H3K27三甲基化在肺癌中的表達(dá)及臨床意義

張積廣　葉明凡

【摘要】 目的：探討組蛋白H3K27三甲基化（H3K27me3）在肺癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法：收集筆者所在科2006年3月-2016年8月75例肺癌患者的病灶組織及其周圍正常肺組織，采用組織陣列檢測(cè)（TMA）技術(shù)檢測(cè)組蛋白H3K27me3在肺癌組織及周圍正常肺組織中的表達(dá)，采用免疫反應(yīng)積分法（IRS）進(jìn)行評(píng)估和比較。結(jié)果：肺癌組織的平均IRS得分為（4.40±1.63）分，顯著高于正常組織的（0.74±0.28）分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；H3K27me3蛋白的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中-低分化肺癌和未分化肺癌、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑、組織類型等無(wú)關(guān)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：肺癌H3K27me3可能與肺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)，臨床上對(duì)H3K27me3表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，可能對(duì)疾病的發(fā)展、預(yù)后具有重要意義。

【關(guān)鍵詞】 肺癌； H3K27三甲基化； 臨床

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.20.017 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2017）20-0040-02

表觀遺傳學(xué)是指DNA序列不發(fā)生變化，但基因表達(dá)卻發(fā)生了可遺傳的改變，而表觀遺傳修飾主要包括DNA甲基化、組蛋白乙酰化和甲基化等[1]。組蛋白甲基化修飾在基因表達(dá)和染色體結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)上發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過(guò)影響染色體結(jié)構(gòu)“開(kāi)放”或“關(guān)閉”，控制基因轉(zhuǎn)錄的激活或抑制[2]。組蛋白H3的N-末端賴氨酸殘基K27（H3K27）是主要的甲基化修飾位點(diǎn)之一，在體內(nèi)有單甲基化（mel）、二甲基化（me2）及三甲基化（me3）形式[3]，其甲基化程度可影響相應(yīng)區(qū)域DNA的轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用[4]。本研究通過(guò)組織陣列檢測(cè)（TMA）技術(shù)檢測(cè)全基因組蛋白H3K27三甲基化（H3K27me3）在肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2006年3月-2016年8月筆者所在科收治的成人肺癌病灶組織及其周圍正常肺組織（距離癌腫>5 cm），各75例，患者男51例，女24例，年齡37～78歲，平均（62.8±6.3）歲。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療或免疫治療，所有病例術(shù)后病例診斷報(bào)告均顯示為原發(fā)性肺癌，其中鱗狀細(xì)胞癌37例，腺癌29例，大細(xì)胞癌6例，小細(xì)胞癌3例；其中高分化肺癌24例，中-低分化肺癌46例，未分化肺癌5例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例；TNMⅠ期25例，Ⅱ期19例，Ⅲ期31例。

1.2 方法

檢測(cè)組蛋白H3K27me3的表達(dá)，具體如下：（1）構(gòu)建肺癌TMA，在光學(xué)顯微鏡下標(biāo)記標(biāo)本無(wú)壞死或退變、有肺癌代表性的區(qū)域，用打孔針（直徑1.5 mm）于Quick-Ray預(yù)鑄受體蠟塊（韓國(guó)UNITMA公司）上打孔后即可取出2份圓柱形組織，分別將兩塊組織放入2個(gè)受體蠟塊進(jìn)行對(duì)比，60塊組織/蠟塊方陣，共5個(gè)TMA模塊。將組織蠟塊方陣置于52 ℃恒溫烤箱內(nèi)加熱1 h，室溫冷卻30 min，然后置于-20 ℃冷卻6 min。采用全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（型號(hào)：Leica RM2255，由德國(guó)Leica公司生產(chǎn)）切片，厚度為4 μm。將切片置于45 ℃溫水，切片充分舒展后采用組織芯片載玻片（上海桑戈生物科技有限公司）將切片撈起、室溫中晾干，置于95 ℃攤烤片機(jī)內(nèi)烤干后，調(diào)至60 ℃烤16 h，室溫冷卻后放在-20 ℃冰箱內(nèi)備用；（2）免疫組織化學(xué)方法染色，將切片置于60 ℃溫箱內(nèi)孵育30 min，用二甲苯脫蠟、梯度濃度酒精水化后，置于高壓蒸汽中加熱抗原修復(fù)，然后用0.3%甲醛/H2O2對(duì)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶進(jìn)行封閉。加入羊血清，常溫孵育1 h后，加入H3K27me3兔抗人多克隆抗體（1∶200）（美國(guó)Cell Singnaling Technology公司生產(chǎn)），置于4 ℃冰箱內(nèi)過(guò)夜。切片加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體后孵育1 h，置于4 ℃冰箱30 min，再置于DAB溶液中10 min，梯度濃度酒精脫水后置于二甲苯中透明，蓋上玻片后用中性樹(shù)脂封片，待晾干即可觀察；（3）結(jié)果的判讀，所有切片均經(jīng)本院病理科2位臨床病理醫(yī)師對(duì)切片HE染色及免疫組化染色進(jìn)行獨(dú)立閱片。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

采用免疫反應(yīng)積分法（IRS）：（1）染色強(qiáng)度的積分，以胞漿或胞核內(nèi)棕黃色顆粒為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，分為：①棕褐色顆粒為強(qiáng)陽(yáng)性，3分；②棕黃色顆粒為陽(yáng)性，2分；③淡黃色顆粒為弱陽(yáng)性，1分；④無(wú)著色為陰性，0分；（2）陽(yáng)性細(xì)胞百分比積分，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野內(nèi)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞百分比：①>75%，4分；②51%～75%，3分；③26%～50%，2分；④0～25%，1分；IRS得分=染色強(qiáng)度積分×陽(yáng)性細(xì)胞百分比積分，每個(gè)病例得分取兩個(gè)重復(fù)樣本之均值[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，正態(tài)計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗(yàn)，，P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織與正常肺組織內(nèi)組蛋白H3K27me3表達(dá)水平比較

肺癌組織的平均IRS得分顯著高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）

2.2 組蛋白H3K27me3的表達(dá)與肺癌臨床病理因素的關(guān)系

H3K27me3蛋白的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中-低分化肺癌和未分化肺癌、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期有關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與性別、年齡、吸煙史、腫瘤直徑、組織類型等無(wú)關(guān)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）

3 討論

國(guó)家癌癥中心2015年發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2006-2011年我國(guó)肺癌5年患病率是130.2（1/10萬(wàn)），在男性惡性腫瘤中居第2位，在女性惡性腫瘤中居第4位[6]。盡管肺癌的治療取得了進(jìn)步，死亡仍是絕大多數(shù)肺癌患者的最終結(jié)局，因此，要發(fā)展更有效的肺癌診療方法，研究腫瘤形成的分子機(jī)制是至關(guān)重要的課題[7]。endprint

越來(lái)越多研究顯示，表觀遺傳學(xué)可通過(guò)自分泌循環(huán)通路、原癌基因和抑癌基因這三個(gè)因素的調(diào)控影響肺癌的發(fā)生、發(fā)展[8]。組蛋白是染色質(zhì)的基本組成單位，而組蛋白尾部的某些氨基酸殘基發(fā)生的翻譯后修飾可改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)果，從而影響基因表達(dá)[9]。組蛋白的修飾方式主要有甲基化、乙酰化和磷酸化。組蛋白H3的N-末端賴氨酸殘基K27（H3K27）是主要的甲基化修飾位點(diǎn)之一，其甲基化是一個(gè)抑制基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵介質(zhì)，能引發(fā)重要的生物學(xué)功能[10]。文獻(xiàn)[4]報(bào)道，H3K27me3在肝細(xì)胞癌、膀胱癌中高表達(dá)，預(yù)示預(yù)后差，而在胰腺癌和婦科惡性腫瘤中預(yù)后良好，提示H3K27在不同腫瘤中與特定基因關(guān)聯(lián)，通過(guò)甲基化調(diào)控特定抑癌基因和原癌基因活性，從而影響疾病的臨床預(yù)后。本研究采用組織陣列檢測(cè)（TMA）技術(shù)對(duì)75例肺癌病理標(biāo)本及癌旁正常肺組織進(jìn)行組蛋白H2K27me3檢測(cè)，通過(guò)免疫反應(yīng)積分法（IRS）綜合考慮病理組織的染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比這兩個(gè)因素。結(jié)果顯示，肺癌病理組織內(nèi)的組蛋白H2K27me3表達(dá)水平顯著高于正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且組蛋白H2K27me3的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中-低分化肺癌和未分化肺癌、TNM分期Ⅱ～Ⅲ期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明組蛋白H2K27me3的高表達(dá)與肺癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。其機(jī)制可能是組蛋白H3K27me3抑制抑癌基因的轉(zhuǎn)錄[11]，影響細(xì)胞周期的調(diào)控，從而使得抑癌基因沉默，最終影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后。

綜上所述，肺癌細(xì)胞內(nèi)組蛋白H2K27m3高表達(dá)可能與疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，臨床上對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，可能對(duì)疾病的發(fā)展、治療、預(yù)后判斷具有重要臨床意義。

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（收稿日期：2017-03-08）endprint