豬圓環(huán)病毒2型ORF2單克隆抗體的制備與鑒定

安春敬,李祥敏,張華偉,莫紅芳,郭夏陽,趙澤凱,錢 平*,趙曉玲

(1.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室，湖北武漢 430070)

豬圓環(huán)病毒2型ORF2單克隆抗體的制備與鑒定

安春敬1,2,李祥敏2,張華偉2,莫紅芳2,郭夏陽2,趙澤凱2,錢 平2*,趙曉玲1*

(1.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，西藏林芝 860000；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物重點實驗室，湖北武漢 430070)

以桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PCV2 ORF2重組蛋白為免疫原，旨在獲得針對PCV2的特異性單克隆抗體。用Sf9細(xì)胞表達(dá)PCV2 ORF2重組蛋白，通過層析柱和超濾管濃縮法純化PCV2 ORF2重組蛋白。將純化的PCV2 ORF2重組蛋白免疫6周齡的雌性Balb/c小鼠，3次免疫后，取免疫后小鼠脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合，采用間接ELISA篩選，經(jīng)過3次亞克隆獲得4株能穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞，命名為1H9、4C11、5B8和4F12株。IFA和Western blot試驗說明，4株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體能與ORF2重組蛋白作用。特異性試驗表明，4F12株單克隆抗體與豬圓環(huán)病毒2型(PCV2 KQ22株)發(fā)生特異性反應(yīng)，經(jīng)抗體亞型鑒定1H9、4C11和5B8 3株亞型為IgG1/Kappa，4F12株為IgG2b/Kappa，1H9、4C11、5B8和4F12株小鼠腹水效價分別為105、104、106和105。表明獲得了與PCV2特異性作用的單克隆抗體。

豬圓環(huán)病毒2型；核衣殼蛋白；單克隆抗體

豬圓環(huán)病毒首次于1974年由Tischer T等[1]發(fā)現(xiàn)，2004年國際病毒分類委員會將PK-15細(xì)胞系分離到的圓環(huán)病毒命名為PCV1，而引起豬群發(fā)病的圓環(huán)病毒命名為PCV2[2]。PCV2呈二十面體對稱，無囊膜，直徑約12 nm～23 nm，為單股環(huán)狀DNA病毒，是目前已知最小的動物病毒[3]。PCV2主要含ORF1、ORF2、ORF3等開放閱讀框，ORF1編碼rep蛋白，與病毒的復(fù)制相關(guān)[4]。ORF2基因位于基因組的反向鏈，起始密碼子位于第1 033位核苷酸或第1 034位核苷酸，702個堿基編碼的Cap蛋白由243個氨基酸組成，分子質(zhì)量大小約為27.8 ku。Cap蛋白是病毒的主要免疫原性蛋白，對疾病診斷和疫苗學(xué)的研究具有非常重要的意義[5-6]。ORF3編碼的蛋白可能在致病性方面扮演重要角色[7]。

2001年McNeilly F等[8]最早利用PCV2的全病毒制備PCV2的單克隆抗體,并成功建立ELISA方法鑒定PCV2。在我國,2005年也開始研究PCV2的單克隆抗體，商紹彬等[9]利用原核表達(dá)的Cap蛋白制備出與PCV2具有中和作用的單克隆抗體。近年來，關(guān)于PCV2單克隆抗體的研究逐步增多，但多數(shù)研究是針對于Cap蛋白的單克隆抗體。2014年翟淑燕等[10]以純化的PCV2作為免疫原，得到Cap的單克隆抗體，且與PCV2具有中和作用。2014年曲信芹等[11]利用重組桿狀病毒表達(dá)的Cap蛋白作為免疫原,獲得針對PCV2 Cap的單克隆抗體。此外，有很多利用原核系統(tǒng)表達(dá)的Cap蛋白，制備的PCV2單克隆抗體。目前針對Cap蛋白的單克隆抗體有大量的研究，為PCV2抗原表位分析和致病機(jī)理提供了一定的基礎(chǔ)。本研究通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PCV2 Cap蛋白制備特異性針對PCV2的單克隆抗體，為PCV2的快速檢測與診斷以及抗原變異提供了物質(zhì)基礎(chǔ)和條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細(xì)胞及動物 AC-ORF2重組桿狀病毒、pET28a-ORF2(缺失NLS核定位信號序列)質(zhì)粒、SP2/0細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞Sf9，本實驗室(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)錢平課題組)保存;PCV2 KQ22病毒，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)何啟蓋教授提供;6周齡雌性Balb/c小鼠,購自湖北省疾病預(yù)防控制中心。

1.1.2 試劑 1640培養(yǎng)基,HyClone公司產(chǎn)品;PEG4000、HAT(HT)培養(yǎng)基干粉、淋巴細(xì)胞分離液、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，Sigma公司產(chǎn)品；HRP羊抗鼠IgG，碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；ELISA顯色液及終止液，武漢科前生物股份有限公司產(chǎn)品；Cy3 Goat Anti-Mouse IgG，ABclonal公司產(chǎn)品；SuperSignal Chemiluminescent Substrates顯色液、Pierce○RRapid ELISA Mouse mAb Isotying Kit，Thermo公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 ORF2重組蛋白的表達(dá)及純化 將AC-ORF2桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞，表達(dá)獲得PCV2 ORF2重組蛋白。利用層析柱(superdex 200 prep grade)和超濾管濃縮的方法純化PCV2 ORF2重組蛋白，通過120 g/L SDS-PAGE檢測PCV2 ORF2重組蛋白，獲得高純度的目的蛋白，用于小鼠的免疫。

1.2.2 動物免疫 選擇6周齡SPF雌性Balb/c 小鼠，將100 μg PCV2 ORF2重組蛋白與等體積佐劑乳化后,通過頸背部皮下兩點注射方式進(jìn)行首次免疫，14、28 d時以相同的劑量分別進(jìn)行第2、3次免疫。在融合前3 d將100 μg PCV2 ORF2重組蛋白通過腹腔注射方式,加強(qiáng)免疫1次，3 d后取小鼠脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合試驗。

1.2.3 細(xì)胞融合及亞克隆 取免疫小鼠的脾臟制備脾細(xì)胞，將脾細(xì)胞與SP2/0瘤細(xì)胞按5∶1比例進(jìn)行細(xì)胞融合，用含有飼養(yǎng)細(xì)胞的HAT培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)7 d。融合成功的雜交瘤細(xì)胞換HT培養(yǎng)基培養(yǎng)至11 d時,通過間接ELISA篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，并采用有限稀釋法將陽性雜交瘤細(xì)胞稀釋至每孔細(xì)胞數(shù)≤1時進(jìn)行亞克隆。

1.2.4 免疫印跡檢測 將原核系統(tǒng)表達(dá)的缺失NLS的PCV2 ORF2重組蛋白以及桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的PCV2 ORF2重組蛋白作為抗原，進(jìn)行Western blot檢測。50 g/L脫脂牛奶室溫封閉3 h；加適量的雜交瘤細(xì)胞的上清為一抗，室溫孵育1 h，PBST洗3遍；進(jìn)而加入適量的HRP羊抗鼠IgG(1∶5 000)為二抗，室溫孵育1 h，PBST洗3遍后,加適量Super Signal Chemiluminescent Substrates顯色液，在Bio-Rad照膜儀上進(jìn)行觀察。

1.2.5 間接免疫熒光檢測 將Sf9細(xì)胞接至48孔板，待細(xì)胞長至80%～90%后，以1 MOI接種AC-ORF2重組桿狀病毒，培養(yǎng)72 h，洗3遍，加固定液(甲醇∶丙酮=1∶1)100 μL，-20℃固定30 min，洗3遍。加10 g/L PBSA 100 μL室溫封閉1 h，洗3遍；雜交瘤細(xì)胞上清為一抗，37℃孵育1 h后，洗5遍；避光加Cy3 Goat Anti-Mouse IgG 抗體1∶100稀釋，每孔加100 μL，37℃孵育1 h，PBS洗5遍，在倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.6 特異性試驗 將PK-15細(xì)胞接至48孔板，同步接PCV2 KQ22病毒，24 h后待細(xì)胞長至90%時，用D-氨基葡萄糖處理20 min，換細(xì)胞維持液培養(yǎng)細(xì)胞48 h,進(jìn)行間接免疫熒光試驗[12]。

1.2.7 抗體的亞型鑒定 用Thermo公司Pierce○RRapid ELISA Mouse mAb Isotying Kit試劑盒進(jìn)行抗體亞型鑒定，按說明書的步驟進(jìn)行。

1.2.8 單克隆抗體腹水的制備 選用動物體內(nèi)誘生腹水的方法。選取8周齡～10周齡的雌性Balb/c小鼠，腹腔注射0.5 mL不完全弗氏佐劑進(jìn)行刺激；7 d～10 d后收集擴(kuò)大培養(yǎng)的陽性雜交瘤細(xì)胞105～106個接種于小鼠腹腔內(nèi)，7 d～10 d后收集小鼠腹水,用間接ELISA測定小鼠腹水效價。

1.2.9 雜交瘤細(xì)胞染色體計數(shù) 將雜交瘤細(xì)胞傳代后培養(yǎng)至48 h(對數(shù)期)，在細(xì)胞上清中添加終濃度為0.6 μg/mL的秋水仙素，置于37℃體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，將細(xì)胞離心，用37℃預(yù)熱的0.075 mol/L KCl 5 mL重懸細(xì)胞沉淀，37℃、靜置30 min，加固定液(甲醇∶冰醋酸=1∶3)處理細(xì)胞，取2滴細(xì)胞至載玻片上，吹散，自然干燥，100 g/L Giemsa染色液染色10 min，單蒸水洗去染色液后自然晾干，顯微鏡下觀察染色體形態(tài)并計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 蛋白純化分析

通過重組桿狀病毒表達(dá)的PCV2 ORF2蛋白，用層析柱和超濾管的方法純化濃縮PCV2 ORF2重組蛋白，SDS-PAGE 的方法檢測，結(jié)果顯示有一條27.5 ku的特異條帶，與預(yù)期大小一致(圖1)。經(jīng)薄層掃描分析蛋白純度達(dá)到90%以上，達(dá)到免疫要求。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.純化后重組蛋白M.Protein molecular weight Marker;1.Purified recombinant protein圖1 純化后重組蛋白的SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of purified recombinant protein

2.2 陽性抗體篩選結(jié)果

將免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合后7 d,觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，對長出雜交瘤細(xì)胞的孔補(bǔ)加HT培養(yǎng)基，以減少假陽性孔的出現(xiàn)。用純化的PCV2 ORF2重組蛋白作為包被蛋白，通過方陣滴定法，確定最佳包被濃度為0.125 μg/mL，間接ELISA篩選出陽性雜交瘤細(xì)胞后，采用有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆，最終得到4株穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為1H9、4C11、5B8和4F12。

2.3 蛋白免疫印跡分析

以原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的缺失NLS的PCV2 ORF2重組蛋白，以及桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)PCV2 ORF2重組蛋白作為待檢樣品。1H9、4C11、5B8和4F12株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗檢測PCV2 ORF2重組蛋白。結(jié)果顯示，1H9株和4C11株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體不與PCV2 ORF2重組蛋白作用，5B8和4F12株雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體與PCV2 ORF2重組蛋白作用(圖2)。

2.4 蛋白間接免疫熒光分析

以1 MOI AC-ORF2重組桿狀病毒接種48孔板Sf9細(xì)胞72 h后，進(jìn)行IFA試驗，結(jié)果顯示，4C11、1H9、5B8和4F12株抗體與重組桿狀病毒AC-ORF2的細(xì)胞有較強(qiáng)的紅色熒光，而空白對照的細(xì)胞無紅色熒光，表明4株抗體能與Cap蛋白具有良好的反應(yīng)(圖3)。

2.5 病毒間接免疫熒光分析

用PCV2 KQ22病毒為抗原，分別以4C11、1H9、5B8和4F12株分泌的抗體為一抗，以FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，在熒光顯微鏡下觀察,結(jié)果顯示，只有4F12有較強(qiáng)的綠色熒光，而空白對照的細(xì)胞無綠色熒光。表明4F12株是特異性針對PCV2的單克隆抗體(圖4)。

2.6 抗體亞型的測定

用Thermo公司Pierce○RRapid ELISA Mouse mAb Isotyping Kit試劑盒進(jìn)行抗體亞型鑒定，結(jié)果顯示,1H9、4C11、5B8 3種抗體亞型輕鏈都為IgG1，重鏈均為Kappa，4F12抗體亞型輕鏈都為IgG2b，重鏈均為Kappa，此4株亞型的抗體比較容易純化和長時間保存。

2.7 抗體效價的測定

以0.125 μg/mL的PCV2 ORF2重組蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板，用間接ELISA檢測雜交瘤細(xì)胞上清和小鼠腹水效價,結(jié)果顯示，4C11、1H9、5B8、4F12株細(xì)胞上清效價分別為1∶256、1∶2 048、1∶8 192、1∶4 096；小鼠腹水效價分別為1∶104、1∶105、1∶106、1∶105，4株抗體效價都達(dá)到較高的水平。

2.8 染色體計數(shù)結(jié)果

SP2/0、1H9、4C11、5B8和4F12株5種細(xì)胞染色體數(shù)分別為64、93、94、127、97對。分析發(fā)現(xiàn)，1H9、4C11和4F12這3株雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)大約是SP2/0細(xì)胞和脾細(xì)胞染色體數(shù)的和，5B8株雜交瘤細(xì)胞的染色體數(shù)為SP2/0細(xì)胞與2個脾細(xì)胞染色體數(shù)的和。說明雜交瘤細(xì)胞的融合成功。

A.4C11；B.1H9；C.5B8；D.5F12
M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.Sf9細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白;2.原核表達(dá)的缺失重組蛋白；3.Sf9細(xì)胞對照
M.Protein molecular weight Marker;1.Recombinant protein in Sf9 cells;2.Recombinant protein in prokaryotic cells;3.Sf9 cell control
圖2抗體的免疫印跡檢測
Fig.2 Western blot of detection antibodies

A.桿狀病毒與4C11檢測；B.Sf9細(xì)胞與4C11檢測；C.桿狀病毒與1H9檢測；D.Sf9細(xì)胞與1H9檢測；E.桿狀病毒與5B8檢測；F.Sf9細(xì)胞與5B8檢測；G.桿狀病毒與4F12檢測；H.Sf9細(xì)胞與4F12檢測
A.AC-ORF2 and 4C11;B.Sf9 cell and 4C11;C.AC-ORF2 and 1H9;D.Sf9 cell and 1H9;E.AC-ORF2 and 5B8;F.Sf9 cell and 5B8;G.AC-ORF2 and 4F12;H.Sf9 cell and 4F12
圖3抗體與重組蛋白的間接免疫熒光檢測
Fig.3 IFA of recombinant protein and antibodies

A.豬圓環(huán)病毒與4C11；B.豬腎細(xì)胞與4C11；C.豬圓環(huán)病毒與1H9；D.豬腎細(xì)胞與1H9；E.豬圓環(huán)病毒與5B8；F.豬腎細(xì)胞與5B8；G.豬圓環(huán)病毒與4F12；H.豬腎細(xì)胞與4F12
A.PCV2 and 4C11;B.PK-15 cell and 4C11;C.PCV2 and 1H9;D.PK-15 cell and 1H9;E.PCV2 and 5B8;F.PK-15 cell and 5B8;G.PCV2 and 4F12;H.PK-15 cell and 4F12
圖4抗體與豬圓環(huán)病毒的間接免疫熒光檢測
Fig.4 IFA of PCV2 and antibodies

3 討論

PCV2目前仍在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，沒有得到完全控制[13-14]，而在我國PCV2仍舊嚴(yán)重制約著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[15]，PCV2可以在短時間內(nèi)快速傳播，且缺少快速簡便的診斷方法。由于PCV2特殊的生物學(xué)特性，不易引起細(xì)胞病變，且在細(xì)胞上增殖滴度較低，使傳統(tǒng)的滅活疫苗和弱毒疫苗制備的難度加大。PCV2的核衣殼蛋白Cap亞單位疫苗的研究難度相對較低，并且亞單位疫苗安全性高，且易于規(guī)模化生產(chǎn)。鑒于Cap蛋白是PCV2的主要免疫原性蛋白，本研究利用PCV2 ORF2重組蛋白作為免疫原，制備針對PCV2的單克隆抗體，相對于PCV2全病毒作為免疫原，更容易篩選到針對PCV2 Cap蛋白的單克隆抗體。

單克隆抗體制備過程中，小鼠免疫和雜交瘤細(xì)胞的篩選至關(guān)重要，要避免在小鼠產(chǎn)生免疫耐受和抗體效價偏低時進(jìn)行融合試驗；間接ELISA篩選特異性單克隆抗體過程中，要避免假陽性的出現(xiàn)。本研究在細(xì)胞融合前，對免疫小鼠血清抗體效價進(jìn)行檢測，達(dá)到104以上進(jìn)行融合試驗。間接ELISA篩選利用PCV2 ORF2重組蛋白和Sf9細(xì)胞作為陰性對照，分別包被酶標(biāo)板，選取PCV2 ORF2重組蛋白OD值較高，且Sf9細(xì)胞對照組OD值較低的為特異性針對PCV2 ORF2的單克隆抗體。以此兩方面，保證篩選到針對PCV2的特異性單克隆抗體。

本研究獲得4株針對PCV2 ORF2重組蛋白的特異性單克隆抗體，其中4C11株和1H9株用IFA可以檢測到PCV2 ORF2重組蛋白，說明此兩株單克隆抗體是針對PCV2 ORF2的構(gòu)象表位，5B8和4F12株可以用IFA和Western blot檢測PCV2 ORF2重組蛋白，說明此株單克隆抗體針對的是PCV2 ORF2的線性表位，而4F12株抗體不僅能與Cap蛋白作用，而且還能與PCV2 KQ22病毒用IFA檢測，其具體針對的抗原表位有待進(jìn)一步研究。本試驗利用重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Cap蛋白且無標(biāo)簽，用過層析柱的方法得到純度較高的PCV2病毒樣粒子蛋白免疫小鼠，使得較容易篩選到與PCV2作用的單克隆抗體，但也可能在純化過程中使得部分抗原二級結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致部分得到的單克隆抗體只能與變性的蛋白反應(yīng)，而不與天然結(jié)構(gòu)的病毒反應(yīng)。本研究獲得的1H9、4C11、5B8和4F12單克隆抗體為進(jìn)一步研究ORF2基因的功能和建立PCV2感染的檢測技術(shù)奠定了一定基礎(chǔ)。

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PreparationandIdentificationofMonoclonalAntibodiesagainstORF2ofPorcineCircovirusType2

AN Chun-jing1,2,LI Xiang-min2,ZHANG Hua-wei2,MO Hong-fang2,GUO Xia-yang2,ZHAO Ze-kai2,QIAN Ping2,ZHAO Xiao-ling1

(1.DepartmentofAnimalScienceandTechnology,CollegeofAgricultureandAnimalHusbandry,TibetUniversity,Linzhi,Tibet,860000,China;2.StateKeyLaboratoryofAgricultureMicrobiology,HuazhongAgricultureUniversity,Wuhan,Hubei,430070,China)

In order to prepare monoclonal antibodies(mAb)against porcine circovirus type 2 (PCV2),ORF2 protein of PCV2 was expressed by baculovirus expression system as an immunogen and purified by column chromatography and ultrafiltration tube.The SPF female Balb/c mice were immunized with purified ORF2 proteins.After three times immunization,the spleen cells of the immunized mice were isolated and fused with SP2/0 cells.Hybridoma colonies were screened for mAb against ORF2 by indirect ELISA.Finally,four anti-ORF2 mAb were successfully generated and named as 1H9,4C11,5B8 and 4F12,respectively.All four mAb can recognize ORF2 specifically by Western blot and immunofluorescence assay (IFA).The 4F12 mAb was specifically reacted with ORF2 by IFA.The subtypes of the 1H9,4C11,5B8 mAbs were IgG1/κappa,4F12 mAb were IgG2b/κappa and ascites titers were 105,104,106and 105,respectively.In conclusion,the specific mAbs against PCV2 ORF2 were successfully prepared.

Porcine circovirus type 2；ORF2 protein；monoclonal antibody

S852.4;S852.659.2

A

1007-5038(2017)10-0032-06

2017-01-15

廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)(桂科合14125008-1-18)；華中農(nóng)業(yè)大學(xué)自主科技創(chuàng)新基金(2662016PY003，2662016PY004)

安春敬(1990-)，女，河北邢臺人，碩士研究生，主要從事動物病毒學(xué)研究。*