生鮮乳中三聚氰胺檢測改進(jìn)方法試驗(yàn)方案

杜 楊 楊婧芳 宋 冉 侯華萍

（1.河南省安陽市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測檢驗(yàn)中心，河南安陽 455000；2.河南省安陽市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南安陽 455000；3.河南省安陽市畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣站，河南安陽 455000；4.河南省安陽市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測檢驗(yàn)中心，河南安陽 455000）

生鮮乳中三聚氰胺檢測改進(jìn)方法試驗(yàn)方案

杜 楊1楊婧芳2宋 冉3侯華萍4

（1.河南省安陽市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測檢驗(yàn)中心，河南安陽 455000；2.河南省安陽市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南安陽 455000；3.河南省安陽市畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣站，河南安陽 455000；4.河南省安陽市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測檢驗(yàn)中心，河南安陽 455000）

三聚氰胺（Melamine）是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，重要有機(jī)化工原料，具有腎毒性，能導(dǎo)致人體腎結(jié)石，甚至腎衰竭而被強(qiáng)制限量。2008年10月7日，國家質(zhì)檢總局、國家標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)發(fā)布了GB/T22388-2008國家標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)三聚氰胺的檢測有高效液相色譜法（HPLC），液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（LC-MS/MS）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）。目前液相色譜配合紫外檢測器或二極管陣列是最常用的檢測方法，但其不足在于前處理時(shí)間長、步驟復(fù)雜，降低檢測效率。與國標(biāo)法相比，改進(jìn)的方法不采用三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾、更換流動(dòng)相中離子對(duì)試劑緩沖液與乙腈的比例及試劑，更換提取液試劑，共可降低約40%的檢測成本，節(jié)省約2倍的處理時(shí)間。

三聚氰胺檢測；國標(biāo)方法；改進(jìn)方法；回收率；高效率；低成本

1 試劑與儀器

1.1 試劑

甲醇、乙腈均為色譜純，三氯乙酸、檸檬酸均為分析純，氨水（25～28%），辛烷磺酸鈉色譜純，三聚氰胺對(duì)照品純度≥99.0%。

1.2 儀器和設(shè)備

高效液相色譜儀，配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器，高速冷凍離心機(jī)，固相萃取裝置，渦旋混合器，陽離子交換固相萃取小柱（MCX），氮吹儀等。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取100 mg（精確到0.1 mg）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100ml容量瓶中，用去離子水溶解并定容至刻度，配制成濃度為1 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃避光保存。準(zhǔn)確移取5.0 ml三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)貯備液，置于50ml容量瓶中，用20%甲醇稀釋至刻度，配制成濃度為100ug/mL的稀釋液。用20%甲醇將稀釋液逐級(jí)稀釋得到的濃度為0.0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0ug/ml的標(biāo)準(zhǔn)工作液。三聚氰胺最低定量限為2.0 mg/kg。（校正曲線色譜圖第13頁）

2.2 三聚氰胺樣品前處理

稱取樣品2g左右（精確到0.01g）置于50ml塑料離心管中，加18ml三氯乙酸和乙酸鉛混合液（三氯乙酸：乙酸鉛=50：2 V：V），渦旋2min，超聲提取25min，12000r離心10min，取5mL上清液待用。MCX小柱分別用3mL甲醇，3ml水活化。5ml上清液全部過柱，流速1ml/min。3ml水、3ml甲醇洗滌后擠干，3ml氨水甲醇洗脫，50℃下氮?dú)獯蹈桑?ml20%甲醇溶液復(fù)溶，復(fù)溶液過0.22μm濾膜，供HPLC測定。

2.3 HPLC的測定方法

色譜柱：C8柱，（150mm×4.6 mm）；流動(dòng)相：離子對(duì)試劑緩沖液-乙腈（94∶6，V：V），離子對(duì)試劑緩沖液（準(zhǔn)確稱取2.10 g檸檬酸和2.02 g庚烷磺酸鈉于1L容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度。）流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；波長：240 nm；進(jìn)樣量：20μl。

2.4 方法檢驗(yàn)

（1）重復(fù)性。將2.50μg/ml的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣7次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.35 %，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.21%。（圖譜見附件2第16～20 頁）

（2）改進(jìn)方法的準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)。以加標(biāo)回收率計(jì)算，在生鮮乳樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，使添加的濃度為2.5、5.0、10.0、20.0ug/mL，按“2.2”項(xiàng)的方法對(duì)同一樣品平行處理，供HPLC測定，計(jì)算回收率。回收率＞90%，精密度（RSD）＜7%（表1）。（圖譜見附件2第23～42頁）

（3）國家標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確度試驗(yàn) 采用國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T22388-2008）HPLC法中的方法處理樣品，乳制品按“2.4.2”項(xiàng)加入標(biāo)準(zhǔn)液，并對(duì)同一樣品平行處理，供HPLC測定，計(jì)算回收率及精密度（表1）。（圖譜見附件3第44～65頁）

表1 2種檢測方法加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較（n=5）

（4）2種檢測方法測定結(jié)果比較 改進(jìn)的方法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)上述乳制品加標(biāo)，改進(jìn)方法測定生鮮乳平均回收率在95～110%，國家標(biāo)準(zhǔn)方法測定回收率在80～95%。在檢測限相同的條件下，改進(jìn)方法樣品前處理的時(shí)間為60～70min，樣品檢測成本約為30元，國家標(biāo)準(zhǔn)方法樣品前處理的時(shí)間為120 min，樣品檢測成本約為50元。

3 討論

國家標(biāo)準(zhǔn)的前處理用三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾離心液，1%的三氯乙酸沉淀蛋白，容易堵塞固相萃取（SPE）小柱，延長了處理時(shí)間。本研究顯示：部分三聚氰胺被沉淀物物理吸附，并在離心過程中隨乳制品基質(zhì)發(fā)生沉淀，有可能在過濾的過程中濾紙也吸附少量的三聚氰胺。

改進(jìn)方法的回收率為95～110%，精密度RSD＜7%符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求（RSD＜15%）準(zhǔn)確度好，精密度高。與國標(biāo)法相比，改進(jìn)的方法不采用三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾、更換流動(dòng)相中離子對(duì)試劑緩沖液與乙腈的比例及試劑，更換提取液試劑，共可降低約40%的檢測成本，節(jié)省約2倍的處理時(shí)間。綜合比較認(rèn)為，本方法具有快速、成本低、靈敏度高、精密度好等特點(diǎn)，尤其適用于大批量生鮮乳樣品中三聚氰胺的檢測。

4 經(jīng)濟(jì)效益及社會(huì)效益

在檢測限相同的條件下，改進(jìn)方法樣品前處理的時(shí)間為60～70min，樣品檢測成本約為30元，國家標(biāo)準(zhǔn)方法樣品前處理的時(shí)間為120 min，樣品檢測成本約50元。按照一年做200批次樣品，共可節(jié)省成本約4000元，并且樣品前處理批次可以擴(kuò)大2倍。為加大對(duì)生鮮乳的監(jiān)管力度和保障食品安全帶來了不可估量的社會(huì)效益。

[1]蔣晨陽，謝國蓮，劉滿萍，等.生鮮乳中三聚氰胺檢測方法的試驗(yàn)研究[A].首屆中國獸藥大會(huì)暨中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物藥品學(xué)分會(huì)2008年學(xué)術(shù)年會(huì)[C].2008：145.