牛IgG Fc片段與FnBPB-ClfA串聯(lián)表達(dá)及其對金黃色葡萄菌性奶牛乳腺炎的免疫效果

崔 健，郝永清，趙紅梅，杜 琳，李松建

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

牛IgG Fc片段與FnBPB-ClfA串聯(lián)表達(dá)及其對金黃色葡萄菌性奶牛乳腺炎的免疫效果

崔 健，郝永清*，趙紅梅，杜 琳，李松建

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

為了提高金黃色葡萄球菌(S.aureus)黏附素FnBPB-ClfA基因表達(dá)蛋白對奶牛的免疫效力，應(yīng)用RT-PCR擴(kuò)增奶牛IgG Fc基因片段與構(gòu)建的金黃色葡萄球菌(S.aureus)FnBPB-ClfA黏附素基因串聯(lián)構(gòu)建質(zhì)粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA，并通過雙酶切將其克隆于pET32a(+),以構(gòu)建質(zhì)粒pET32a-Fc-FnBPB-ClfA并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。以鹽酸左旋咪唑(LH)或氫氧化鋁(ALUM)為佐劑,與純化的重組蛋白( bFc-FnBPB-ClfA)混合以首次免疫肌肉注射，加強(qiáng)免疫乳頭管灌注或首次免疫、二次免疫及三次免疫均以肌肉注射方式免疫臨近干奶期的奶牛。用間接ELISA和Western blot對各組牛血清中的抗體進(jìn)行監(jiān)測，評價(jià)免疫效果。結(jié)果顯示，以LH為佐劑免疫的(A組)牛21 d時(shí)抗體水平最高，可達(dá)到1∶1 600；而以ALUM為佐劑免疫的B組和C組抗體水平分別為1∶800和1∶400。IgG水平動(dòng)態(tài)監(jiān)測結(jié)果表明，以LH為佐劑免疫牛的血清中特異性抗體上升趨勢明顯高于其他免疫組。研究結(jié)果表明，以首次免疫肌肉注射，加強(qiáng)免疫乳頭管灌注的方式較好，并且bFc-FnBPB-ClfA與LH佐劑混合后免疫奶牛能最有效激發(fā)奶牛免疫反應(yīng)。

金黃色葡萄球菌；奶牛IgG Fc；重組蛋白Fc-FnBPB-ClfA

隨著人民生活水平的快速提升，人們對牛奶品質(zhì)的要求也上升到了一個(gè)新的高度，奶牛乳腺炎則是限制乳品質(zhì)量的重要一環(huán)。由金黃色葡萄球菌(S.aureus)所引發(fā)的奶牛乳腺炎是影響奶牛業(yè)發(fā)展、阻礙牛奶品質(zhì)提升的嚴(yán)重疾病[1]。多年來，防治乳腺炎的措施主要是乳頭藥浴和抗菌藥物注射，抗菌藥物治療的成功與否不但與感染病原菌的種類和感染程度有關(guān)[2]，而且這種方法長期使用會使細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性以及導(dǎo)致乳品中抗菌藥物的殘留。所以，尋找更好更安全的途徑和方法控制乳房炎的流行已成為奶牛業(yè)發(fā)展的迫切需求[3]。由于奶牛乳腺特殊的解剖學(xué)特性，致使其容易受到病原微生物的侵入而發(fā)生炎癥，也使得奶牛乳腺炎的防治成為世界性難題。在美國和歐洲的牛場使用的J5疫苗在降低革蘭陰性菌引發(fā)的乳房炎的嚴(yán)重性上有一定效果[4]。

有研究表明，金黃色葡萄球菌黏附上皮細(xì)胞或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白被認(rèn)為是早期感染的關(guān)鍵[5]。其中纖連結(jié)合蛋白B (fibronection-binding protein B，F(xiàn)n-BPB) 是金黃色葡萄球菌的一種重要抗原[6-7]，其在研究金黃色葡萄球菌致病性及亞單位疫苗中有很重要的地位[8]。凝集因子A (clumping factor A， ClfA) 是S.aureus黏附于奶牛乳腺上皮細(xì)胞并引起乳腺炎所必需的黏附因子[9-10]。本研究將IgG的Fc基因片段克隆后與FnBPB-ClfA基因進(jìn)行串聯(lián)，經(jīng)原核表達(dá)制備Fc-FnBPB-ClfA重組蛋白，通過免疫臨產(chǎn)期奶牛，比較其免疫效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株質(zhì)粒S.aureusD4陽性菌株、pET-FnBPB-ClfA重組質(zhì)粒及表達(dá)載體pET-32a(+),內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)鑒定后保存。

1.1.2 主要試劑 pMD19-T Simple Vector、QuickCutEcoRⅠQuickCutXhoⅠ、RNA iso Plus、DNA Marker DL 2 000、T4 DNA Ligase ，TaKaRa 公司產(chǎn)品；2×EasyTaqPCR SuperMix、Trans1-T1感受態(tài)、蛋白Marker、BCA蛋白定量試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；鋁膠鹽水、聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，Millipore公司產(chǎn)品；牛外周血淋巴細(xì)胞分離液，天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 牛IgG Fc片段的PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中公布的牛IgG1重鏈基因序列(x62916.1)，利用Primer5.0設(shè)計(jì)一對擴(kuò)增IgG Fc段基因的上、下游引物，F(xiàn)c-f：5′-CACGAATTCATGGTTGATCCCACATGCAAACCAT-3′(EcoR Ⅰ)/Fc-r：5′-agatccgccacctccTTTACCCGCAGACTTAGAGGT-3′(小寫字母為Linker)。

采集新鮮牛血提取牛淋巴細(xì)胞并從淋巴細(xì)胞中提取總RNA，通過RT-PCR，擴(kuò)增牛的IgG Fc片段。將PCR產(chǎn)物回收純化。送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.2 牛IgG Fc片段與S.aureusFnBPB-ClfA的串聯(lián) 參照文獻(xiàn)[5-7]，將測序正確的牛IgG Fc基因片段利用Fc片段的上游引物Fc-f和FnBPB-ClfA片段的下游引物5′-CCGCTCGAGTTACTCATCAGGTTGTTCAGG-3′(XhoⅠ)，通過SOE-PCR將Fc片段與已構(gòu)建的FnBPB-ClfA基因片段進(jìn)行串聯(lián)[11-13]，擴(kuò)增Fc-FnBPB-ClfA融合基因。將Fc-FnBPB-ClfA基因與pMD19T載體連接，轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定，篩選陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pMD19-T-Fc-FnBPB-ClfA。

1.2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將重組質(zhì)粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA和pET32a(+)通過EcoRⅠ和XhoⅠ分別進(jìn)行雙酶切，回收目的基因和載體片段，以T4 DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)。提取質(zhì)粒pET32a-Fc-FnBPB-ClfA，通過菌液PCR對其進(jìn)行初篩，選取陽性的重組質(zhì)粒再用EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，并選取陽性結(jié)果送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.4 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將含有pET32a-Fc-FnBPB-ClfA的重組菌接種于LB Amp+的液體培養(yǎng)基中，以含有空質(zhì)粒pET32a(+)的重組菌作為陰性對照，35℃ 175 r/min 培養(yǎng)，當(dāng)菌液 OD 600 nm值達(dá)0.3～0.7時(shí)，加IPTG至終濃度為0.6 mmol/L 35℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)過夜。利用鎳層析柱進(jìn)行蛋白純化，取適量誘導(dǎo)表達(dá)菌液及純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)R250染色并脫色后觀察。BCA蛋白定量試劑盒測定純化后的蛋白濃度。

1.2.5 疫苗的制備

1.2.5.1 鋁鹽佐劑疫苗的制備 將鋁鹽佐劑(ALUM)與測定終濃度的蛋白以體積比1∶1方式配比，搖床振蕩17 min，充分混勻，得到鋁鹽佐劑疫苗。

1.2.5.2 鹽酸左旋咪唑佐劑疫苗的制備 將鹽酸左旋咪唑用滅菌的PBS溶解至濃度為10 mg/mL的鹽酸左旋咪唑溶液，后用0.22 μm的無菌濾器過濾除菌，即得到10 mg/mL鹽酸左旋咪唑佐劑(10 mg/mL LH)，將其與1.2.5.1所述蛋白以體積比1∶1方式配比，充分混勻，即為10 mg/mL鹽酸左旋咪唑佐劑疫苗。

1.2.6 動(dòng)物分組及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.6.1 動(dòng)物分組及免疫 將60頭臨近干奶期并且經(jīng)CMT檢測的隱性乳房炎奶牛隨機(jī)分為A、B、C、D 4組，每組15頭，每次以蛋白量5 mg/頭進(jìn)行注射免疫。A組(LH組)注射鹽酸左旋咪唑佐劑疫苗，首次肌肉注射免疫，加強(qiáng)免疫乳頭管灌注；B組(ALUM組)注射鋁鹽佐劑疫苗，免疫方法同A組；C組(Muscle組)注射鋁鹽佐劑疫苗，進(jìn)行3次肌肉免疫；D組(PBS組)為對照組。每次采血從各組中隨機(jī)采集5頭牛的血分離血清。免疫時(shí)間及部位見表1。

1.2.6.2 血清中特異性抗體動(dòng)態(tài)監(jiān)測 以1.2.4所述蛋白作為抗原，用滅菌PBS稀釋，每孔0.5 μg包被ELISA板，以各組免疫后0、14、21、28、60 d的呈梯度稀釋的奶牛血清為一抗，兔抗牛的HRG-IgG(1∶4 000)為二抗， TMB顯色液顯色，測定其OD 450 nm值，用間接ELISA監(jiān)測牛血清中抗體變化；將待檢血清倍比稀釋至1∶100～1∶3 200兔抗牛的HRG-IgG(1∶4 000)為二抗，對各組的特異性抗體進(jìn)行間接ELISA檢測。以P/N≥2.1(P為試驗(yàn)組血清，N為對照組血清)作為陽性臨界值的判定。

表1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理方式Table 1 Experimental animal treatment modes

注：◆表示免疫時(shí)間，◎表示采集血液。
Note：◆Means immune time，◎Means blood collection.

1.2.6.3 Western blot檢測 將目的蛋白與蛋白SDS-PAGE上樣緩沖液混合，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，以50 g/L脫脂乳為封閉液進(jìn)行封閉8 h，PBST洗4次，每次15 min；用1∶200稀釋的抗體滴度最高的免疫牛血清為一抗，4℃孵育過夜；PBST洗，方法同上，兔抗牛IgG-HRP二抗(1∶4 000)室溫1 h 30 min；PBST洗，同上；ECL顯色并觀察。

2 結(jié)果

2.1 融合基因Fc-FnBPB-ClfA的擴(kuò)增和重組質(zhì)粒的構(gòu)建

提取牛的外周血淋巴細(xì)胞提取的總RNA (圖1)，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，在699 bp左右有明顯條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)。以牛IgG Fc和FnBPB-ClfA兩段片段為模板，利用Fc基因的上游引物以及基因FnBPB-ClfA基因的下游引物，通過SOE-PCR將以上兩段基因擴(kuò)增串聯(lián)。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在2 000 bp左右有明顯條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，經(jīng)測序，目的基因全長2 130 bp，與設(shè)計(jì)一致(圖3)。將重組質(zhì)粒pMD19T-Fc-FnBPB-ClfA及pET32a(+)用EcoRⅠ和XhoⅠ分別進(jìn)行雙酶切(圖4)，將Fc-FnBPB-ClfA融合基因克隆于pET32a(+)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a-Fc-FnBPB-ClfA。經(jīng)測序，重組質(zhì)粒中Fc片段序列與GenBank中B.taurus基因序列(x62916.1)完全一致；FnBPB片段與參考株S.aureus(CP003979.1)及ClfA片段與S.aureus(JQ278699.1)相應(yīng)序列的同源性均為99%,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 血清中抗體效價(jià)檢測結(jié)果

采用間接ELISA，分別對免疫組及對照組0、14、21、28、60 d的牛血清中抗體進(jìn)行測定(表2)。對加強(qiáng)免疫后7 d的牛血清進(jìn)行抗體效價(jià)檢測，每組3個(gè)平行，取平均值。結(jié)果顯示，A組牛的血清抗體效價(jià)均可達(dá)1∶1 600(圖5)，表明A組的免疫效果優(yōu)于其他組。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.總RNAM.DNA Marker DL 2 000;1.Total RNA圖1 總RNA產(chǎn)物電泳Fig.1 Electrophoresis of total RNA products

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～4.Fc基因M.DNA Marker DL 2 000;1-4.Fc gene圖2 Fc基因的PCR擴(kuò)增Fig.2 PCR amplification of Fc gene

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～6.Fc PCR產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2 000;1-6.PCR products of Fc-FnBPB-ClfA gene圖3 Fc-FnBPB-ClfA的PCR擴(kuò)增Fig.3 SOE-PCR amplification of Fc-FnBPB-ClfA gene

M1.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000；M2.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1、2.pET32a- Fc-FnBPB-ClfAEcoR Ⅰ/ Xho ⅠM1.DNA Marker DL 15 000；M2.DNA Marker DL 2 000；1,2.pET32a- Fc-FnBPB-ClfAEcoR Ⅰ/ Xho Ⅰ圖4 重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-Fc-FnBPB-ClfA的雙酶切鑒定Fig.4 Identification of plasmid pET32a-Fc-FnBPB-ClfA by enzyme digestion

表2 牛血清抗體測定結(jié)果Table 2 Determination results of bovine serum antibodies

圖5 免疫血清IgG抗體水平Fig.5 Dynamics of the antibody levels in sera of cows immunized with Fc-FnBPB-ClfA

由表2可以看出，各組中經(jīng)首免、加強(qiáng)免疫或3次免疫后，其特異性抗體的水平在28 d前,隨著時(shí)間呈現(xiàn)遞增趨勢，28 d后特異性抗體含量緩慢下降。其中A組奶牛的血清中特異性IgG含量在達(dá)到峰值時(shí)含量最高且下降時(shí)要比C組的奶?？贵w含量下降緩慢，與對照組相比差異極顯著(P<0.01) ；C組測得的光密度值與對照組比較差異顯著(P<0.05)，僅次于A組光密度值；B組測得的光密度值與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

2.3 Western blot檢測結(jié)果

以優(yōu)化的條件對蛋白進(jìn)行大量表達(dá)，收集蛋白上清液，純化上清中的可溶性目的蛋白，其蛋白分子質(zhì)量為78 ku。用Western blot對以LH為佐劑的疫苗免疫奶牛后采集14 d、21 d的血清及對照組血清進(jìn)行了免疫學(xué)分析，結(jié)果見圖6和圖7。

3 討論

Fc受體(Fc receptor，F(xiàn)cRn)首次發(fā)現(xiàn)于嚙齒類動(dòng)物的腸上皮細(xì)胞中[14]，且能在反芻動(dòng)物、嚙齒動(dòng)物及人的乳腺中表達(dá)。FcRn是識別IgG Fc片段的特異性受體，也是跨黏膜屏障轉(zhuǎn)運(yùn)IgG的唯一受體[15]。潘海婷等[16]研究證明,克隆大鼠IgG Fc基因與FnBPB-ClfA基因串聯(lián)表達(dá)蛋白對大鼠進(jìn)行免疫，效果優(yōu)于用FnBPB-ClfA單獨(dú)免疫大鼠。并且于乳頭管免疫的效果要優(yōu)于肌肉免疫。本試驗(yàn)以提取的奶牛外周血淋巴細(xì)胞中提取總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板克隆奶牛IgG Fc片段，通過SOE-PCR與帶有Linker序列的FnBPB-ClfA基因串聯(lián)，構(gòu)建質(zhì)粒pET32a-Fc-FnBPB-ClfA，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)并純化后的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳及Western blot分析可知，bFc-FnBPB-ClfA有良好的免疫活性，將其作為疫苗與不同佐劑(LH、ALUM)混合,并以不同途徑免疫注射奶牛，各組中以方式A進(jìn)行免疫的牛血清效價(jià)在21 d時(shí)可達(dá)到1∶1 600，并且血清中IgG的含量呈上升趨勢，遞增趨勢優(yōu)于其他免疫方式。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1.Fc-FnBPB-ClfA洗脫上清液M.Protein molecular weight Marker;1.Eluant of Fc-FnBPB-ClfA supernatant圖6 目的蛋白Fc-FnBPB-ClfA的SDS-PAGE檢測Fig.6 SDS-PAGE result of Fc-FnBPB-ClfA protein

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.陰性對照；2.14 d血清；3.21 d血清M.Protein molecular weight Marker;1.Negative control；2.14 d serum；3.21 d serum圖7 重組目的蛋白的Western blot檢測Fig.7 Western blot test of target protein

奶牛乳頭管是感染S.aureus的首要部位，將疫苗通過乳頭管灌注到乳房內(nèi)部，即免疫乳腺的途徑，能夠更直接增強(qiáng)宿主抵御病原微生物的能力。Fc基因片段能夠與乳腺上皮細(xì)胞中的FcRn特異性結(jié)合，介導(dǎo)黏膜免疫，通過FcRn的胞轉(zhuǎn)作用將抗原復(fù)合物轉(zhuǎn)運(yùn)至基底層，穿越上皮屏障，使抗原與抗原遞呈細(xì)胞等發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生有效的局部免疫反應(yīng)。同時(shí)，F(xiàn)cRn可以保護(hù)IgG，維持血液中高抗體濃度循環(huán)，避免其被降解，延長血清中IgG半衰期。因此，將Fc-FnBPB-ClfA通過乳頭管免疫奶牛能對S.aureus起到更好的防御作用。

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ExpressionofaFusionProteinFc-FnBPB-ClfAofStaphylococcusaureusandItsImmuneEffectagainstCowMastitis

CUI JIan，HAO Yong-qing，ZHAO Hong-mei，DU Lin，LI Song-jian

(LaboratoryofMicrobiologyandImmunology,CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot,InnerMongolia,010018,China)

The cow IgG Fc gene was fused to FnBPB-ClfA gene by SOE-PCR and cloned into pET-32a (+) vector to express the recombinant protein of rFc-FnBPB-ClfA inE.coli.Then the lactating cows were immunized with PBS or purified recombinant protein (bFc-FnBPB-ClfA) with the adjuvant levamisole hydrochloride (LH) or aluminum hydroxide (ALUM).Immunizatioin in the ways of muscle-muscle or muscle-muscle-muscle or muscle-teat canal to the nearly dry period of dairy cows.Indirect ELISA method and Western blot were used to monitor the antibody in the sera of cows in each group.The results showed that the antibody level arrived the highest at 21 d using LH as adjuvant,and could reach 1∶1 600,and the antibody levels of B group and C group were 1∶800 and 1∶400.The results of this study indicatd that bFc-FnBPB-ClfA and LH adjuvant can effectively stimulate immune response in dairy cows.

Staphylococcusaureu；cow IgG Fc gene；fusion protein Fc-FnBPB-ClfA

2017-03-02

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460664)；農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)生態(tài)型現(xiàn)代奶業(yè)生產(chǎn)模式研究與示范項(xiàng)目(2012BAD12B09-02)

崔 健(1992-)，男，黑龍江牡丹江人，碩士研究生，主要從事微生物與免疫學(xué)研究。*

S857.26;S852.611

A

1007-5038(2017)10-0027-06