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    單味中草藥對(duì)仔豬致病性大腸桿菌體外抑菌試驗(yàn)

    2017-11-17 06:27:01
    獸醫(yī)導(dǎo)刊 2017年14期
    關(guān)鍵詞:菌毛單味致病性

    韓 雪

    (1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730030;2.清水鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)工作站,甘肅岷縣 745400)

    單味中草藥對(duì)仔豬致病性大腸桿菌體外抑菌試驗(yàn)

    韓 雪

    (1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730030;2.清水鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)工作站,甘肅岷縣 745400)

    為了篩選出對(duì)仔豬致病性大腸桿菌流行株體外抑菌活性強(qiáng)的單味中草藥,本實(shí)驗(yàn)用水提法制備復(fù)方中草藥藥液,濃度為1g/mL;利用平板打孔法和試管二倍稀釋法分別測(cè)定單味中草藥抑菌圈直徑大小和最小抑菌濃度(MIC)。

    藥物;大腸桿菌

    豬腹瀉是由具有特定血清型的大腸桿菌引起的。致病性大腸桿菌病因年齡的不同而表現(xiàn)出不同的差異,根據(jù)研究,這種差異與仔豬腸道黏膜上皮細(xì)胞的受體的表達(dá)水平有關(guān),而這種差異的表現(xiàn)在豬發(fā)病日齡和發(fā)病特征上,例如 1 周齡以內(nèi)的仔豬易患仔豬黃痢,10~30 日齡的豬易患仔豬白痢,在斷奶前后的仔豬最易患水腫病。大腸桿菌引起豬腹瀉的機(jī)理還與致病性大腸桿菌的存在有一個(gè)或更多的菌毛有關(guān),是導(dǎo)致仔豬腹瀉的一個(gè)前提條件就是菌毛與腸道內(nèi)的受體結(jié)合,所以,我們把菌毛也叫做粘附素(adh esin)或定居因子(Colonization factor,CF),菌毛的生物學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì),是引起仔豬腹瀉主要的致病機(jī)理。

    中草藥富含多種抑菌的化學(xué)活性物質(zhì),不僅對(duì)E.coli具有直接或者間接的殺滅作用,還可以清除內(nèi)毒素和消除E.coli菌耐藥質(zhì)粒,降低其耐藥性,在國(guó)內(nèi)中草藥防治雞、豬源大腸桿菌病的研究相對(duì)較多,被廣泛應(yīng)用與豬源大腸桿菌病的防治中。

    1 單味中草藥藥液的制備

    用水提法提取中藥的有效成分,將12味中藥烘干,各取50g,加入5~10倍蒸餾水浸泡2h,煮開(kāi)后慢火煮30min左右,12層紗布過(guò)濾,用同樣方法再煮一次,過(guò)濾,合并2次煮的藥液進(jìn)行濃縮,濃度的濃度為1g/mL,離心后,調(diào)整pH值為7.2~7.3,121℃高壓滅,15min,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2 大腸桿菌菌液的制備

    取出仔豬致病性大腸桿菌的菌種,室溫解凍后,接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上,37℃恒溫培養(yǎng)12h后,挑單菌落,接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中,置于37℃搖床震蕩培養(yǎng)12h,利用平板菌落計(jì)數(shù)法對(duì)該菌進(jìn)行計(jì)數(shù),調(diào)整仔豬致病性大腸桿菌終濃度為108CFU/ml。

    3 單味中草藥抑菌圈直徑的測(cè)定與結(jié)果

    利用平板打孔法測(cè)定中藥水提物抑菌圈直徑大小,取仔豬致病性大腸桿菌0.1ml(108CFU/ml)涂布在平板,在超凈工作臺(tái)中待完全吸收后,取無(wú)菌的牛津杯放在普通培養(yǎng)平板上,加滿藥液,靜置0.5h后,置37℃培養(yǎng)12h,每一種藥物做3個(gè)重復(fù),取平均值;判定標(biāo)準(zhǔn)為:10mm<抑菌直徑為低敏,10mm≤抑菌直徑<15mm為中敏,15mm≤抑菌直徑<20mm為高敏,20mm≤抑菌直徑為極敏。由表1可知,仔豬致病性大腸桿菌對(duì)金銀花、黃連、訶子、五味子、苦參5味單味中藥高度敏感,抑菌圈直徑分別為在19.2mm、17.1mm、18.5mm、18.9mm、18.1mm;對(duì)板藍(lán)根、白頭翁、連翹、五倍子4種3種藥物中度敏感,抑菌圈直徑分別為14.7 mm、13.6 mm、15.4 mm、12.1 mm;對(duì)秦皮、蒲公英2種藥物低敏,抑菌圈直徑在分別為8.5mm、9.2mm;仔豬致病性大腸桿菌對(duì)敗醬草無(wú)明顯作用。

    4 單味中草藥體外抑菌MlC的測(cè)定與結(jié)果

    利用試管二倍稀釋法測(cè)定中藥水提物的最小殺菌濃度(MBC)[8],取12只編號(hào)的滅菌的試管,每個(gè)試管中加入無(wú)菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯2mL,在第1管中加2ml中藥水提物混勻,取出2ml混合藥液放入第2管,依此類推,稀釋到第10管,棄去2ml,第11管為陽(yáng)性對(duì)照,第12管為陰性對(duì)照。在1~11只管中加入菌液20μl(108CFU/ml),每一種藥物3個(gè)重復(fù),37℃培養(yǎng)18~24h后,將每個(gè)藥物不同濃度的培養(yǎng)物接種于普通培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12~18h。無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)中藥水提物濃度梯度為該藥的MBC。由表2可知,仔豬致病性大腸桿菌對(duì)金銀花、黃連、訶子、五味子、苦參5味單味中藥高度敏感,體外抑菌MIC分別為7.8 mg/ml、7.8 mg/ml、7.8 mg/ml、15.63 mg/ml、31.25 mg/ml;對(duì)板藍(lán)根、白頭翁、連翹、五倍子4種藥物中度敏感,體外抑菌MIC分別為62.5 mg/ml、62.5 mg/ml、125 mg/ml、125 mg/ml;對(duì)秦皮、蒲公英2種藥物低敏,體外抑菌MIC分別為分別為250mg/ml、250mg/ml仔豬致病性大腸桿菌對(duì)敗醬草無(wú)明顯作用。

    5 小結(jié)

    豬腹瀉是由具有特定血清型的大腸桿菌引起的,感染不同階段的仔豬,會(huì)引發(fā)同的癥狀,仔豬因年齡的不同而表現(xiàn)出不同的病候,1 周齡以內(nèi)的仔豬易患仔豬黃痢,10~30 日齡的豬易患仔豬白痢,在斷奶前后的仔豬最易患水腫病,這3種病均是由仔豬的致病性大腸桿菌引起的來(lái),仔豬的致病性大腸桿菌發(fā)病率和感染率均較高,該菌易產(chǎn)生耐藥性。本文利用平板打孔法和試管二倍稀釋法分別測(cè)定單味中草藥抑菌圈直徑大小和最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果顯示,篩選出來(lái)了對(duì)豬致病性大腸桿菌流行株高度敏感的5種種草喲,金銀花、黃連、訶子、五味子、苦參;抑菌圈直徑分別為19.2mm、17.1mm、18.5mm、18.9mm、18.1mm;體外抑菌MIC分別為7.8 mg/ml、7.8 mg/ml、7.8 mg/ml、15.63 mg/ml、31.25 mg/ml;為進(jìn)一步研制復(fù)方中草藥防治仔豬致病性大腸桿菌病和臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

    表1 單味中草藥對(duì)仔豬致病性E.coli抑菌圈直徑結(jié)果(單位:mm)注“-”無(wú)敏感性

    表2 單味中草藥對(duì)仔豬致病性E.coli抑菌圈MlC結(jié)果(單位:mg/ml)注“-”無(wú)敏感性

    [1]向雙云,周珍輝,李玉冰,等.8種中草藥對(duì)大腸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2016,(5下):167-169.

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