新、陳大蒜提取物抑菌活性的研究

孟君，彭秀麗，莊勤，羅立強

(1.鄭州輕工業(yè)學院 食品與生物工程學院，鄭州 450002；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450002；3.鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學院 藥學系，鄭州 451460；4.上海大學 化學系，上海 200444)

新、陳大蒜提取物抑菌活性的研究

孟君1，2，彭秀麗3，莊勤1，羅立強4

(1.鄭州輕工業(yè)學院 食品與生物工程學院，鄭州 450002；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450002；3.鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學院 藥學系，鄭州 451460；4.上海大學 化學系，上海 200444)

以新鮮、陳2種大蒜為材料，95%乙醇為提取劑，浸提大蒜研磨液，以3種常見細菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌為供試菌，用牛津杯法比較大蒜提取液對3種常見細菌的抑菌活性。結(jié)果表明：2種大蒜提取液對3種菌的生長均有較好的抑制作用，但抑制作用不同，2種浸提液抑制效果依次是：金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>枯草芽孢桿菌，新鮮大蒜提取物的抑菌效果更佳。采用氣相色譜-質(zhì)譜分析大蒜提取物的揮發(fā)性主要化學成分，分析結(jié)果表明新鮮大蒜提取液中的主要揮發(fā)性有機成分有46種；陳大蒜提取液中的主要揮發(fā)性有機成分有54種。其中2種大蒜提取物的主要抑菌活性成分，含硫的化合物二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚的相對含量，在新大蒜中分別為5.336%，0.541%，在陳大蒜中分別為4.126%， 0.791%。

大蒜；大蒜提取物；牛津杯法；抑菌活性；化學成分

大蒜(Alliumsatium)是百合科蔥屬多年生草本植物，在亞洲許多國家及其他地區(qū)是一種常用的烹飪調(diào)味品及健康食品，在我國種植面積廣泛[1,2]。其味道辛辣，能助消化，增加食欲，對預防疾病有很好的作用。大蒜具有多種功能，對不同的病毒、細菌、真菌等病原微生物有很大程度的抑制消滅作用，同時能預防及抑制癌癥腫瘤的生長，被廣泛地稱為“天然抗生素”[3-5]。大蒜中富含多種營養(yǎng)成分和有效的生物活性成分，大蒜提取物是大蒜重要的生物活性物質(zhì)，揮發(fā)性含硫化合物是其主要生物活性成分[6,7]，其中二烯丙基三硫化物和二烯丙基二硫化物含量最豐富，具有強烈的抗菌消炎作用[8-10]。在回歸自然、天然綠色的國際食品潮流中，研究無副作用、對生活中常見細菌生長的抑制作用、探討作用與成分的內(nèi)在關(guān)系，具有十分重要的意義。本研究以剛采收的新鮮大蒜和陳大蒜為材料，以95%乙醇為提取劑，浸提2種大蒜研磨液提取大蒜成分，并對提取液的成分進行了活性和成分分析，為進一步分離大蒜有效揮發(fā)活性成分和開發(fā)天然高效的抑菌物質(zhì)研究提供參考依據(jù)。

1 實驗材料與儀器

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

新鮮大蒜和陳蒜：購于鄭州市農(nóng)貿(mào)市場；

標準菌株：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌，由鄭州輕工業(yè)學院食工學院實驗室提供。

1.1.2 主要試劑

無水乙醇、無水硫酸鈉、氫氧化鈉、氯化鈉均為分析純；吐溫80(CP)；酵母浸粉、牛肉浸膏、蛋白胨、瓊脂均為生物試劑。

1.2 主要儀器

DHG-9145A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；LX-C35高壓蒸汽滅菌鍋 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；SW-CJ-IFD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；SHP-250智能生化培養(yǎng)箱 上海鴻都電子科技有限公司；JY1001電子天平 上海浦春計量儀器有限公司；GC6890-5973MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有G1701MSD化學工作站、全自動進樣器和Nist 11標準譜庫) 美國安捷倫科技有限公司；TD5A-WS臺式離心機 湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大蒜成分提取

新鮮大蒜和陳蒜去皮，洗凈晾干，分別稱50 g新鮮蒜和陳蒜，室溫下自然酶解0.5 h后，加入95%的酒精200 mL，室溫狀態(tài)下萃取2 h，以3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液于燒杯中，轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的圓底燒瓶中，控制溫度在50 ℃，轉(zhuǎn)速50 r/min，進行濃縮得濃縮的大蒜素原液(濃度為1 g/mL)，用微孔濾膜過濾，過濾后的原液放于滅過菌的離心管中，用報紙包著避光，置于4 ℃冰箱條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 菌懸液制備

將3種標準菌株：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌用平板劃線法無菌操作接種到瓊脂平板上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，得到活化的菌落，取適量菌落放于盛有無菌水的試管中，振蕩均勻得菌懸液，在無菌條件下，將菌懸液的濃度控制在10-6，10-8cfu/mL，制備好的細菌懸浮液密封，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 含菌平板的制備

無菌環(huán)境下，用移液槍分別吸取上述制備的3種標準菌株菌懸液各0.2 mL于滅菌的直徑9 cm培養(yǎng)皿中，將滅菌好的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基放置至溫度約為50 ℃，分別倒入無菌的培養(yǎng)皿內(nèi)(每皿約15 mL )，輕輕晃動使其混合均勻，平面上冷卻凝固后進行抑菌試驗。

1.3.4 抑菌效果試驗

采用牛津杯法，將提前滅好菌的牛津杯，用無菌鑷子夾取，輕輕均勻垂直地放于凝固含菌培養(yǎng)基上，每個平板內(nèi)等距離放2個牛津杯，分別加入0.15 mL提取的新舊大蒜素原液，同時用95%的乙醇溶液作對照液的試驗，依次將做好標記的各培養(yǎng)皿，輕輕置于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃)中培養(yǎng)24 h。移動過程中保持牛津杯位置不變，里面的大蒜原液不能外濺流出，平行3皿，重復試驗3次，結(jié)果取各次測定平均值。

1.3.5 抑菌條件的選擇

1.3.5.1 大蒜濃度對抑菌作用的影響

分別取3 mL 2種大蒜原液于滅過菌的干凈試管中，采用二倍稀釋法，將10%(體積分數(shù))的吐溫80 進行梯度稀釋，制成濃度為 1∶1，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64系列的稀釋液，分別加入0.15 mL系列濃度的大蒜提取液與制備的3種細菌平板上，依次做好標記，各培養(yǎng)皿輕輕置于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃)培養(yǎng)24 h。移動過程中保持牛津杯位置不變，里面的大蒜原液不能外濺流出，平行3皿，重復試驗3次，取平均值作為測定結(jié)果。

1.3.5.2 溫度對大蒜抑菌作用的影響

分別取3 mL 2種大蒜素原液分裝在5個無菌試管中，水浴鍋的溫度調(diào)為15，30，45，60，75，90 ℃，將試管放入，1 h后進行抑菌效果試驗，將提前滅好菌的牛津杯用無菌鑷子夾取，輕輕均勻垂直地放于凝固含菌培養(yǎng)基上，每個平板內(nèi)等距離放2個牛津杯，分別加入0.15 mL經(jīng)過相同溫度處理的2種新舊大蒜素原液，操作同上。

1.3.5.3 pH對大蒜抑菌作用的影響

分別取3 mL 2種大蒜素原液于5個無菌試管中，分別將其pH值調(diào)到4.0，5.0，6.0，7.0，8.0后，靜置平衡10 h之后，進行大蒜的抑菌效果試驗，分別加入0.15 mL經(jīng)過相同pH處理的2種新舊大蒜素原液，培養(yǎng)操作同上，做好標記，取平均值作為測定結(jié)果。

1.3.5.4 最佳條件實驗

綜合上述各條件下的抑菌結(jié)果，得出2種大蒜素原液的最佳抑菌條件，在最佳條件下進行大蒜的抑菌活性實驗，從而得出最佳條件下2種大蒜對3種菌的抑菌活性大小。

1.3.6 大蒜液GC-MS分析

取適量上述制備的2種大蒜提取液，分別放于試管中，加入適量的無水硫酸鈉，放置過夜后，以無水硫酸鈉不結(jié)塊為宜，過濾，取適量干燥過濾后的大蒜液，用GC-MS分析大蒜素原液中揮發(fā)性的有機成分。

1.3.6.1 GC條件

柱子類型：HP-5MS(60 m×250 μm,0.25 μm)；升溫程序：50 ℃保持3 min，以4 ℃/min升至280 ℃，保持10 min；進樣口溫度260 ℃；載氣為高純(99.99%)氦氣；柱流速1.0 mL/min，傳輸線溫度270 ℃；分流比5∶1；進樣體積1 μL；溶劑延遲時間6 min。

1.3.6.2 MS條件

用電子轟擊(EI)源分析，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度280 ℃，選用全掃描(SCAN)模式，質(zhì)量掃描范圍35～550 amu，對采集到的質(zhì)譜圖利用Nist 11譜庫進行檢索。

2 結(jié)果與討論

2.1 2種大蒜提取物對3種菌的抑制作用

2種大蒜提取物對3種菌的抑制作用的平板實驗結(jié)果見圖1～圖3。

圖1 兩種大蒜提取液對大腸桿菌的抑菌作用

注：左為新鮮大蒜，右為陳大蒜。

圖2 兩種大蒜提取液對枯草芽孢桿菌的抑菌作用

注：左為新鮮大蒜，右為陳大蒜。

圖3 兩種大蒜提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

注：左為新鮮大蒜，右為陳大蒜。

2.1.1 牛津杯法測定2種大蒜提取液抑菌效果

采用牛津杯法測定2種大蒜提取液對3種菌的抑菌效果，見表1。

表1 大蒜提取液的抑菌活性 cm

由表1抑菌圈的直徑大小可知，同種條件下，新鮮大蒜提取液對3種試驗細菌的抑菌效果明顯好于陳大蒜提取液對3種試驗細菌的抑菌效果對照加入95%乙醇無抑菌圈出現(xiàn)。2種大蒜提取液對3種菌的抑制大小依次是：金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>枯草芽孢桿菌。

2.1.2 新陳2種大蒜提取液濃度對抑菌作用的影響

表2 大蒜提取液的最小抑菌濃度(MIC) mg/mL

由表2可知，新鮮大蒜提取液對3種供試菌的抑菌作用不同，最小抑菌濃度分別為：金黃色葡萄球菌7.813 mg/mL、大腸桿菌15.625 mg/mL、枯草芽孢桿菌31.250 mg/mL，而陳大蒜對3種菌的抑制作用相同，3種細菌的最小抑菌濃度均為15.625 mg/mL。

2.1.3 溫度對抑菌效果的影響

表3 溫度改變對新鮮大蒜的抑菌效果(cm)

由表3可知，新陳2種大蒜提取液對3種細菌的抑菌效果受溫度的影響， 在30 ℃時，3種菌的抑菌圈直徑最大，隨著溫度的升高，抑菌圈直徑變小，當溫度達到90 ℃時，抑菌圈直徑明顯減小，實驗結(jié)果表明隨溫度的升高，大蒜抑菌效果減弱。

2.1.4 pH對新舊大蒜的抑菌效果

表4 pH改變對新陳大蒜的抑菌效果(cm)

由表4可知，pH在4～7之間的抑菌圈直徑變化不大，2種大蒜提取液的pH為6時，3種菌的抑制效果都最好。當pH>7時，抑菌圈明顯減小，說明大蒜提取液在酸性條件下對3種試驗菌的抑制作用較好。

2.2 2種大蒜成分分析

對新鮮大蒜和陳大蒜樣品乙醇提取液在1.3.6選定的測定條件下進行分析，總離子流圖分別見圖4和圖5。根據(jù)峰面積大小，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，初步分離檢測出新鮮大蒜中46種主要成分，見表5；按峰面積大小，初步分離陳大蒜中54種主要成分，見表6。

圖4 新鮮大蒜的離子流圖

圖5 陳大蒜的離子流圖

序號保留時間(min)百分比比配度化合物18．2460．1390吡啶210．9690．229932?甲基吡啶311．3180．357802?甲基吡嗪411．8052．81987呋喃甲醛512．9122．40194糠醇613．2140．74264二烯丙基硫醚713．4630．327914?甲基吡啶814．4750．192644?環(huán)戊烯?1，3?二酮915．9920．511642，6?二甲基吡嗪1016．1040．499383，4?二氫?2H?吡喃1216．70．563641，2?環(huán)戊二酮1317．7950．368431，3?二噻烷1418．390．315915?甲基?2?呋喃甲醇1518．7190．202943?乙基吡啶1619．021．32945?甲基呋喃醛1719．7590．41883二甲基三硫1823．9641．444942?苯基乙醛1924．3541．908784?羥基?2，5?二甲基?3(2H)呋喃酮2024．7990．205722?呋喃甲酸

續(xù) 表

注：*在本表中顯示的是比配度大于38的數(shù)據(jù)。

由表5可知，新鮮大蒜提取液的化學成分種類豐富，主要含有酮、醛、酸、酯、烯、烷、醚等，相對含量最高的是5-羥甲基糠醛，百分比為8.585%；其次為主要抑菌成分二烯丙基二硫醚，百分比為5.336%，起抑菌作用的二烯丙基三硫醚，百分比為0.541%。

表6 陳大蒜提取物中主要揮發(fā)性成分及相對含量

續(xù) 表

注：*在本表中顯示的是比配度大于38的數(shù)據(jù)。

由表6可知，陳大蒜的成分比新鮮大蒜的成分還要復雜，鑒定出的主要化學成分達54種，分別是酮、醛、酸、酯、烯、烷、醚等，含量最高的也是5-羥甲基糠醛，相對百分比含量為12.443%，較新鮮大蒜高3.858%；其次為3-乙烯基-1,2-二硫環(huán)己-4-烯，百分比為5.101%，與新鮮大蒜相當；主要抑菌成分：二烯丙基二硫醚，相對含量為4.126%，比新鮮大蒜低1.210%，二烯丙基三硫醚的百分含量為0.791%。

3 結(jié)論

本文研究了2種大蒜提取液對3種常見細菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌作用，結(jié)果表明、大蒜提取液對3種試驗菌都有較好的抑菌效果，新、陳大蒜對金黃色葡萄球菌的生長抑制作用相對較好，對枯草芽孢桿菌的生長抑制相對較弱，其中新鮮大蒜提取液抑菌效果更佳。

2種大蒜提取液，大蒜的抑菌效果，隨溫度的改變抑菌效果有明顯改變，溫度升高，抑菌效果逐漸減弱，溫度在30℃的抑菌效果最佳，當溫度達到90℃時，抑菌效果明顯小于30℃的抑菌效果。這與劉天貴[11]的觀點大蒜經(jīng)高溫(100～121℃)處理后，蒜素會受熱分解，從而失去其原本的殺菌作用結(jié)果相符，所以大蒜盡量生吃，才能更好地發(fā)揮它的作用。

2種大蒜提取液的抑菌活性，受pH值影響， pH在4～7的抑菌圈直徑變化不大， 在pH為6時，抑制效果最好，說明在酸性條件下，大蒜提取液對3種試驗菌有較好的抑制作用。

通過GC-MS分析，大蒜乙醇萃取物中，種類豐富，化學成分復雜，主要的揮發(fā)性化學成分，新鮮大蒜提取物中有46種，陳大蒜提取物中有54種，其中含有較為豐富的抑制各種細菌及其他微生物生長的有效成分的含硫化合物，二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚，比較2種大蒜成分的相對含量可知，新大蒜中含硫化合物的百分含量較陳大蒜的高，這與所做試驗的抑菌效果結(jié)果相符。

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ResearchonBacteriostaticActivityofFreshandAgedGarlicExtract

MENG Jun1, PENG Xiu-li3, ZHUANG Qin1, LUO Li-qiang4

(1.School of Food and Bioengineering,Zhengzhou University of Light Industry,Zhengzhou 450002, China；2.Collaborative Innovation Center of Food Production and Safety,Henan Province,Zhengzhou 450002, China；3.Depatment of Phamacy,Zhengzhou Railway Vocational & Technical College,Zhengzhou 451460, China;4.Department of Chemistry,Shanghai University, Shanghai 200444, China)

Select fresh and aged garlics as raw materials,use 95% ethanol as extractant，extracting grinding fluid of garlic,different ethanol extracts of garlic are evaluated by Oxford cup method to discuss the antibacterial activity of three common bacteria such asEscherichiacoli,Staphylococcusaureus,Bacillussubtilis, which are considered as testing bacteria. The results show that the two kinds of garlic extracts all have better inhibition on the growth of the three kinds of bacteria, but the inhibition effects are different. The inhibition effect is in the order ofStaphylococcusaureus>Escherichiacoli>Bacillussubtilis. Comparing the two kinds of garlic extracts, fresh garlic has better bacteriostatic effect than the aged garlic.The main volatile chemical components of garlic extract are analyzed by using gas chromatography-mass spectrometry to analyze two kinds of garlic extract ingredients.The results show that fresh garlic extract has 46 kinds of main volatile organic compounds, aged garlic extract has 54 volatile organic compounds. Two kinds of bacteriostatic active ingredients in garlic extract， sulfur-containing compounds, diallyl disulfide has 5.336% in fresh garlic, 4.126% in aged garlic and diallyl trisulfide has 0.541% in fresh garlic, 0.791% in aged garlic.

garlic;garlic extract;Oxford cup method;bacteriostatic activity;chemical component

TS264.29

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.11.007

1000-9973(2017)11-0035-05

2017-06-15

國家自然科學基金資助項目(31271854)

孟君(1971-)，女，教授，研究方向：儀器與食品分析。