 mL，（37±1）℃水浴加熱，同時每隔5 min強力振搖30 s，觀察30 min，至待測化合物不再溶解，將溶液置于室溫條件下靜置一定時間后15 000 r·min-1離心15 min，分別加入pH 74緩沖液適當稀釋后，再經(jīng)過15 000 r·min-1離心15 min，取上清液過045 μm微孔濾膜，注入高效液相色譜儀測定其溶解度。

232黃連提取物中各生物堿成分平衡溶解度的測定

黃連提取物平衡溶解度的測定采用經(jīng)典搖瓶法，測定其在不同pH介質(zhì)（pH 10緩沖液、pH 40緩沖液、pH 68緩沖液、pH 74緩沖液及水）中的平衡溶解度。取黃連提取物適量，置10 mL具塞試管中，加入不同pH 緩沖液50 mL（準確加入量），（37±1）℃水浴加熱，同時每隔5 min強力振搖30 s，觀察30 min，至待測化合物不再溶解，將溶液置于室溫條件下靜置一定時間，分別取1 mL溶液置于離心管中，15 000 r·min-1離心15 min，加入相應(yīng)的介質(zhì)適當稀釋后，再經(jīng)過15 000 r·min-1離心15 min，取上清液過045 μm微孔濾膜，注入高效液相色譜儀測定其溶解度。

31方法學(xué)分析

結(jié)果表明，生物堿單一成分中，木蘭花堿在199～1592 mg·L-1線性關(guān)系良好，R2=0999 8；非洲防己堿在199～1989 mg·L-1線性關(guān)系良好，R2=0999 9；表小檗堿在197～1771 mg·L-1線性關(guān)系良好，R2=0999 7；鹽酸藥根堿在095～1905 mg·L-1線性關(guān)系良好，R2=10；鹽酸黃連堿在201～2408 mg·L-1線性關(guān)系良好，R2=0999 9；鹽酸巴馬汀在103～5174 mg·L-1線性關(guān)系良好，R2=10；鹽酸小檗堿在694～10404 mg·L-1線性關(guān)系良好，R2=0999 8。木蘭花堿、非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀與鹽酸小檗堿的精密度RSD分別為072%，060%，13%，030%，043%，043%及054%，重復(fù)性RSD分別為099%，11%，16%，18%，11%，11%及15%，穩(wěn)定性RSD分別為038%，075%，060%，036%，039%，034%，048%。儀器精密度及方法重復(fù)性良好，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定，加樣回收率9545% ～ 1004%，RSD均小于30%。

黃連提取物中的各個生物堿木蘭花堿、非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸藥根堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀與鹽酸小檗堿在025～1235，016～796，048～2389，015～747，060～2999，042～2117，139～6936 mg·L-1線性均良好，R2分別為0999 1，0999 5，0999 9，0999 6，0999 4，0999 4，0999 4，精密度RSD依次為028%，095%，17%，18%，054%，047%，027%，重復(fù)性RSD依次為14%，19%，20%，30%，17%，18%，15%，穩(wěn)定性RSD依次為071%，11%，30%，27%，18%，10%，022%。儀器精密度及方法重復(fù)性良好，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定，加樣回收率9613% ～ 1055%，RSD均小于30%。

32溶解度結(jié)果

321生物堿的平衡溶解度

由于后續(xù)灌流實驗中所采用的KR液pH為74，因此選擇 pH 74緩沖液作為各單一成分溶解度測定的pH 介質(zhì)。而各生物堿單一成分在黃連提取物的環(huán)境中，溶解度因介質(zhì)pH的不同而不同，結(jié)果見表1。單一成分溶解度與其在提取物這一多成分環(huán)境中的溶解度有所不同，結(jié)果見表2。

表

由結(jié)果分析可知，黃連提取物中各生物堿成分的溶解度在pH 10時最小，在水中溶解度最大。黃連提取物中各生物堿的溶解度均隨pH的增大基本呈增大趨勢，溶解度曲線趨勢相似；各生物堿單一成分的平衡溶解度與其在黃連提取物中的平衡溶解度相比均有顯著性差異，其中木蘭花堿、鹽酸藥根堿及鹽酸巴馬汀在提取物中的溶解度顯著減小，而非洲防己堿、表小檗堿、鹽酸黃連堿及鹽酸小檗堿的溶解度顯著增大。尤其是鹽酸小檗堿，其在黃連提取物中的平衡溶解度較其單一成分溶解度提升約15倍，可能與其本身溶解度較大且在提取物中含量最高有關(guān)（相對于提取物中的其他生物堿）。此結(jié)果與課題組前期研究結(jié)果[9]相一致，表明了黃連中其他成分有利于鹽酸小檗堿溶解度的增加。

322黃連提取物的溶解度及劑量數(shù)D0

由321項結(jié)果可知，黃連提取物中各生物堿成分的溶解度在pH 10時最小。依據(jù)各生物堿測得的平衡溶解度及其在黃連提取物中的含量可推算黃連提取物濃度，根據(jù)公式（1）Cs的定義，以黃連提取物中各成分在pH 10緩沖液中的溶解度推算黃連提取物的溶解度，結(jié)果見表3。

由以上結(jié)果可知，各生物堿達到平衡溶解度時各自對應(yīng)的黃連提取物的濃度/溶解度不同，則在各自對應(yīng)的最大的黃連提取物濃度/溶解度狀態(tài)下，即可保證各生物堿成分溶解完全。當黃連提取物質(zhì)量濃度為15693 g·L-1時，黃連提取物中各生物堿成分均已達到飽和狀態(tài)，故確定黃連提取物的最小溶解度為15693 g·L-1。endprint

藥典中凡例項下二十七項規(guī)定“飲片的[用法與用量]，除另有規(guī)定外，用法系指水煎內(nèi)服；用量系指成人一日常用劑量，必要時可根據(jù)需要酌情增減?！彼幍渲悬S連用量為2～5 g，外用適量。因此，取5 g為黃連的最大用藥劑量，相當于自制黃連提取物的0787 g。因此，黃連提取物的劑量數(shù)D0經(jīng)公式（1）計算，為0201。黃連提取物D0<1，屬于高溶解度。

33滲透性結(jié)果

331生物堿的有效滲透系數(shù)

用KR試液配制黃連提取物溶液，考察質(zhì)量濃度015 g·L-1（低濃度）、03 g·L-1（中濃度）和045 g·L-1（高濃度）的黃連提取物在體腸吸收情況，結(jié)果見表4。

為便于與黃連提取物中生物堿的滲透性進行比較，單一生物堿成分的研究僅選取大鼠空腸為灌流對象，中濃度腸灌流液為濃度參照。由于鹽酸黃連堿和鹽酸小檗堿在KR營養(yǎng)液中的溶解度問題，其二者的腸灌流液濃度以低濃度中各生物堿的濃度為參照。滲透系數(shù)Peff測定結(jié)果見表5。

332黃連提取物的滲透系數(shù)Peff

以中濃度黃連提取物在空腸的滲透系數(shù)進行計算，結(jié)果見表6。

由以上結(jié)果可得，黃連提取物以生物堿類成分進行滲透性分類屬于低滲透性，各單一成分的有效滲透系數(shù)Peff均低于美托洛爾。在提取物這一多成分環(huán)境中，各成分的滲透性提升均不高。

4討論

黃連提取物中各生物堿的溶解度在pH 10緩沖液中較低，在pH 68以上的堿性環(huán)境中各生物堿成分的溶解度顯著增大。在pH 74緩沖液中各生物堿單一成分與在提取物中各成分的溶解度均有較為顯著的變化。推測除了生物堿成分的相互作用外，黃連提取物中的未知成分也可能存在增溶或減溶作用。而各生物堿單一成分與黃連提取物中各成分的滲透性，除木蘭花堿及表小檗堿外，其滲透系數(shù)Peff無顯著性差異，木蘭花堿及表小檗堿的吸收參數(shù)有顯著差異，但各個生物堿的滲透系數(shù)Peff數(shù)量級均在10-4級別，且均小于05×10-4 cm·s-1，仍為低滲透性藥物?？梢?，在黃連提取物中各成分的滲透性并未出現(xiàn)數(shù)量級的變化，各成分間的相互作用或者提取物中其他未知成分對滲透性的影響不大。

綜合黃連提取物的溶解度和滲透性研究結(jié)果，黃連提取物在pH 10緩沖液中的溶解度為15693 g·L-1，據(jù)此獲得的劑量數(shù)D0為0201，小于1，屬于高溶解度；黃連提取物在空腸的滲透系數(shù)為0146×10-4 cm·s-1，低于美托洛爾滲透系數(shù)，屬于低滲透性，故將黃連提取物歸屬為CMMBCS Ⅲ類。本研究在進一步豐富和完善CMMBCS頂層研究的同時，還可挖掘出從單一成分固有性質(zhì)到多成分環(huán)境下變化的CMMBCS的本質(zhì)特色屬性，對評價中藥成分的吸收情況及證實成分配伍影響吸收的趨勢提供基礎(chǔ)依據(jù)。通過成分間生物藥劑學(xué)的關(guān)系研究，為今后優(yōu)化出相互促進的多成分物質(zhì)基礎(chǔ)組分及現(xiàn)代中藥創(chuàng)新品種的開發(fā)提供研發(fā)體系、科研模式的基礎(chǔ)推動作用。

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[責任編輯孔晶晶]endprint