一種長(zhǎng)鏈?zhǔn)灏穚H敏感抗菌牙體修復(fù)材料的合成與抗菌性能

商 惠, 徐心源, 梁靜鷗, 程 磊, 李建樹(shù)*(1. 四川大學(xué) a. 高分子科學(xué)與工程學(xué)院 高分子材料工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,b. 華西口腔醫(yī)院 口腔疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065)

·研究論文·

一種長(zhǎng)鏈?zhǔn)灏穚H敏感抗菌牙體修復(fù)材料的合成與抗菌性能

商 惠1a, 徐心源1a, 梁靜鷗1b, 程 磊1b, 李建樹(shù)1a*
(1. 四川大學(xué) a. 高分子科學(xué)與工程學(xué)院 高分子材料工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,b. 華西口腔醫(yī)院 口腔疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610065)

口腔粘結(jié)劑常被用于粘結(jié)復(fù)合樹(shù)脂和牙本質(zhì)或牙釉質(zhì)，但由于殘留細(xì)菌會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)齲病從而使得粘結(jié)劑修復(fù)體不能提供長(zhǎng)期療效，目前市場(chǎng)上使用的粘結(jié)劑均無(wú)法避免細(xì)菌滋生。本文采用兩步法合成了一種甲基丙烯酸酯基封端的長(zhǎng)鏈?zhǔn)灏?，通過(guò)柱層析進(jìn)行純化，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和FT-IR表征，并對(duì)其抗菌性能進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：該材料可通過(guò)質(zhì)子化作用提升口腔pH值抑制細(xì)菌滋生。

長(zhǎng)鏈?zhǔn)灏? 合成; pH敏感; 抗菌性能; 牙體修復(fù)

近年來(lái)，“最小損傷”的口腔修復(fù)理念深入人心，在口腔修復(fù)領(lǐng)域占據(jù)著主導(dǎo)地位。促進(jìn)完善“最小損傷”理論的一個(gè)重要技術(shù)進(jìn)步就是粘結(jié)劑修復(fù)技術(shù)[1]。自1955年，Buonocore[2]將釉質(zhì)酸蝕技術(shù)應(yīng)用于口腔粘結(jié)劑后，修復(fù)就開(kāi)始步入歷史舞臺(tái)。至今，口腔粘結(jié)劑已經(jīng)歷了七代變革，從實(shí)際操作到產(chǎn)品性能均有了質(zhì)的飛躍。但由于繼發(fā)齲的生成、修復(fù)體的斷裂以及邊緣微滲漏等使得口腔粘結(jié)劑修復(fù)無(wú)法長(zhǎng)時(shí)間保持有效。修復(fù)材料引起細(xì)菌滋生和黏附是引發(fā)繼發(fā)齲的主要原因[3-4]。

因此，針對(duì)改善口腔粘結(jié)劑抗菌性的研究越來(lái)越多，其基本原則是不損傷粘結(jié)性能，添加某種具有抗菌性單體，例如季銨鹽、納米顆粒和其他具有抗菌作用單體等等。有研究者在粘結(jié)劑體系中引入了納米顆粒，在不影響原材料物理機(jī)械性能的前提下，利用納米顆粒的緩慢釋放達(dá)到長(zhǎng)期有效抗菌的目的[5-8]。同時(shí)，也有研究者嘗試將一種新的季銨鹽單體加入粘結(jié)劑中，利用季銨鹽單體的碳碳雙鍵以光固化的方式與商業(yè)化粘結(jié)劑交聯(lián)在一起，能有效避免抗菌單體從粘結(jié)劑中滲出且這種單體有較好的抑菌能力[9]。季銨鹽的抗菌性?xún)?yōu)異，但其細(xì)胞毒性和生物相容性不好。Palermo等[10]的研究中提到伯胺和叔胺的抗菌性及溶血性能與其質(zhì)子化程度有關(guān)，即具有pH敏感性，而口腔粘結(jié)劑的應(yīng)用環(huán)境存在著酸堿變化，使得叔胺的pH敏感性可以得到充分應(yīng)用。

本文采用兩步法合成了一種甲基丙烯酸酯基封端的長(zhǎng)鏈?zhǔn)灏?MADMAE)，通過(guò)柱層析進(jìn)行純化，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和FT-IR表征。并研究了其抗菌性能進(jìn)行了研究。該材料可通過(guò)質(zhì)子化作用提升口腔pH值繼而抑制細(xì)菌滋生，同時(shí)利用其叔胺基團(tuán)質(zhì)子化產(chǎn)生的正電荷吸附表面帶負(fù)電荷的細(xì)菌，并利用其長(zhǎng)鏈破壞細(xì)胞膜的完整性達(dá)到殺菌效果。調(diào)節(jié)口腔微環(huán)境抑制細(xì)菌的滋生同時(shí)在細(xì)菌滋生的同時(shí)由具備殺菌作用為改性粘結(jié)劑提供了新的思路和途徑，另外叔胺類(lèi)較低的細(xì)胞毒性也是一個(gè)不可忽略的優(yōu)勢(shì)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UNITY INOVA-400型核磁共振儀(氘代氯仿為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Nicolet 6700型傅里葉紅外光譜儀(涂膜)；PHS-3C型pH計(jì)。

甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA， 98%)， 1-溴十二烷(98%)，N-甲氨-2-羥基乙胺(98%)，甲基丙烯酰氯(分析純)，對(duì)苯二酚(分析純)，上海阿拉?。蝗野?分析純)，四氫呋喃(分析純)，二氯甲烷(分析純)，無(wú)水碳酸鈉(99%)，乙醇(分析純)，偶氮二異丁腈(98%)，堿性氧化鋁(98%)，石油醚(分析純)，四川海宏；4?分子篩，科龍?jiān)噭┕?；?shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 合成

(1) DMAE的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入1-溴十二烷11.98 mL(49.9 mmol)、N-甲基-2羥基乙胺6.02 mL(76.5 mmol)、無(wú)水碳酸鈉6.00 g(56.6 mmol)和乙醇30 mL，攪拌下回流(60 ℃)反應(yīng)8 h。抽濾除去溴化鈉和碳酸，濾液于50 ℃旋蒸使溶液中的溴化鈉和碳酸鈉析出，并除去乙醇和過(guò)量N-甲基-2-羥基乙胺，抽濾，濾液于25 ℃真空干燥過(guò)夜除去乙醇，經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：V(甲醇) ∶V(二氯甲烷)=1 ∶7,加入體積比4‰氨水]純化得DMAE。

(2) MADMAE的合成

將反應(yīng)瓶用熱風(fēng)槍烘烤以除去氧氣和水分，加入DMAE 0.805 g、三乙胺0.549 g、對(duì)苯二酚4.4 mg(摩爾比為1 ∶1.5 ∶0.01)和二氯甲烷10 mL，冰浴冷卻下滴加甲基丙烯酰氯0.386 mL，滴畢，于0 ℃避光回流反應(yīng)8 h。旋蒸除去二氯甲烷，用四氫呋喃萃取，抽濾除去三乙胺鹽，濾液于30 ℃旋蒸除去四氫呋喃(析出三乙胺鹽)，抽濾除去三乙胺鹽，濾液通15 min氬氣，置于-20 ℃冰箱保存，經(jīng)硅膠出層析[洗脫劑：V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=7 ∶1，加入體積比4‰氨水]純化得MADMAE。

1.3 pKa測(cè)試

DMAEMA、 DMAE和MADMAE在不同條件下的質(zhì)子化程度及pKa值通過(guò)酸堿滴定實(shí)驗(yàn)測(cè)得。測(cè)試方法：取 DMAEMA 30 mg溶解在5 mL去離子水中，并用0.1 mol·L-1鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)節(jié)pH至1.5，用0.1 mol·L-1NaOH標(biāo)準(zhǔn)液通過(guò)微量進(jìn)樣泵按一定間斷時(shí)間滴加到溶液中并快速攪拌。通過(guò)pH計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)隨著NaOH滴加產(chǎn)生的pH值變化并作圖得到pH滴定曲線(xiàn)。pKa值為pH滴定曲線(xiàn)上的兩個(gè)拐點(diǎn)的平均值。DMAE和MADMAE的pKa測(cè)試方法與上述方法一致，同時(shí)計(jì)算不同pH條件下物質(zhì)質(zhì)子化程度(α)。

1.4 抗菌性能測(cè)試

最小抑菌濃度(MIC)根據(jù)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)制定的標(biāo)準(zhǔn)微稀釋法測(cè)定。將測(cè)試單體溶解于腦心浸液(BHI)液體培養(yǎng)基中，使用0.2 μm過(guò)濾器濾過(guò)抗菌液備用，挑選變異鏈球菌菌落3～5個(gè)，接種于4～5 mL BHI液體培養(yǎng)基中，于37 ℃兼性厭氧環(huán)境孵育12 h，增菌后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液使用BHI液體培養(yǎng)基稀釋至0.33麥?zhǔn)蠞舛?，約為 108CFU·mL-1。將菌懸液進(jìn)行1 ∶100稀釋后備用，取96孔板，加入2倍梯度稀釋的抗菌液，每組設(shè)置3個(gè)平行組100 μL，于每孔內(nèi)加入100 μL菌液，于37 ℃兼性厭氧環(huán)境孵育24小時(shí)，以肉眼觀(guān)察藥物最低濃度無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者，即為該物質(zhì)的MIC。

2 結(jié)果與討論

2.1 表征

(1)1H NMR

1H NMR譜圖能為研究分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)提供很多的信息，將原始的信號(hào)經(jīng)過(guò)一系列的處理和傅里葉變換得到最直觀(guān)的信息就是化學(xué)位移。圖1為DMAE的1H NMR譜圖，從圖中可以看出，DMAE骨架上面的亞甲基、甲基a、 b、 c、 d、 e、 f、 g在核磁圖上分別出現(xiàn)特征峰，且通過(guò)積分得出a、 b、 c、 d、 e、 f、 g峰面積分別為0.58、 0.63、 0.68、 0.94、 0.62、 0.58、 0.96，峰面積比約為2 ∶2 ∶2∶3 ∶2 ∶2 ∶3，與實(shí)際DMAE碳鏈上碳原子所帶的氫原子比例相符合。通過(guò)核磁數(shù)據(jù)表明1-溴十二烷與N-甲氨-2羥基乙胺反應(yīng)成功合成了DMAE。

圖2為MADMAEN的1H NMR譜圖。從圖中可以看出，DMAE與甲基丙烯酰氯反應(yīng)后出現(xiàn)了雙鍵特征峰，并且通過(guò)積分得出了各個(gè)峰面積，與a、 b、 g三個(gè)碳原子所帶的氫原子比例相符合。表明形成了產(chǎn)物MADMAE合成成功。

δ圖1 DMAE的1H NMR譜圖Figure 1 1H NMR spectrum of DMAE

δ圖2 MADMAE的1H NMR譜圖Figure 2 1H NMR spectrum of MADMAE

(2) FT-IR

圖3為DMAE和MADMAE的FT-IR譜圖。由圖3可以看出，DMAE的特征峰是3 356.63 cm-1處的O—H伸縮振動(dòng)峰和1 040.07 cm-1處的C—N伸縮振動(dòng)峰；MADMAE的特征峰分別為1 722.61 cm-1處的C=O伸縮振動(dòng)峰，1 162.95 cm-1處C—O伸縮振動(dòng)峰以及1 638.78 cm-1處的C=C伸縮振動(dòng)峰，同時(shí)伴隨著3 356.63 cm-1處的O—H伸縮振動(dòng)峰消失。

ν/cm-1圖3 DMAE和MADMAE的FT-IR譜圖Figure 3 FT-IR spectra of DMAE and MADMAE

2.2 pKa測(cè)試結(jié)果

pKa是評(píng)價(jià)pH敏感材料潛在應(yīng)用一個(gè)最為重要的參數(shù)。在本文研究中，為了測(cè)定不同分子準(zhǔn)確的pKa值，我們通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)酸堿滴定實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定。如圖4a所示，隨著NaOH的滴加，DMAEMA的滴定圖中在pH=7.69和pH=8.91處有兩個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，基于這兩點(diǎn)的可知DMAEMA的pKa值為8.29。根據(jù)對(duì)應(yīng)的質(zhì)子化程度圖圖4b可以看出在pH小于6時(shí)DMAEMA基本能完全質(zhì)子化，進(jìn)而說(shuō)明在口腔的酸性pH環(huán)境下DMAEMA能完全質(zhì)子化，隨著質(zhì)子化程度的增加產(chǎn)生抗菌性。

V(NaOH)/μL

α圖4 電位計(jì)的酸堿滴定實(shí)驗(yàn)，DMAEMA的滴定曲線(xiàn)(a)和質(zhì)子化程度曲線(xiàn)(b)Figure 4 Titration curve(a) and protonation degree curve(b) of DMAEMA

圖5為DMAE的滴定曲線(xiàn)(a)和質(zhì)子化程度曲線(xiàn)(b)。由圖5a所示，DMAE滴定曲線(xiàn)在pH=6.03和pH=7.22處有兩個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，DMAE的pKa值為6.63。圖5b表明在外界環(huán)境pH低于5時(shí)，DMAE能完全質(zhì)子化，這非常符合口腔齲病環(huán)境的應(yīng)用條件。

圖6為MADMAE的滴定曲線(xiàn)(a)和質(zhì)子化程度曲線(xiàn)(b)。由圖6a可見(jiàn)，在pH=4.15和pH=4.55處存在兩個(gè)轉(zhuǎn)折點(diǎn)，基于這兩點(diǎn)得到MADMAE的pKa值為4.43。圖6b表明MADMAE質(zhì)子化程度要達(dá)到50%需要環(huán)境pH低于4.5，而完全質(zhì)子化則需要pH低于3，如此極大地限制了MADMAE在口腔環(huán)境中的應(yīng)用，也在一定程度上解釋了MADMAE缺乏抗菌性的原因。

V(NaOH)/μL

圖5 電位計(jì)的酸堿滴定實(shí)驗(yàn)，DMAE的滴定曲線(xiàn)(a)和質(zhì)子化程度曲線(xiàn)(b)Figure 5 Titration curve(a) and protonation degree curve(b) of DMAE

2.3 抗菌性能

化合物的MIC測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1所示。由表1可以看出，DMAE的抑菌濃度顯著低于DMAEMA，而MADMAE幾乎無(wú)抗菌性。原因可能是DMAE疏水長(zhǎng)鏈的引入提高了叔胺質(zhì)子化程度，從而提高了其抗菌性，而根據(jù)MADMAE的質(zhì)子化數(shù)據(jù)可以看出變異鏈球菌在pH 4.5的酸性情況下質(zhì)子化程度在50%左右，因而未體現(xiàn)出抗菌性。三種物質(zhì)都是利用叔胺質(zhì)子化達(dá)到抗菌的目的，而不同的結(jié)構(gòu)使得其質(zhì)子化程度不同從而影響抗菌效果，DMAEMA能在口腔齲病環(huán)境下完全質(zhì)子化并未體現(xiàn)出其抗菌效果而DMAE在酸性條件下體現(xiàn)出良好的質(zhì)子化效果和抗菌能力使其非常適合成為牙科粘結(jié)材料抗菌分子。

V(NaOH)/μL

圖6 電位計(jì)的酸堿滴定實(shí)驗(yàn)：MADMAE的滴定曲線(xiàn)(a)和質(zhì)子化程度曲線(xiàn)(b)Figure 6 Titration curve(a) and protonation degree curve(b) of MADMAE

表1 化合物的MIC數(shù)據(jù)Table 1 MIC data of the compounds

合成了一類(lèi)新的叔胺分子用于牙科粘結(jié)材料，利用其叔胺基團(tuán)質(zhì)子化產(chǎn)生的正電荷與細(xì)菌細(xì)胞膜負(fù)電的靜電作用，達(dá)到與季銨鹽相似的作用機(jī)理進(jìn)行殺菌。合成的DMAE既具有pH敏感性又具有良好的抗菌性，其可以在口腔齲病酸性環(huán)境下完全質(zhì)子化，同時(shí)體現(xiàn)出良好的抗菌性。DMAEMA的pKa測(cè)定和抗菌測(cè)試結(jié)果表明其質(zhì)子化程度很高但抗菌性卻很微弱。但在DMAE上引入雙鍵后的MADMAE因pKa值過(guò)低，而無(wú)法在變異鏈球菌的生長(zhǎng)環(huán)境下產(chǎn)生較高程度的質(zhì)子化，從而在抗菌實(shí)驗(yàn)中無(wú)法體現(xiàn)抗菌性。基于以上結(jié)果，DMAE在三種分子中的質(zhì)子化效果和抗菌性最佳，長(zhǎng)鏈?zhǔn)灏方Y(jié)構(gòu)物質(zhì)具有很好的pH敏感性可用于微環(huán)境的調(diào)控，但其抑菌濃度仍無(wú)法與現(xiàn)今常用的季銨鹽抗菌效果相較，還需進(jìn)一步研究。

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SynthesisandAntibacterialActivityofALongChainTertiaryAmineStructurepH-ResponsiveandAntibacterialMaterialforToothRestoration

SHANG Hui1a, XU Xin-yuan1a, LIANG Jing-ou1b, CHENG Lei1b, LI Jian-shu1a*
(a. State Key Laboratory of Polymer Materials Engineering, College of Polymer Science and Engineering; b. State Key Laboratory of Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, 1. Sichuan University, Chengdu 610065, China)

Dental adhesives are often used for bonding composite resin and dentin or enamel. Nowadays, dental adhesives have achieved strong adhesion stress and easier operation. Nevertheless, the restorative adhesives can not provide long-term efficacy because residual bacteria can cause secondary caries. All current dental adhesives can not resist bacterial growth. In this paper, a long chain tertiary amine structure pH-responsive and antibacterial material based on methylacrylic acid ester was synthesized by two steps reaction and the pure product was obtainedviacolumn chromatography. The structure was characterized by1H NMR and IR. The antibacterial activity was investigated. The results showed that it can maintain oral acid-base balance and avoid bacterial growth through its antibacterial effect.

tertiary amine; synthesis; pH-responsive; antibacterial activity; tooth restoration

2017-03-21;

2017-09-29

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFC1100404)； 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51573110)

商惠(1990-)，女，漢族，山東菏澤人，碩士研究生，主要從事生物醫(yī)用高分子材料的研究。 E-mail: huishanggz@163.com

李建樹(shù)，教授， Tel. 028-85466755， E-mail: jianshu_li@scu.edu.cn

TB324

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.11.17063