東莨菪堿與苯扎氯銨干眼癥大鼠造模方法研究

楊延婷，張 丹，吳麗潔，李志元，張 霽，賈一凡，馬曉芃，*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 210203；2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海 200030；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100001)

東莨菪堿與苯扎氯銨干眼癥大鼠造模方法研究

楊延婷1，張 丹2，吳麗潔1，李志元1，張 霽1，賈一凡3，馬曉芃1，2*

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海 210203；2.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所，上海 200030；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100001)

為比較氫溴酸東莨菪堿皮下注射與苯扎氯銨滴眼制作干眼癥動(dòng)物模型的各自特點(diǎn)，將健康SD大鼠隨機(jī)分為正常組、東莨菪堿加風(fēng)組、苯扎氯銨組和吹風(fēng)對(duì)照組。正常組不接受任何處理；東莨菪堿組皮下注射氫溴酸東莨菪堿注射劑；苯扎氯銨組以2 mg/mL苯扎氯銨滴眼液每日3次滴眼；吹風(fēng)組僅置于吹風(fēng)裝置中每日12 h。于試驗(yàn)第3、7、10天檢查Schirmer I試驗(yàn)(SIT)、淚膜破裂時(shí)間(BUT)、角膜熒光素染色(FLS)。結(jié)果表明，東莨菪堿組在第3、7、10天，SIT與正常組相比具有顯著差異(P<0.05)，第7、10天BUT和FLS與正常組相比具有顯著差異(P<0.05)；苯扎氯銨組在試驗(yàn)第7、10天，SIT試驗(yàn)和BUT與正常組相比有顯著差異(P<0.05)，BUT第10天差異達(dá)到最大，在第3、7、10天，F(xiàn)LS與正常組相比具有顯著差異(P<0.05)；組織病理學(xué)檢查東莨菪堿組淚腺較苯扎氯銨組明顯有腺上皮細(xì)胞萎縮；苯扎氯銨組大鼠角結(jié)膜上皮細(xì)胞明顯變薄，表層細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞數(shù)量顯著減少，并存在炎性細(xì)胞浸潤。提示造模10 d氫溴酸東莨菪堿注射劑皮下注射配合吹風(fēng)制作的干眼癥動(dòng)物模型對(duì)大鼠淚腺及眼表上皮細(xì)胞影響顯著，伴有較輕程度的眼表損傷，更適合早期輕中度干眼造模；苯扎氯銨滴眼造模方法易造成眼表上皮損傷，適合短期重度干眼的造模。

干眼癥；造模方法；東莨菪堿；苯扎氯銨；大鼠

干眼癥是由于淚液分泌不足或淚液蒸發(fā)過快所引起的淚膜不穩(wěn)定的疾病。隨著現(xiàn)代生活的發(fā)展、各種視頻儀器的廣泛應(yīng)用、角膜接觸鏡的佩戴、環(huán)境的改變等諸多因素的影響，其發(fā)病率逐年升高并趨于低齡化發(fā)展，患者生活質(zhì)量下降并伴有焦慮情緒[1]。越來越多的證據(jù)表明，眼表(角膜、結(jié)膜和瞼板腺)和主淚腺構(gòu)成的眼表功能單位對(duì)淚膜起主要調(diào)控作用[2]。干眼癥發(fā)生時(shí)任何淚腺功能單位都有可能受到影響。干眼癥的主要發(fā)病機(jī)制是眼表和主淚腺的炎癥，在眼表組織中可以檢測到炎癥標(biāo)記物如HLA-DR和白介素(IL) -1β等[3]。

動(dòng)物試驗(yàn)是干眼研究的重要輔助手段，建立適宜的干眼模型是研究干眼癥的前提條件。目前已有多種建立干眼動(dòng)物模型的方法，如通過環(huán)境因素、毒性物質(zhì)、藥物作用、改變動(dòng)物性激素分泌水平、去除淚腺或眼表的神經(jīng)支配、誘導(dǎo)淚腺產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)、營養(yǎng)因素及手術(shù)摘除淚腺等[4]?，F(xiàn)有的干眼動(dòng)物模型從多方面模擬了干眼的發(fā)病機(jī)制， 但目前尚無一種模型能夠完全反映干眼極其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制以及干眼的慢性、反復(fù)發(fā)作的病程。在干眼研究中，大鼠作為常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，相對(duì)于兔模型具有價(jià)格便宜，單克隆抗體定購相對(duì)容易等優(yōu)勢。因此，探尋大鼠干眼模型的最佳方法顯得尤為重要。通過東莨菪堿藥物作用抑制淚腺分泌，從而建立淚液生成不足型干眼動(dòng)物模型及利用防腐劑苯扎氯銨誘導(dǎo)的蒸發(fā)過快型干眼癥模型是兩類應(yīng)用最為廣泛的造模方法[5-6]。本文結(jié)合國外相關(guān)造模方法研究成果對(duì)常用的造模方法及其效應(yīng)做一對(duì)比觀察，以期為干眼癥基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD大鼠20只，體重160 g±20 g，上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，自由攝食與飲水。裂隙燈顯微鏡、眼底鏡檢查眼前節(jié)及眼底無異常的動(dòng)物方可應(yīng)用于試驗(yàn)。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)，隨機(jī)分為正常組、東莨菪堿吹風(fēng)組、苯扎氯銨組和吹風(fēng)對(duì)照組，每組各5只。所有動(dòng)物的操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定。

1.1.2 試劑與儀器 氫溴酸東莨菪堿,上海源葉生物有限責(zé)任公司產(chǎn)品；苯扎氯銨,Sigma公司產(chǎn)品；熒光素眼科檢測試紙、淚液檢測濾紙條，天津晶明新技術(shù)發(fā)展有限公司產(chǎn)品；9 g/L氯化鈉注射液、無水乙醇、甲醛、多聚甲醛、二甲苯、中性樹膠粘合劑、十二水合磷酸氫二鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；蘇木素、伊紅,南京建成生物科技有限公司產(chǎn)品；裂隙燈顯微鏡,蘇州六六視覺科技股份有限公司產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡及分析軟件,Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理 正常組除同一時(shí)間檢測相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)并采用抓取固定外，不進(jìn)行任何處理。東莨菪堿并吹風(fēng)組(簡稱東莨菪堿組)采用氫溴酸東莨菪堿皮下注射并置于吹風(fēng)裝置制備大鼠干眼癥模型，造模方法參照文獻(xiàn)[7-9],方法如下：交替在大鼠雙下肢注射0.6 mg/0.1 mL氫溴酸東崀菪堿，每天4次(分別為上午8:00和11:00，下午2:00和5:00)，并將大鼠置于自制的通風(fēng)裝置中，每天連續(xù)吹對(duì)流風(fēng)12 h，連續(xù)10 d，以完成制備干眼癥模型，通風(fēng)裝置按文獻(xiàn)[9-10]設(shè)計(jì)并制作，將大鼠置于兩個(gè)風(fēng)扇之間吹自然對(duì)流風(fēng)。苯扎氯銨組造模方法參照文獻(xiàn)[5],具體步驟：將50 mg/mL苯扎氯銨溶液配制成2 mg/mL苯扎氯銨滴眼液，每日3次滴眼(分別為上午9:00和12:00，下午3:00)，直至試驗(yàn)結(jié)束共10 d。吹風(fēng)對(duì)照組采取抓取并置于通風(fēng)裝置，每天12 h。所有大鼠在同一濕度溫度環(huán)境下飼養(yǎng)，各組進(jìn)行相關(guān)方法處理后，于第3、7、10天進(jìn)行淚液分泌量、淚膜破裂時(shí)間、角膜熒光素染色的檢測，并進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.2.2 指標(biāo)檢測

1.2.2.1 淚液分泌量試驗(yàn)(schirmer test I,SIT) 固定大鼠，采用改良淚液試紙[11](1 mm×15 mm)，置于大鼠下瞼外1/3結(jié)膜囊內(nèi)，計(jì)時(shí)2 min，測量濕長，精確到0.5 mm。重復(fù)3次，取平均值。于第3、7、10天進(jìn)行淚液分泌量檢測。

1.2.2.2 淚膜破裂時(shí)間觀察(break-up time,BUT) 固定大鼠，將熒光素鈉檢測試紙用1滴生理鹽水濕潤，試紙尖端輕觸大鼠下眼瞼內(nèi)側(cè)并停留片刻，輔觸瞬目幾次使熒光素分布均勻，裂隙燈鈷藍(lán)光下觀察角膜出現(xiàn)第一個(gè)黑色干燥斑點(diǎn)的時(shí)間。重復(fù)3次，取平均值。于第3、7、10天進(jìn)行淚膜破裂時(shí)間檢測。

1.2.2.3 角膜熒光素染色評(píng)分(fluorescein staining，F(xiàn)LS) 固定大鼠，將熒光素鈉檢測試紙用1滴生理鹽水濕潤，試紙尖端輕觸大鼠下眼瞼內(nèi)側(cè)并停留片刻，輔觸瞬目幾次使熒光素分布均勻，裂隙燈在鈷藍(lán)光下觀察角膜熒光染色情況，評(píng)價(jià)染色分級(jí)。評(píng)分方法是將角膜分為4個(gè)象限，規(guī)定無染色為0分，有染色分輕、中、重3級(jí)，1分為染色少于5個(gè)點(diǎn)，3分為出現(xiàn)塊狀染色或絲狀物，2分介于兩者之間，共0～12分。

1.2.3 組織病理學(xué)觀察 造模結(jié)束后戊巴比妥鈉麻醉處死后取角膜、結(jié)膜和淚腺組織，采用40 g/L多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋，采用連續(xù)切片，厚度約5 μm。 常規(guī)脫蠟至水，然后進(jìn)行HE染色，常規(guī)脫蠟至水；蘇木素染色2 min；流水沖洗10 min；鹽酸酒精分化5 s；流水沖洗10 min；溫水返藍(lán)處理；伊紅染色2 min；梯度酒精脫水；二甲苯透明；中性樹膠封片。晾干后在光鏡下觀察各組大鼠的角膜、結(jié)膜和淚腺組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

2 結(jié)果

2.1 不同造模方法對(duì)大鼠淚液分泌量的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，東莨菪堿組和吹風(fēng)組第3、7、10天淚液分泌量顯著降低，苯扎氯銨組第7、10天淚液分泌量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與東莨菪堿組比較，苯扎氯銨組第在第3、7、10天淚液分泌量高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，吹風(fēng)組第7、10天淚液分泌量高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表1)。

2.2 不同造模方法對(duì)大鼠淚膜破裂時(shí)間的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，東莨菪堿組、苯扎氯銨組第7、10天淚膜破裂時(shí)間顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；吹風(fēng)組與正常組相比，各時(shí)間點(diǎn)淚膜破裂時(shí)間均無顯著性差異(P>0.05)；與東莨菪堿組、苯扎氯銨組相比，吹風(fēng)組第3、7、10天的淚膜破裂時(shí)間較高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

表1 不同干眼造模方法大鼠淚液分泌量的變化Table 1 Comparison of the tear secretion volume of dry eye rats by different molding methods

注：與正常組比較，aP<0.01；與東莨菪堿組比較，bP<0.01。
Note:Compared with normal group，aP<0.01；Compared with scopolamine group，bP<0.01.

表2 不同干眼造模方法大鼠淚膜破裂時(shí)間的變化Table 2 Comparison of the BUT of dry eye rats by different molding methods

注：與正常組比較，aP<0.01；與東莨菪堿組比較，bP<0.01;與苯扎氯銨組比較，cP<0.05。
Note:Compared with normal group，aP<0.01；Compared with scopolamine group，bP<0.01;Compared with benzalkonium group，cP<0.05.

2.3 不同造模方法對(duì)大鼠角膜熒光素染色的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，東莨菪堿組第7、10天角膜熒光素染色評(píng)分顯著增高，苯扎氯銨組第3、7、10天角膜熒光素染色評(píng)分顯著增高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而吹風(fēng)組第3、7、10天，角膜熒光素染色評(píng)分與正常組比較均無顯著性差異。與東莨菪堿組比較，苯扎氯銨組第7、10天染色評(píng)分顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與苯扎氯銨組相比，吹風(fēng)組第3、7、10天熒光素染色評(píng)分較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表3)。

2.4 不同造模方法對(duì)大鼠眼表組織損傷的影響

2.4.1 不同造模方法對(duì)大鼠角膜組織的影響 鏡下觀察，正常組大鼠角膜呈現(xiàn)典型五層結(jié)構(gòu)，即由內(nèi)而外依次為內(nèi)皮細(xì)胞層、后彈力層、基質(zhì)層、前彈力層、上皮細(xì)胞層，各層結(jié)構(gòu)完整，分布清晰，上皮層主要為5～6層細(xì)胞構(gòu)成，主要為扁平細(xì)胞、翼狀細(xì)胞、基底細(xì)胞，上皮細(xì)胞極性存在，排列整齊，數(shù)量正常，分布均勻。與正常組比較，東莨菪堿大鼠角膜上皮層顯著變薄，細(xì)胞排列紊亂，上皮細(xì)胞角化層明顯變厚，細(xì)胞腫脹明顯，體積顯著增大，基質(zhì)層較疏松，可見少量成纖維細(xì)胞堆積肉芽組織增生及新生毛細(xì)血管。苯扎氯銨組大鼠角膜明顯變薄，表層細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，表面細(xì)胞不完全角化，核間距增大，部分區(qū)域染色變淺細(xì)胞水腫明顯，有大量炎細(xì)胞浸潤和新生血管，可見少量嗜酸性粒細(xì)胞，基質(zhì)層明顯疏松。吹風(fēng)組可見上皮細(xì)胞少量減少，表皮層輕微角化，基質(zhì)層疏松。結(jié)果表明東莨菪堿及苯扎氯銨造模方法能不同程度的損傷大鼠角膜組織結(jié)構(gòu)，苯扎氯胺組對(duì)角膜的損傷程度更嚴(yán)重(圖1)。

表3 不同干眼造模方法對(duì)大鼠熒光素染色評(píng)分的影響Table 3 Comparison of the corneal fluorescein staining score of dry eye rats by different molding methods

注：與正常組比較，aP<0.01；與東莨菪堿組比較，bP<0.01;與苯扎氯銨組比較，cP<0.05。
Note:Compared with normal group，aP<0.01；Compared with scopolamine group，bP<0.01;Compared with benzalkonium group，cP<0.05.

A1.正常組(200×);A2.正常組(400×);B1.東莨菪堿組(200×);B2.東莨菪堿組(400×);C1.苯扎氯銨組(200×);C2.苯扎氯銨組(400×);D1.吹風(fēng)組(200×);D2.吹風(fēng)組(400×)
A1.Normal group(200×);A2.Normal group(400×);B1.Scopolamine group(200×);B2.Scopolamine group(400×);C1.Benzalkonium group(200×);C2.Benzalkonium group(400×);D1.Blowing group(200×);D2.Blowing group(400×)
圖1各組大鼠角膜組織HE染色
Fig.1 HE staining of rat cornea tissues in each intervention group

2.4.2 不同造模方法對(duì)大鼠結(jié)膜組織的影響 光鏡下可見，正常組大鼠結(jié)膜結(jié)構(gòu)完整，主要由表層及固有層組成，表層為復(fù)層柱狀上皮細(xì)胞，光滑完整，細(xì)胞表面有微絨毛，胞核層疊呈柱狀，上皮細(xì)胞間散在杯狀細(xì)胞，體積偏大，胞內(nèi)富含黏液顆粒，固有層為結(jié)締組織，含有大量膠原纖維、成纖維細(xì)胞、血管、神經(jīng)等。與正常組相比，東莨菪堿模型組大鼠結(jié)膜上皮表層明顯變薄，細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)欠完整，少量細(xì)胞呈半脫落狀，杯狀細(xì)胞數(shù)量減少，伴輕度水腫，有少量炎性細(xì)胞浸潤。苯扎氯銨組大鼠結(jié)膜上皮表層變薄，杯狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，局部出現(xiàn)缺損，有炎癥細(xì)胞浸潤，間質(zhì)間血管擴(kuò)張、充血，并可見大面積水腫，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。吹風(fēng)組上皮細(xì)胞數(shù)量減少，杯狀細(xì)胞排列較規(guī)則(圖2)。

A1.正常組(200×);A2.正常組(400×);B1.東莨菪堿組(200×);B2.東莨菪堿組(400×);C1.苯扎氯銨組(200×);C2.苯扎氯銨組(400×);D1.吹風(fēng)組(200×);D2.吹風(fēng)組(400×)
A1.Normal group(200×);A2.Normal group(400×);B1.Scopolamine group(200×);B2.Scopolamine group(400×);C1.Benzalkonium group(200×);C2.Benzalkonium group(400×);D1.Blowing group(200×);D2.Blowing group(400×)
圖2各組大鼠結(jié)膜組織HE染色
Fig.2 HE staining of rat conjunctiva tissues in each intervention group

2.4.3 不同造模方法對(duì)大鼠淚腺組織的影響 光鏡下觀察，正常組大鼠淚腺組織由大小不等的小葉組成，小葉間主要成分為致密結(jié)締組織，含成纖維細(xì)胞及大量膠原纖維，散在淋巴細(xì)胞、血管、神經(jīng)等，腺泡大小均勻，排列緊密，腺上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整并呈高柱狀，細(xì)胞核位于基底部，胞漿內(nèi)富含分泌泡，腺泡腔內(nèi)可見泡狀黏液。與正常組比較，東莨菪堿模型組淚腺上皮細(xì)胞萎縮，體積變小，腺腔擴(kuò)大，排列欠規(guī)則，結(jié)構(gòu)不清晰，腔內(nèi)黏液物質(zhì)明顯減少，小葉間隙增大，結(jié)締組織明顯水腫。苯扎氯銨組淚腺上皮輕微萎縮，間隙增大，黏液物質(zhì)少量減少。吹風(fēng)組腺泡大小較均勻，排列緊密，腺上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整(圖3)。

A1.正常組(200×);A2.正常組(400×);B1.東莨菪堿組(200×);B2.東莨菪堿組(400×);C1.苯扎氯銨組(200×);C2.苯扎氯銨組(400×);D1.吹風(fēng)組(200×);D2.吹風(fēng)組(400×)
A1.Normal group(200×);A2.Normal group(400×);B1.Scopolamine group(200×);B2.Scopolamine group(400×);C1.Benzalkonium group(200×);C2.Benzalkonium group(400×);D1.Blowing group(200×);D2.Blowing group(400×)
圖3各組大鼠淚腺組織HE染色
Fig.3 HE staining of rat lacrimal gland tissues in each intervention group

3 討論

尋找適宜的干眼癥動(dòng)物模型對(duì)于闡述干眼癥發(fā)病機(jī)制及評(píng)估有治療前景的藥物或干預(yù)方法是至關(guān)重要的，在過去十年的發(fā)展中各種動(dòng)物模型已經(jīng)研究出來用于模仿不同病理生理機(jī)制的干眼癥[7,12-14]。然而，并沒有一個(gè)可以精確地模擬臨床表現(xiàn)和人類干眼病的發(fā)病機(jī)制的模型。本研究對(duì)照研究了東莨菪堿配合吹風(fēng)與苯扎氯銨造模方法對(duì)大鼠眼表功能和病理學(xué)影響，以期為選擇適宜的干眼癥造模方法提供參考數(shù)據(jù)。

SIT和BUT結(jié)果顯示0.6 mg/0.1 mL的東莨菪堿皮下注射結(jié)合吹風(fēng)在短期內(nèi)可以較好的模擬人類干眼癥。Sabrina Viau等[15]分別采用6、 12.5、25 mg/d的東莨菪堿劑量皮下注射連續(xù)觀察28 d發(fā)現(xiàn)都引起了不同程度的角膜炎，第10天時(shí)結(jié)膜上皮細(xì)胞及淚腺中MHC-Ⅱ蛋白、TNF-α、 IL-1β 及 IL-6 mRNA表達(dá)均升高，而這些促炎因子已經(jīng)被證實(shí)在淚液蒸發(fā)過快和生成不足型干眼癥模型中被誘導(dǎo)產(chǎn)生[16-17]。Yusha Ru等[6]給小鼠局部皮下注射東莨菪堿抑制鼠淚液的產(chǎn)生。同時(shí)將這些鼠放置在一鼓風(fēng)裝置制造的干燥環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)可以較快地產(chǎn)生干眼模型。氫溴酸東莨菪堿是一種外周作用較強(qiáng)的抗膽堿藥，可作為一種副交感神經(jīng)抑制劑，東莨菪堿能夠抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并產(chǎn)生與阿托品相似的藥理作用，如瞳孔放大、神經(jīng)麻痹和抑制腺體分泌。在干眼造模研究中其作用是阻斷淚腺的膽堿能受體從而減少淚液的分泌。設(shè)置通風(fēng)對(duì)流裝置所產(chǎn)生的持續(xù)快速氣流可以破壞淚膜的穩(wěn)定性，從而加快淚液蒸發(fā)。本研究發(fā)現(xiàn)，在使用東莨菪堿配合吹風(fēng)后淚膜穩(wěn)定性下降，并伴有角膜上皮的點(diǎn)狀缺失，病理觀察提示角、結(jié)膜表面有不同程度的損傷，并伴有炎癥浸潤，這種改變也較符合早期輕中度干眼。此外本研究還發(fā)現(xiàn)如果單用持續(xù)氣流，對(duì)眼表功能及淚膜的穩(wěn)定也會(huì)有一定影響，這個(gè)結(jié)果與Yoon K C等[18]的研究結(jié)論相符合。此外，大鼠在持續(xù)吹風(fēng)環(huán)境中，眼表很容易被吹起的墊料木屑渣進(jìn)入并引起損傷，也與多次檢測眼表相關(guān)指標(biāo)而對(duì)大鼠眼表造成一定的人為刺激損傷有關(guān)。

苯扎氯銨是多種滴眼液中常用的防腐劑，也是臨床上引起干眼癥不適癥狀的常見因素。Lin Z等[5]研究利用苯扎氯銨誘導(dǎo)小鼠干眼模型，7 d后驗(yàn)證模型成功。該方法不僅臨床表現(xiàn)類似于人類干眼，且相關(guān)組織病理改變也與人類干眼相近，包括淚膜穩(wěn)定性受損、眼表炎癥、角膜上皮細(xì)胞凋亡與杯狀細(xì)胞的丟失、鱗狀上皮化生等。而近年來常以該方法作為嚴(yán)重型干眼造模方法之一，基于其防腐劑的性質(zhì)，苯扎氯銨誘導(dǎo)的干眼模型歸類為蒸發(fā)過快型干眼，有其獨(dú)特的特點(diǎn)和局限性。本研究結(jié)果顯示，苯扎氯銨組大鼠角膜熒光素染色評(píng)分較其他組顯著升高，病理染色結(jié)果證實(shí)該造模方法對(duì)大鼠眼表有嚴(yán)重的損傷作用，適用于短期重度干眼的造模。由于廣泛的可用抗體和不同轉(zhuǎn)基因品種的易得性，大鼠模型為常用的一類用于淚腺和眼表相關(guān)炎癥免疫機(jī)制研究的動(dòng)物。但是在造模的過程中存在許多的不確定因素，值得研究者深度思考和改進(jìn)。由于炎癥在干眼癥中扮演著重要作用，本研究中東莨菪堿加吹風(fēng)和苯扎氯銨這兩種造模方法均可以用于干眼癥相關(guān)炎癥機(jī)制的研究，并可能運(yùn)用于作為評(píng)估抗炎藥物和方法的治療效果。

[1] Zeev M S,Miller D D,Latkany R.Diagnosis of dry eye disease and emerging technologies[J].Clin Ophthalmol,2014,8:581-590.

[2] Stern M E,Gao J,Siemasko K F,et al.The role of the lacrimal functional unit in the pathophysiology of dry eye[J].Exp Eye Res,2004,78(3):409-416.

[3] Wei Y,Asbell P A.The core mechanism of dry eye disease (DED) is inflammation[J].Eye Contact Lens,2014,40(4):248-256.

[4] 肖啟國,劉祖國.干眼模型的建立方法及評(píng)價(jià)[J].眼科研究,2004(4):438-441.

[5] Lin Z,Liu X,Zhou T,et al.A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride[J].Mol Vis,2011,17(25):257-264.

[6] Ru Y,Yue H,Liu H,et al.α-Melanocyte-stimulating hormone ameliorates ocular surface dysfunctions and lesions in a scopolamine-induced dry eye model via PKA-CREB and MEK-Erk pathways[J].Sci Rep,2015,5:18619.

[7] Yoon K C,Ahn K Y,Choi W,et al.Tear production and ocular surface changes in experimental dry eye after elimination of desiccating stress[J].Invest Ophthamol Vis Sci,2011,52(10):7267-7273.

[8] 劉會(huì)娟,黃 悅,張 琰,等.大鼠干眼模型的建立及其角膜神經(jīng)的改變[J].眼科新進(jìn)展,2014,34(5):422-427.

[9] Kim C E,Oh H N,Lee J H,et al.Effects of chondrocyte-derived extracellular matrix in a dry eye mouse model[J].Mol Vis,2015,26(21):1210-1223.

[10] De Paiva C S,Villarreal A L,Corrales R M,et al.Dry eye-induced conjunctival epithelial squamous metaplasia is modulated by interferon-gamma[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2007,48:2553-2660.

[11] 黃林英,晏曉明,榮 蓓.不同濃度人血清滴眼液治療重癥干眼大鼠的實(shí)驗(yàn)研究[J].眼科,2010,19(3):174-178.

[12] Li J,Roubeix C,Wang Y,et al.Therapeutic efficacy of trehalose eye drops for treatment of murine dry eye induced by an intelligently controlled environmental system[J].Mol Vis,2012,18:317-329.

[13] Barabino S,Dana M R.Animal models of dry eye:a critical assessment of opportunities and limitations[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2004,45(6):1641-1646.

[14] Dursun D,Wang M,Monroy D,et al.A mouse model of keratoconjunctivitis sicca.[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2002,43(3):632-638.

[15] Viau S,Maire M A,Pasquis B,et al.Time course of ocular surface and lacrimal gland changes in a new scopolamine-induced dry eye model[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2008,246(6):857-867.

[16] Corrales R M,Villarreal A,Farley W,et al.Strain-related cytokine profiles on the murine ocular surface in response to desiccating stress[J].Cornea,2007,26(5):579-584.

[17] De Paiva C S,Villarreal A L,Corrales R M,et al.Dry eye-induced conjunctival epithelial squamous metaplasia is modulated by interferon-gamma[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2007,48(6)2553-2560.

[18] Yoon K C,De Paiva C S,Qi H,et al.Desiccating environmental stress exacerbates autoimmune lacrimal keratoconjunctivitis in non-obese diabetic mice[J].J Autoimmun,2008,30(4):212-221.

StudyonDryEyeModelingbyScopolamineandBenzalkoniumChlorideinRats

YANG Yan-ting1,ZHANG Dan2,WU Li-jie1,LI Zhi-yuan1,ZHANG Ji1,JIA Yi-fan3,MA Xiao-peng2

(1.ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai,201203,China;2.ShanghaiResearchInstituteofAcupunctureandMeridian,Shanghai,200030,China;3.BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing,100001,China)

To compare the dry eye models developed by subcutaneous injection of scopolamine hydrobromide and eye drops of benzalkonium chloride in rats respectively,healthy SD rats were randomly divided into 4 groups：normal group(NG),scopolamine plus blowing group(SG),benzalkonium group (BZG) and blowing group (BG),5 rats in each group.The rats in the NG didn't receive any treatment,while rats in SG were administered alternatively into the lower limbs with 0.5 mL scopolamine hydrobromide (0.6 mg/0.1 mL) ( 4 times a day ),the rats in the BZG were given with eye drops of benzalkonium chloride ( 2 mg/mL ) three times a day,and the rats in the BG were kept in the blowing device for 12 h everyday.Then,Schirmer Ⅰ test (SⅠT),tear membrane breakup time (BUT) and fluorescein staining (FLS) were tested in each group.After experiment,the inter-group comparison of SⅠT in SG and NG showed statistically significance on day 3,7 and 10 (P<0.05),and the comparison of BUT and FLS showed statistically significance on day 7 and 10 (P<0.05).For rats in BZG,the inter-group comparison of SIT and BUT with NG showed statistically significance on day 7 and 10 (P<0.05),the most substantial changes of BUT appeared at day 10,and the comparison of FLS with NG showed statistical significance (P<0.05).Histopathological examination of lacrimal gland showed a more obvious atrophy of glandular epithelial cells in SG when compared with that in BZG;Rats in BZG showed a thinner corneal surface,chaotic cell arrangement,a reduction of the cell number and infiltration of inflammatory cells which indicated that at day 10,the subcutaneous injection of scopolamine hydrobromide combined with blowing method had obvious influence on lacrimal gland and ocular epithelium cells in rats with an ocular surface damage in a mild degree which is suitable for creating mild to moderate dry eye model in early stage,while eye drops of benzalkonium method can cause damage to ocular surface more easily which is more suitable for creating severe dry eye in a short period.

dry eye;modeling method;scopolamine;benzalkonium chloride;rat

2017-01-16

上海市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)項(xiàng)目(№201440412，ZJ2016028)；上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(№13ZR1439500)

楊延婷(1990-)，女，甘肅蘭州人，博士研究生，主要從事針灸免疫學(xué)研究。*

Q789

A

1007-5038(2017)10-0043-08