桑黃多糖對Ⅰ型糖尿病小鼠模型的影響

史得君， 崔清美， 齊 欣， 崔承弼*， 陳兆雙

(1.延邊大學(xué)長白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實驗室；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院:吉林 延吉 133002；3.長白山科學(xué)研究院，吉林 安圖 133600)

桑黃多糖對Ⅰ型糖尿病小鼠模型的影響

史得君1,2， 崔清美2， 齊 欣2， 崔承弼1,2*， 陳兆雙3*

(1.延邊大學(xué)長白山生物資源與功能分子教育部重點(diǎn)實驗室；2.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院:吉林 延吉 133002；3.長白山科學(xué)研究院，吉林 安圖 133600)

為確定桑黃多糖對Ⅰ型糖尿病小鼠模型的影響，以鏈脲佐菌素(STZ)建模的I型糖尿病(DM)昆明種(KM)小鼠為研究對象，探究了不同劑量桑黃多糖(低劑量20 mg/kg·BW，中劑量40 mg/kg·BW，高劑量80 mg/kg·BW)對其影響。結(jié)果表明：STZ造模的KM小鼠糖尿病模型癥狀有所改善，具體表現(xiàn)為，試驗第3周時，高劑量組小鼠均重達(dá)到36.17 g顯著高于糖尿病模型組(P<0.05)，增長了17.89%，更接近空白組，據(jù)觀察，飲水量亦有所下降；且高劑量組小鼠血糖值顯著低于糖尿病組(P<0.05)，下降了23.96%。同時，試驗?zāi)┢诟邉┝拷M葡萄糖耐量(OGTT)與糖尿病組相比顯著改善(P<0.05)，提升了31.02%；而對于臟器指數(shù)，高劑量組肝臟指數(shù)顯著高于糖尿病組(P<0.05)，提升了55.03%，而腎臟指數(shù)高、中、低劑量組間無顯著性差異，但均顯著高于糖尿病組(P<0.05)。因此,高劑量桑黃多糖提取物有助于I型糖尿病模型鼠的癥狀改善。

桑黃；桑黃多糖；Ⅰ型糖尿??；降血糖；臟器系數(shù)

桑黃(Phellinussigniarius)別名又稱桑臣、桑耳[1]，屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、多孔菌目、多孔菌科、針層菌屬。多見于楊、松、桑、白樺、杜鵑等樹上，會造成樹芯白腐。近年來，有關(guān)桑黃藥理活性的研究已經(jīng)引起很多國內(nèi)外保健品行業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)專家的廣泛關(guān)注，甚至在東亞的部分國家桑黃制品已經(jīng)獲準(zhǔn)進(jìn)入市場，并擁有可觀的前景。目前國內(nèi)外對于桑黃藥理活性的研究多集中在抑制腫瘤細(xì)胞生長和調(diào)節(jié)免疫能力方面，而對桑黃的其他特性，如抗菌、降血糖、抗突變等作用少有報道[2]。

隨著我國人民生活水平提高、勞動強(qiáng)度減少以及生活方式的改變，糖尿病發(fā)病狀況愈演愈烈，現(xiàn)已成為全球3大慢性非傳染疾病之一。我國是全球糖尿病患者人數(shù)最多的國家，2013年國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國20～79歲的糖尿病患者為0.98億[3]，預(yù)計到2035年該數(shù)據(jù)將增至1.43億[4]。在我國，糖尿病已成為多發(fā)病和常見病，其患病率高達(dá)9.7%，尤其是40歲以上的中、老年人更高，并有明顯上升趨勢，且官方數(shù)據(jù)顯示到2025年，全球糖尿病發(fā)病人群將高達(dá)3.33億人次[5]。鑒于糖尿病的嚴(yán)重性，亟需對人體無負(fù)擔(dān)且能防止高血糖的天然保健食品，而能夠達(dá)到這些要求的首選無疑是更易被接受且毒副作用更小的天然提取物中的降糖成分。因此，受中國中草藥的啟發(fā)，近年來世界范圍內(nèi)越來越多的專家學(xué)者開始研究各種植物及菌體中的天然降糖物質(zhì)[6-7]，如降血糖類的苦蕎保健飲料及保健品膠囊等產(chǎn)品[8-9]。對于歷史悠久的桑黃，雖然也有著良好的降血糖作用，但相關(guān)研究還較少。

本研究為了驗證桑黃多糖對I型糖尿病小鼠模型的作用，采用不同劑量的桑黃多糖提取物為試驗受試物，對鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)造模的 Ⅰ 型糖尿病小鼠進(jìn)行灌胃試驗，研究其降血糖及改善臟器指數(shù)等效果，為桑黃多糖的利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗動物及飼養(yǎng)條件

KM種小鼠：25只，SPF級，體重20±2 g左右，雄性；動物飼養(yǎng)于定時交換空氣(6次/h)、恒溫(20～25 ℃)、定時適當(dāng)亮度的照明(7:00-19:00)、相對濕度55%～65%的延邊大學(xué)吉林省朝鮮族公共食品研發(fā)中心動物實驗室,適應(yīng)7 d。期間小鼠自由攝食、飲水。

1.2試驗試劑

桑黃粉末：2015年長白山楊樹桑黃(粉碎、過40目篩)，長白山科學(xué)研究院提供；鏈脲佐菌素(購自Sigma公司，純度≥98.0%)等。

1.3方法

1.3.1 造模劑(STZ溶液)配制

1) 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液 A液：取檸檬酸(FW:210.14) 0.21 g溶于10 mL雙蒸水；B液：取檸檬酸鈉(FW:294.10) 0.294 g溶于10 mL雙蒸水。A、B液按1∶1混合，調(diào)節(jié)pH值至4.3～4.4。

2) 鏈脲佐菌素配制液 以檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液溶解STZ，注射劑量為100 mg/kg·BW，并在30 min內(nèi)完成注射。

1.3.2 桑黃多糖提取

采用參考文獻(xiàn)[10]及前期試驗優(yōu)化的提取方法提取桑黃多糖，即桑黃粉末按1∶18料液比，90 ℃，水提8 h，濾渣重復(fù)提取1次，收集并合并提取液，真空濃縮濾液至原體積1/5，然后加入3倍體積的無水乙醇，于冰箱中靜置24 h，之后5 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀用75%乙醇洗滌3次，合并沉淀，60 ℃真空干燥成桑黃多糖，多糖得率2.15%，多糖含量以葡聚糖計量為20%左右。

1.3.3 I型糖尿病小鼠建模及分組

適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后的雄性KM小鼠隨機(jī)選取25只，禁食12～16 h，隨機(jī)選取5只為空白組，腹腔注射1.3.1(1)中緩沖溶液，剩余20只按照劑量腹腔注射STZ，注射4 h后灌胃5%葡萄糖溶液度過低血糖期后喂食，7 d后，測定小鼠空腹血糖值，建立I型糖尿病模型(以禁食12 h，空腹血糖大于200 mg/dL或隨機(jī)血糖值大于300 mg/dL為準(zhǔn))。

隨后將小鼠按體重隨機(jī)分為4組：糖尿病組、高劑量組(桑黃多糖80 mg/kg·BW)、中劑量組(桑黃多糖40 mg/kg·BW)、低劑量組(桑黃多糖20 mg/kg·BW)；除空白對照組、糖尿病組以蒸餾水灌胃外，治療組分別以高、中、低劑量桑黃多糖溶液連續(xù)灌胃3周。

1.3.4 小鼠體重及空腹血糖的測定

試驗過程中每天觀察并記錄小鼠進(jìn)食量、飲水量的變化，每周間隔3 d測定小鼠體重和空腹(禁食6 h)血糖[11]。

1.3.5 口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)

試驗第3周末，以劑量75 mg/kg·BW 1次性經(jīng)口給予小鼠葡萄糖，20 min后尾靜脈采血測定給葡萄糖后0、30、60、90和120 min的血糖值[12]。

1.3.6 臟器系數(shù)

試驗后小鼠脫頸處死，取其腎、脾、肝、心臟并測濕重。

1.3.7 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計分析采用SPSS Statistics 19.0進(jìn)行單一因素試驗的多重比較，結(jié)果以X±S表示。以P<0.05為差異性顯著；P>0.05為差異性不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1桑黃多糖對Ⅰ型糖尿病小鼠身體狀態(tài)的影響

經(jīng)過3周的喂養(yǎng)，桑黃多糖的高、中、低劑量組小鼠的毛發(fā)相對于糖尿病組的小鼠而言恢復(fù)順滑體型、重新變得豐滿，多飲多尿的現(xiàn)象也相對減輕。解剖后觀察內(nèi)臟，發(fā)現(xiàn)糖尿病組小鼠內(nèi)臟周圍存在脂肪，而桑黃多糖高、中、低劑量組小鼠內(nèi)臟略鮮亮，且3個劑量組中，高劑量組內(nèi)臟狀態(tài)更接近空白組，中低劑量組有不同程度差異，低劑量組內(nèi)臟狀態(tài)最次，僅稍優(yōu)于糖尿病組。說明桑黃多糖可以降低糖尿病小鼠的體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，利于脂肪代謝，同時提升攝食的利用率，降低糖異生作用。表明桑黃多糖對I型糖尿病小鼠身體狀態(tài)的緩解起到了良好的作用。

2.2桑黃多糖對Ⅰ型糖尿病小鼠體重的影響

由表1可知，空白組小鼠體重隨著試驗時間的增加一直呈現(xiàn)遞增趨勢，而造模組小鼠體重在造模前后體重未增加或輕微增加且同時期體重較空白組均顯著降低(P<0.05)，對于造模后各組小鼠體重除空白組外彼此存在一定差異的原因可能是在進(jìn)行腹腔注射時由于STZ溶液易快速分解而注射順序的先后導(dǎo)致了小鼠體內(nèi)有效STZ含量的輕微差異。在試驗的后2周，空白組小鼠體重顯著高于糖尿病組及桑黃多糖治療組小鼠(P<0.05)，且在第2周時，各組小鼠體重均存在顯著性差異，呈現(xiàn)空白組>高劑量組>中劑量組>低劑量組>糖尿病組的特點(diǎn)，而隨著試驗進(jìn)行到第3周時，高劑量組體重顯著高于低劑量組(P<0.05)，且中劑量組介于高劑量組與低劑量組之間，雖然高劑量組體重與空白組差異顯著，但較中、低劑量組更接近空白組。證明高劑量桑黃多糖能夠很好地恢復(fù)糖尿病小鼠體重減輕的情況，表明桑黃多糖具有促進(jìn)糖尿病小鼠體重恢復(fù)的作用。

表1 桑黃多糖對糖尿病小鼠體重的影響

注：同一列凡有相同字母的即為差異不顯著，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.3桑黃多糖對Ⅰ型糖尿病小鼠空腹血糖值的影響

由表2可知,造模成功的Ⅰ型糖尿病小鼠，其自身胰島功能受損，胰島素分泌不足，且伴隨胰島素抵抗，使自身對胰島素利用不敏感。試驗初期，5組小鼠的血糖均正常，而造模成功之后，模型組小鼠的血糖顯著高于空白組(P<0.05)，均大于200 mg/dL,但無顯著性差異，且由于沒有給予糖尿病組小鼠任何降血糖的措施，其血糖在試驗期一直呈現(xiàn)出上升的趨勢，而3個治療組小鼠血糖在灌胃桑黃多糖之后有下降趨勢，且第3周時中、高劑量組血糖值顯著低于低劑量組(P<0.05)，說明桑黃多糖有利于糖尿病小鼠血糖的恢復(fù)且存在劑量效應(yīng)關(guān)系，其中,高劑量組最明顯。

2.4桑黃多糖對Ⅰ型糖尿病小鼠OGTT的影響

對于健康機(jī)體而言，給糖后，0～30 min血糖濃度迅速上升，隨后開始下降并恢復(fù)至空腹水平。如果服食糖后90 min其血糖值未恢復(fù)到正常水平，尿糖陽性，說明糖耐量降低。

桑黃多糖灌胃3周后的OGTT結(jié)果如表3所示。開始(0 min)時空白組小鼠血糖值與糖尿病組有顯著性差異(P<0.05)；隨著時間推移，在30、60和90 min時，桑黃多糖提取物低劑量組與高劑量組相比存在顯著性差異，且3個不同劑量桑黃多糖治療組均顯著低于糖尿病組(P<0.05)，最終在120 min時，桑黃多糖高劑量組血糖值降低到200 mg/dL以下，顯著低于糖尿病及中、低劑量治療組，表明桑黃多糖對STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病小鼠耐糖性有一定恢復(fù)作用。

2.5桑黃多糖對Ⅰ型糖尿病小鼠臟器系數(shù)的影響

桑黃多糖灌胃3周后臟器占體重的比例如表4所示。糖尿病治療組小鼠脾臟、心臟的濕量與糖尿病組相比無顯著差異。但是可以看出，中、高劑量治療組肝臟臟器系數(shù)顯著高于糖尿病組(P<0.05)，同時治療組的腎臟臟器系數(shù)顯著高于糖尿病組(P<0.05)，證明桑黃多糖能夠顯著改善I型糖尿病小鼠的肝臟及腎臟損傷,對于糖尿病引起的內(nèi)臟損傷具有保護(hù)作用。

(g/100 g·BW)

3 討論與結(jié)論

糖尿病最常見的幾種癥狀中，“三多一少”是基礎(chǔ)表現(xiàn)，其原因為葡萄糖氧化障礙，致使機(jī)體供能不足，導(dǎo)致饑餓多食；然后引發(fā)血糖升高，血糖值超過腎糖閾時發(fā)生尿糖，糖隨尿液的大量排出引起多尿；多尿引起失水過多，血液濃度升高而口渴，最終多飲成為一個死循環(huán)。而與此同時，葡萄糖氧化障礙會大量動員體內(nèi)脂肪及蛋白質(zhì)，增大能量消耗，身體逐漸消瘦，體重減輕[13]。I型糖尿病人體內(nèi)胰島素絕對不足，不能充分利用葡萄糖，需要外源補(bǔ)充胰島素，因此,機(jī)體就更需要能源物質(zhì)來供應(yīng)能量及熱量，這樣一來蛋白分解增強(qiáng)，體內(nèi)環(huán)境呈負(fù)氮平衡，體重愈加消瘦，而II型糖尿病機(jī)體胰島素相對不足通常會伴隨肥胖，臨床首選用藥二甲雙胍可以通過促進(jìn)機(jī)體糖的無氧酵解和降低組織糖異生作用來緩解相關(guān)癥狀[14]。

除了以上外在表現(xiàn)外，糖尿病患者均較正常人群血糖值偏高，并且由于日益嚴(yán)重的患病形勢，與糖尿病緊密相關(guān)的代謝機(jī)制也越來越多的被闡明，其中較為主流的降血糖機(jī)制包括5種：1) 通過增加機(jī)體內(nèi)胰島素受體(InsR)表達(dá)而提升其含量或提升機(jī)體胰島素受體(InsR)親和力以增強(qiáng)胰島素的利用和其能力的發(fā)揮以降低高血糖；2) 通過調(diào)節(jié)糖代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性，例如葡萄糖激酶等以增強(qiáng)葡萄糖的氧化分解從而降低體內(nèi)血糖濃度；3) 通過增強(qiáng)機(jī)體或組織的抗氧化能力，避免胰島組織中胰島B細(xì)胞因氧化應(yīng)激損傷，保證胰島素的正常分泌而維持機(jī)體降血糖功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)；4) 通過抑制胰島B細(xì)胞的凋亡，增加機(jī)體胰島B細(xì)胞的數(shù)量同時延長胰島B細(xì)胞分泌胰島素的功能而發(fā)揮降血糖作用，改善高血糖癥狀[15]；5) 通過拮抗腎上腺素、胰高血糖素等升血糖激素的作用，使降血糖作用大于升血糖作用，實現(xiàn)降低機(jī)體血糖。

研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病會引起機(jī)體糖代謝關(guān)鍵酶的紊亂從而引發(fā)自由基過剩和氧化應(yīng)激反應(yīng)，基本表現(xiàn)為非酒精性脂肪肝，甚至器官損傷[16]，據(jù)統(tǒng)計，大概50%的糖尿病患者會發(fā)生脂肪肝，特別是40～50歲的糖尿病人群更甚。而桑黃多糖可以從調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)關(guān)鍵酶的活性和清除機(jī)體過剩自由基或降低氧化應(yīng)激2條途徑來發(fā)揮降血糖作用。但也有研究發(fā)現(xiàn)[17]，桑黃可以通過促進(jìn)胰島B細(xì)胞分泌胰島素，降低胰島素抵抗以及提升肝臟和肌肉對葡萄糖利用，來降低機(jī)體血糖值[18]，具體機(jī)制可能是：1) 提升參與胰島素降糖作用的過氧化物酶增殖激活受體-γ(PPAR-γ)的表達(dá)量，降低機(jī)體的胰島素抵抗作用[19]，或者顯著激活過氧化物酶增殖激活受體-γ(PPAR-γ)的表達(dá)[20]；2) 促進(jìn)血糖轉(zhuǎn)化為肝糖原增強(qiáng)肌肉對糖的利用而降低空腹血糖水平從而起到降血糖的效果，或者通過降低丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的活性從而提升肝臟的功能來降血糖[21]。趙蕊針對糖尿病腎病的研究發(fā)現(xiàn)枸杞多糖能夠上調(diào)II型糖尿病小鼠腎臟組織中PPAR-γ蛋白含量的表達(dá)，從而起到保護(hù)腎臟的作用[22]，從以上一系列不同研究中可以看出,桑黃多糖可以通過包括調(diào)節(jié)糖代謝關(guān)鍵酶的活性，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力加強(qiáng)相關(guān)基因的表達(dá)提升相關(guān)組織中蛋白表達(dá)等多條途徑來實現(xiàn)降低體內(nèi)血糖同時保護(hù)臟器組織的目的。

試驗結(jié)果表明:桑黃多糖可以緩解鏈脲佐菌素(STZ)造模的Ⅰ型糖尿病小鼠的癥狀，具體表現(xiàn)為,恢復(fù)期體重增長同時減少其攝食及飲水量緩解“三多一少”的癥狀，一定程度上緩和糖尿病小鼠血糖增高的趨勢，且一定劑量的桑黃多糖可以顯著降低糖尿病小鼠血糖值，同時提升糖尿病小鼠的耐糖性，而由臟器指數(shù)的測量可知桑黃多糖對肝臟糖代謝、脂肪代謝及腎臟功能有改善作用。綜合而言，桑黃多糖顯示出了針對I型糖尿病的輔助治療能力，為天然提取物在降血糖治療糖尿病的利用提供了理論依據(jù)，同時揭示了桑黃在降糖護(hù)肝保腎功能性食品的廣闊應(yīng)用前景。

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EffectofPhellinusigniariuspolysaccharideontypeⅠdiabetesmicemodel

SHI Dejun1,2， CUI Qingmei2， QI Xin2， CUI Chengbi1,2*， CHEN Zhaoshuang3*

(1.KeyLaboratoryofNaturalResourceofChangbaiMountainandFunctionalMolecular,MinistryofEducation,YanbianUniversity,YanjiJilin133002,China;2.JilinKoreanFoodIndustry,PublicR&DCenter,YanjiJilin133002,China;3.ChangbaiMountainScienceResearchInstitute,AntuJilin133600,China)

In order to determine the effect ofPhellinusigniariuspolysaccharide on type 1 diabetes mellitus (DM) mice model,P.igniariusfrom Poplar was obtained andP.igniariuspolysaccharide was extract by water, then Kunming (KM) mice were made as type 1 DM animal model by streptozotocin at a single dose of 100 mg/kg·BW, which were used to investigate the effect ofP.igniariuspolysaccharide of different doses (Low dose 20 mg/kg·BW, middle dose 40 mg/kg·BW, high dose 80 mg/kg·BW) . The results showed that the symptoms of type 1 DM mice had improved. Specifically, at the 3rd week of the experiment, the mean weight of mice in high dose group was 36.17 g, significantly higher than that of the DM group (P<0.05), and increased by 17.89%, which was close to that in control group and water intake was also declined; and fast blood glucose level of high dose group was significantly lower than that of the DM group (P<0.05), and decreased by 23.96%; meanwhile the OGTT in high dose group was significantly higher than that of the DM group(P<0.05), and increased by 31.02%. As for the organ coefficient, the liver index of high dose group was significantly higher than that of the DM group(P<0.05), which increased by 55.03 %, and there was no significant difference between the three dose groups in kidney index but they were all significantly higher than the DM group (P<0.05). All the results above taken together showed that the high dose ofP.igniariuspolysaccharide extract contributes so much to the improvement of symptoms in type 1 DM mice.

Phellinusigniarius;Phellinusigniariuspolysaccharide; type Ⅰ diabetes; hypoglycemic; organ coefficient

2017-07-09

中央財政廳林業(yè)科技推廣示范項目[吉推(2014)11號]

史得君(1992—)，男，河北張家口人，在讀碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全性評價。崔承弼，陳兆雙為共同通

信作者，E-mail:danielloueyd@qq.com

1004-7999(2017)03-0033-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.03.006

R285.5

A