嬰幼兒食品乳品和 中游離生物素測(cè)定方法的優(yōu)化

胡國(guó)華

1.引言

生物素又稱(chēng)為維生素H，屬于B族維生素，是含硫的一種維生素。生物素是乳制品重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，這種維生素參與機(jī)體的三大營(yíng)養(yǎng)代謝，是生物體生長(zhǎng)發(fā)育必需的一種營(yíng)養(yǎng)素，它參與有機(jī)體多種主要的新陳代謝活動(dòng)。特別是對(duì)嬰幼兒及孕產(chǎn)婦有著特殊的重要性，因此在嬰幼兒乳制品、孕產(chǎn)婦乳制品及食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑中添加生物素是十分必要的。主要的性能與用途有：構(gòu)成視沉細(xì)胞內(nèi)感光物質(zhì)、維持上皮組織結(jié)構(gòu)的完整和健全、增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)和抵抗力和維持正常生長(zhǎng)發(fā)育。

近年來(lái)，生物素的發(fā)展越來(lái)越受到關(guān)注，檢測(cè)的方法也比較多，但每種檢測(cè)方法的原理、時(shí)效、以及針對(duì)的產(chǎn)品都各不相同，故在實(shí)際應(yīng)用上，能針對(duì)樣品的不同而選擇合適的生物素檢測(cè)方法也是至關(guān)重要的。常用的生物素檢測(cè)方法有很多，主要包括微生物法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、熒光法等。其中微生物的方法是目前應(yīng)用比較廣泛的方法，也是嬰幼兒食品和乳品中游離生物素國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法中唯一的檢測(cè)方法，這個(gè)方法主要用于檢測(cè)樣品中生物素含量較低的情況。

此方法靈敏度高，但測(cè)試步驟繁瑣，工作量大，在用分光光度計(jì)讀數(shù)時(shí)要求漩渦混合后立即移入比色皿內(nèi)進(jìn)行讀數(shù)，并且要求每支試管的穩(wěn)定時(shí)間相同，對(duì)操作者的熟練程度有較高的要求，一次最多能檢測(cè)1到3個(gè)培養(yǎng)管，檢測(cè)效率低，也會(huì)增加誤差，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此需要開(kāi)發(fā)一種更簡(jiǎn)便和實(shí)用的檢測(cè)方法。

2.原理

利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）對(duì)游離生物素的特異性和靈敏性，定量測(cè)定出試樣中待測(cè)物質(zhì)的含量。在含有除待測(cè)物質(zhì)以外所有營(yíng)養(yǎng)成分的

培養(yǎng)基中，微生物的生長(zhǎng)與待測(cè)物質(zhì)含量呈線性關(guān)系，根據(jù)透光率與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行比較，即可計(jì)算出試樣中待測(cè)物質(zhì)的含量。

3.材料與方法

3.1 材料

3.1.1 菌株：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），ATCC 8014。

3.1.2 生物素（d-Biotin 或Vitamin H）標(biāo)準(zhǔn)品（C10H16N2O3S）：純度≥99 %。

3.1.3 培養(yǎng)基：乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基；乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基；生物素測(cè)定用培養(yǎng)基。

3.1.4 乙醇溶液（50 %）。

3.1.5 硫酸溶液（3 %）：量取3mL 硫酸加入到水中，定容至100 mL。

3.1.6 氫氧化鈉溶液（2 mol/L）：稱(chēng)取80 g 氫氧化鈉溶于1000 mL 水中。

3.1.7 氯化鈉溶液（9 g/L）：稱(chēng)取9.0 g 氯化鈉溶解于1000 mL 水中，分裝試管，每管10 mL。121℃滅菌15 min。

3.1.8 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

3.1.8.1 生物素標(biāo)準(zhǔn)貯備液（100 μg/mL）：稱(chēng)取生物素標(biāo)準(zhǔn)品（3.1.2）用乙醇溶液（3.1.4）定容至生物素

濃度為100 μg/mL，貯于冰箱中。

3.1.8.2 生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液（1 μg/mL）：吸取1 mL 生物素標(biāo)準(zhǔn)貯備液（3.1.8.1），用乙醇溶液（3.1.4）定容至100 mL。

3.1.8.3 生物素標(biāo)準(zhǔn)工作液（10 ng/mL）：吸取1 mL 生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液（3.1.8.2），用乙醇溶液（3.1.4）定容至100 mL。

3.1.8.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：分兩個(gè)濃度，高濃度溶液的濃度為0.2 ng/mL；低濃度溶液的濃度為0. 1 ng/mL。從工作液中（3.1.8.3）吸取兩次各5 mL，用水分別定容到250 mL 和500 mL。

3.2 儀器和設(shè)備。

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：

3.2.1 天平：感量為0.1 mg。

3.2.2 pH計(jì)：精度≤0.02。

3.2.3 分光光度計(jì)。

3.2.4 渦旋混合器。

3.2.5 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥2000 轉(zhuǎn)/分鐘。

3.2.6 恒溫培養(yǎng)箱：36 ℃ ±1 ℃。

3.2.7 冰箱：2 ℃～5 ℃。

3.2.8 無(wú)菌吸管：10 mL （具0.1 mL 刻度） 或微量移液器或吸頭。

3.2.9 瓶口分液器：0 mL～10 mL。

3.2.10 錐形瓶：200 mL。

3.2.11 容量瓶（A 類(lèi)）：100 mL，250 mL，500 mL。

3.2.12 單刻度移液管（A 類(lèi)）：容量5 mL。

3.2.13 漏斗：直徑90 mm。

3.2.14 定量濾紙：直徑90 mm。

3.2.15 試管：18mm×180 mm。

注：玻璃儀器使用前，用活性劑（月桂磺酸鈉或家用洗滌劑加入到洗滌用水中即可）對(duì)硬玻璃測(cè)定管及其他必要的玻璃器皿進(jìn)行清洗，清洗之后在200 ℃干熱2 h，以去除玻璃器皿中的殘留物對(duì)試驗(yàn)的影響。

3.3 分析步驟。

3.3.1 接種菌懸液的制備

3.3.1.1 將凍干菌株（3.1.1）活化后，轉(zhuǎn)接到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（3.1.3.1）中，36 ℃ ±1 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。再轉(zhuǎn)接2～3 代來(lái)增強(qiáng)活力。然后再將其從固體培養(yǎng)上轉(zhuǎn)接到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（3.1.3.2）中培養(yǎng)。

3.3.1.2 將乳酸桿菌肉湯中的培養(yǎng)液以2000 轉(zhuǎn)/分鐘離心2 min～3 min，傾出上清液，加入10 mL 氯化鈉溶液（3.1.7），混勻，再離心2 min～3 min，如此清洗3 次～4 次，吸適量該菌懸液于10 mL 鹽水（3.1.7）中，待測(cè)。endprint

3.3.1.3 用分光光度計(jì)以氯化鈉溶液（3.1.7）做空白，于550 nm 波長(zhǎng)下測(cè)菌懸液（3.3.1.2）的透光率，使其透光率在60 %～80 %之間。

3.3.2 樣品的處理

3.3.2.1 干粉樣品

稱(chēng)取一定量樣品（精確至0.0001 g）于250 mL 三角瓶中，該樣品應(yīng)含0.2 μg～0.5 μg 生物素，繼續(xù)3.3.2.3 步驟。

3.3.2.2 液體樣品

吸一定量的液體樣品于250 mL 三角瓶中，該樣品應(yīng)含0.2 μg～0.5 μg 生物素，繼續(xù)3.3.2.3 步驟。

3.3.2.3 樣品的提取

加入硫酸溶液（3.1.5）100 mL，121 ℃水解30 min，冷卻后用氫氧化鈉溶液（3.1.6）調(diào)節(jié)pH 至4.5±0.2，定量轉(zhuǎn)到250 mL 容量瓶中，用水定容，充分混合。用濾紙過(guò)濾，棄去最初的幾毫升。吸取濾液5 mL，加入約20 mL 水，用氫氧化鈉溶液（3.1.6）調(diào)pH 為6.8±0.2，定量轉(zhuǎn)到100 mL 容量瓶中，用水定容。

3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

按表1 順序加入水、標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液（3.1.8.4）和生物素測(cè)定用培養(yǎng)基（3.1.3.3）于培養(yǎng)管中，一式三份。

3.3.4 待測(cè)液的制作

按表2 順序加水、樣品溶液（3.3.2.3）和生物素測(cè)定用培養(yǎng)基（3.1.3.3）于培養(yǎng)管內(nèi)，一式三份。每份樣品需帶樣品空白試管一只，管內(nèi)分別加入5 mL待測(cè)液和5 mL培養(yǎng)基。

3.3.5 滅菌

將3.3.3和3.3.4中所有的試管蓋上試管帽，放入高壓滅菌鍋內(nèi)，121 ℃滅菌5 min（商品培養(yǎng)基按標(biāo)簽說(shuō)明進(jìn)行滅菌）。

3.3.6 接種

從高壓滅菌鍋內(nèi)取出試管，將試管迅速冷卻至30 ℃以下。將接種菌懸液（3.3.1.2）用滴管或移液器向上述試管中各滴加一滴（約50 μL），其中標(biāo)準(zhǔn)曲線管中未接種空白S1和樣品空白除外。

3.3.7 培養(yǎng)

將試管放入培養(yǎng)箱內(nèi)，36 ℃ ±1 ℃培養(yǎng)19 h～20 h。

3.3.8 測(cè)定

對(duì)每支試管進(jìn)行視覺(jué)檢查，接種空白試管S1 內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的，如果出現(xiàn)渾濁，則結(jié)果無(wú)效。

3.3.8.1 以接種空白試管S1 做對(duì)照，測(cè)定最高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線試管的吸光度，兩小時(shí)后重新測(cè)定。兩次結(jié)果透光率差值若小于2 %，則取出全部檢驗(yàn)管測(cè)其吸光度A。

3.3.8.2 以接種空白試管S2 為空白，調(diào)節(jié)吸光度為0，依次讀出其他每支試管的吸光度A，樣品空白的吸光度A 一并讀出。

3.3.8.3 用渦旋混合器充分混合每一支試管后，立即用兩種方法（即分光光度計(jì)法和酶標(biāo)儀法）對(duì)各管中的培養(yǎng)液進(jìn)行吸光度的測(cè)量。以生物素標(biāo)準(zhǔn)品的含量為橫坐標(biāo)，吸光度A 為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.3.8.4 對(duì)每個(gè)編號(hào)的待測(cè)液試管，用每支試管的吸光度值計(jì)算每毫升該編號(hào)待測(cè)液生物素的含量，并計(jì)算該編號(hào)待測(cè)液的生物素含量平均值，每支試管測(cè)得的該濃度不得超過(guò)該平均值的±15%，超過(guò)者要舍去。如果符合該要求的管數(shù)少于所有四個(gè)編號(hào)待測(cè)液總管數(shù)的2/3，需要重新檢驗(yàn)。如果符合該要求的管數(shù)大于等于原來(lái)管數(shù)的2/3，重新計(jì)算每一編號(hào)的有效試樣管中每毫升測(cè)定液生物素含量的平均值，以此平均值計(jì)算全部編號(hào)試樣管的總平均值Cx，用于計(jì)算試樣中的生物素含量。

3.3.9 分析結(jié)果的表述

試樣中生物素的含量按公式 （1） 計(jì)算：

（1）

式中：

X——試樣中生物素的含量，單位為μg/100 g；

Cx——3.3.8.4中計(jì)算所得的總平均值，單位為ng；

m——試樣的質(zhì)量，單位為克g；

f ——稀釋倍數(shù)。

以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。

3.3.10 精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10 %。

3.3.11 其他

本標(biāo)準(zhǔn)檢出限為20.0 μg/kg。

4.對(duì)比結(jié)果

5 .結(jié)論

隨著市場(chǎng)是嬰幼兒配方食品和乳品的增多，而生物素又是其中一種必要的添加物，也是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中要求的項(xiàng)目，《GB5413.19-2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測(cè)定》方法用分光光度計(jì)進(jìn)行培養(yǎng)液的測(cè)量工作量大，且對(duì)操作者的熟練程度有較高的要求，一次最多能檢測(cè)3個(gè)培養(yǎng)管，檢測(cè)效率低，同時(shí)也增加誤差。而用酶標(biāo)儀配合96孔板對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行吸光度的測(cè)量時(shí)，能將所有試管中的液體放在同一塊96孔板中同時(shí)進(jìn)行讀數(shù)，大大的減少了操作的時(shí)間，測(cè)試的結(jié)果與用分光光度計(jì)比較，誤差為0.1%。因此，在嬰幼兒食品和乳品中的游離生物素測(cè)試過(guò)程中，用酶標(biāo)儀取代分光光度計(jì)對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行吸光度的測(cè)量，可大大的降低人員的工作量，對(duì)優(yōu)化后的檢驗(yàn)方法更簡(jiǎn)便，易于操作，且結(jié)果準(zhǔn)確可靠，尤其適用于大批量樣品中游離生物素的測(cè)定。endprint