細(xì)粒棘球絳蟲EgM123基因序列分析及EgM家族基因在蟲體不同發(fā)育階段的差異表達(dá)分析

毛麗萍，王正榮，王 偉，魏玉圓，翟少華，甘尚權(quán)，簡子健*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.省部共建綿羊遺傳改良和健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000)

細(xì)粒棘球絳蟲EgM123基因序列分析及EgM家族基因在蟲體不同發(fā)育階段的差異表達(dá)分析

毛麗萍1，王正榮2，王 偉1，魏玉圓1，翟少華1，甘尚權(quán)2，簡子健1*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.省部共建綿羊遺傳改良和健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000)

對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲EgM123基因進(jìn)行分子克隆和生物信息學(xué)分析，同時(shí)對(duì)EgM家族基因在蟲體不同發(fā)育階段的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行初步研究。采集綿羊肝臟包囊中原頭蚴，提取總RNA，通過RT-PCR獲取EgM123純化的PCR產(chǎn)物，克隆到pGEM-T載體并測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測(cè)分析。以Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，采用SYBR Green real-time RT-PCR技術(shù)，對(duì)不同發(fā)育階段,即其原頭蚴和成蟲的EgM4、EgM9、EgM123的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，EgM123基因ORF為594 bp，編碼197個(gè)氨基酸，蛋白分子質(zhì)量為21.959 ku，等電點(diǎn)為7.94。EgM123蛋白無信號(hào)肽、跨膜螺旋區(qū)和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，是一種親水性的可溶性蛋白質(zhì)，存在23個(gè)磷酸化位點(diǎn)。根據(jù)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，EgM123蛋白主要位于細(xì)胞核內(nèi)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)含α-螺旋9.64%、β-折疊22.84%、無規(guī)則卷曲62.94%。EgM123氨基酸序列中有6個(gè)潛在的抗原表位。RT-qPCR結(jié)果顯示，成蟲階段EgM家族基因表達(dá)量極顯著高于原頭蚴階段。在發(fā)育的同一階段，EgM123基因極顯著高于EgM4、EgM9基因的表達(dá)量。通過EgM家族基因在蟲體不同發(fā)育階段的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，EgM123基因在蟲體成蟲階段高表達(dá)，以期為篩選細(xì)粒棘球絳蟲終末宿主疫苗候選基因提供理論依據(jù)。

細(xì)粒棘球絳蟲；EgM123蛋白；抗原基因；生物信息學(xué)

細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcusgranulosus，Eg)屬帶科(Taenidae)、棘球?qū)?Echinococcus)絳蟲，能夠引起嚴(yán)重的人畜共患病——棘球蚴病(又稱包蟲病)，且呈全球性分布[1-3]。Eg成蟲寄生于犬科食肉動(dòng)物的小腸內(nèi)，感染性蟲卵隨著糞便排出體外，污染環(huán)境，傳播于人和家畜。Eg幼蟲主要寄生于人和其他中間宿主的肝臟(70%)、肺臟(20%)、肌肉和腦組織(10%)[4-5]。犬是棘球蚴的主要傳染源，也是細(xì)粒棘球絳蟲的終末宿主。我國是棘球蚴病高發(fā)國家，其中以新疆、青海、西藏、四川等牧區(qū)發(fā)病率較高[6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年用于包蟲病的治療的費(fèi)用以及畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)損失在30億美元[7]。Zhang W等[8]研究發(fā)現(xiàn)，EgM家族基因?qū)?xì)粒棘球絳蟲終末宿主具有較好的免疫原性，其中EgM123主要分布于成熟細(xì)粒棘球絳蟲的睪丸中，主要調(diào)節(jié)精子的產(chǎn)生和受精后表達(dá)一種蟲卵膜蛋白[9]。目前，對(duì)于終末宿主犬的免疫保護(hù)性抗原[10]尚未明確，研究有效診斷方法及疫苗是包蟲病綜合防控的關(guān)鍵。

本研究以Eg全基因組序列為參考序列，設(shè)計(jì)引物，通過RT-PCR獲得EgM123基因序列，并對(duì)該蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析，同時(shí)比較EgM家族中的EgM4、EgM9、EgM123在細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴和成蟲之間表達(dá)量的差異，為進(jìn)一步研究EgM123基因的蛋白功能，以及疫苗候選靶標(biāo)提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴，采自新疆石河子市牛、羊定點(diǎn)屠宰場(chǎng)。收集綿羊感染細(xì)粒棘球絳蟲的肝臟及肺臟器官，經(jīng)750 mL/L酒精消毒后，采集新鮮的包囊液樣本，置-20℃保存?zhèn)溆谩３上x由新疆畜牧科學(xué)院張壯志研究員惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑和儀器 超純RNA提取試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品； M-MLV Reverse Transcriptase、Stbl3菌種，美國Invitrogen公司產(chǎn)品； pGEM○R-T，美國Promega公司產(chǎn)品； DNA Marker、 PCR反應(yīng)試劑、 LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品； 膠回收試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒，美國Omega公司產(chǎn)品； LightCycler 2.0 PCR，Roche公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 棘球蚴囊液中原頭蚴的形態(tài)學(xué)觀察 從感染綿羊的肝臟及肺臟器官吸取出的囊液，滴加到載玻片上，放置于顯微鏡下觀察原頭蚴形態(tài)特征。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中發(fā)表的相關(guān)EgM4、 EgM9、 EgM123基因序列(GenBank登錄號(hào)：AF482719、AF482720、AF-482718)和Actin基因序列(GenBank登錄號(hào)：L-07775.1)，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)細(xì)粒棘球絳蟲EgM123基因全長ORF基因引物以及特異性的Actin(內(nèi)參基因)、EgM4、EgM9、EgM123基因熒光定量引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

表1 引物與序列Table 1 Primers and sequences

1.2.3 總RNA的提取及cDNA合成 從Eg感染綿羊的肝臟抽取Eg囊液放入1.5 mL的EP管中，置-20℃保存。用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司的Ultrapure RNA kit，提取含有原頭蚴的囊液中RNA，測(cè)定OD 260 nm與OD 280 nm比值在1.8～2.0，置-80℃保存?zhèn)溆?。? μg RNA模板，按照M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒說明書合成cDNA第一鏈，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 EgM123基因全長ORF序列的擴(kuò)增 cDNA模板2 μL，按比例加入PCR反應(yīng)體系：ExTap(5 U/μL) 0.25 μL ，10×ExTapbuffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，上、下游引物各2 μL(10 μmol/L)，加ddH2O 補(bǔ)至50 μL，95℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。 10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR產(chǎn)物，純化、回收PCR產(chǎn)物，并與載體pGEM-T連接。以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Stbl3 感受態(tài)細(xì)胞并接種于抗性的LB/Amp+固體培養(yǎng)基平板中，挑取陽性克隆，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。陽性重組載體命名為pGEM-T-EgM123，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1.2.5 細(xì)粒棘球絳蟲EgM123基因編碼氨基酸序列及生物學(xué)信息分析 利用生物信息學(xué)分析的相關(guān)軟件對(duì)細(xì)粒棘球絳蟲EgM123基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列、蛋白質(zhì)特性及結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；利用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)疏水性/親水性；利用TMHMM Server,v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白質(zhì)跨膜區(qū)；通過SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽；采用NetPhos 2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-2.0/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)；利用COILS Server (http://embnet.vital-it.ch/software/COILS-form.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析；利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat.pl?page=npsa-sop ma.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；采用PHYRE2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/pa ge.cgi?id =index)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用DNA Star 軟件中的Protean進(jìn)行蛋白質(zhì)抗原位表位分析。

1.2.6 SYBR Green Ⅰ相對(duì)熒光定量PCR的建立 采用細(xì)粒棘球絳蟲的原頭蚴、成蟲的cDNA為模板，選用Actin為內(nèi)參基因，以QEg4、QEgM9、QEgM123為引物，按照LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master熒光定量試劑盒的說明書進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)體系20 μL：2×Master Mix 10 μL，F(xiàn)、R(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA 1 μL，無菌水補(bǔ)至8.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95℃ 10 s，65℃ 20 s(收集熒光信號(hào))，72℃ 20 s，45個(gè)循環(huán)；融解曲線：95℃ 5 s，65℃ 1 min，97℃ 0 s；冷卻40℃ 10 s。每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.7 相對(duì)熒光定量PCR數(shù)據(jù)分析 采用Ct法(Qr=2-ΔΔCt)分析EgM4、EgM9、EgM123基因在原頭蚴、成蟲階段中表達(dá)量的差異性。首先計(jì)算出各樣品重復(fù)的平均值，再計(jì)算出不同基因與內(nèi)參基因的Ct值(Ct值=目的基因的Ct值-內(nèi)參基因的Ct值)。選用EgM4基因組作對(duì)照，用其他基因的Ct差值減去EgM4基因組對(duì)照的Ct差值，即為ΔΔCt，然后通過計(jì)算2-ΔΔ Ct來計(jì)算不同基因、不同階段之間mRNA相對(duì)表達(dá)量的差異性，用SPSS 16.0分析軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 棘球蚴囊液中原頭蚴的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

通過顯微鏡觀察，原頭蚴為內(nèi)陷型，外觀呈現(xiàn)大小不等的橢圓形或梨型，頂部可見不規(guī)則圓形的內(nèi)陷孔，尾部有排泄孔(圖1)。

A.細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴(100×)；B.細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴(200×)；a.小鉤；b.排泄孔
A.Echinococcusgranulosusprotoscoleces(100×);B.Echinococcusgranulosusprotoscoleces(200×);a.Hooklet;b.Draining hole
圖1顯微鏡下細(xì)粒棘球絳蟲原頭蚴形態(tài)
Fig.1 Morphology ofEchinococcusgranulosusprotoscoleces under microscope

2.2 細(xì)粒棘球絳蟲EgM123基因擴(kuò)增

利用特異性引物擴(kuò)增EgM123基因序列，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)594 bp的特異性條帶，與預(yù)期大小相一致(圖2)。

2.3 細(xì)粒棘球絳蟲EgM123蛋白的生物信息學(xué)分析

2.3.1 細(xì)粒棘球絳蟲EgM123蛋白理化特性預(yù)測(cè)分析 測(cè)序結(jié)果顯示，EgM123 cDNA全長為594 bp，利用ProtParam tool軟件預(yù)測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲EgM123蛋白分子質(zhì)量為21.959 ku，分子式為C989H1 563N237O280S22，等電點(diǎn)理論值為7.94，編碼197個(gè)氨基酸，其中脯氨酸(Pro)最多，占整個(gè)氨基酸組成的15.2%；精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)、酪氨酸(Tyr)最少，均占0.5%。由于該蛋白不穩(wěn)定參數(shù)為73.3(>40)，因此，EgM123表達(dá)后是一種不穩(wěn)定蛋白。

2.3.2 EgM123蛋白疏水性/親水性預(yù)測(cè)分析 運(yùn)用ExPASy服務(wù)網(wǎng)頁中的Protscale程序預(yù)測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲EgM123編碼蛋白質(zhì)的疏水性(圖3)。蛋白質(zhì)疏水性最大值為1.52，最小值為-2.089，從總體來看，此蛋白親水性/疏水性平均分值為-0.122，表現(xiàn)為親水性，由此可推斷細(xì)粒棘球絳蟲EgM123基因編碼的蛋白質(zhì)是一種可溶性蛋白質(zhì)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1、2.RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物M.DNA Marker DL 2 000;1，2.RT-PCR products圖2 EgM123基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 RT-PCR amplification of EgM123 gene

2.3.3 EgM123基因跨膜區(qū)分析 利用TMHMM Server v.2.0 在線軟件對(duì)EgM123蛋白的跨膜區(qū)域分析顯示細(xì)粒棘球絳蟲EgM123蛋白無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。

2.3.4 EgM123基因信號(hào)肽預(yù)測(cè) 通過signalp 4.1對(duì)EgM123進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)顯示C、S、Y值均不高于閾值，表明EgM123不具有信號(hào)肽酶切位點(diǎn)，說明此蛋白可能為非分泌蛋白。

2.3.5 EgM123基因蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)分析 NetPhos 3.1預(yù)測(cè)分析表明，EgM123蛋白存在23個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中11個(gè)絲氨酸(Ser)磷酸化位點(diǎn)(101、111、125、132、134、149、162、164、165、167、168)、11個(gè)蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)(25、39、47、53、94、118、127、135、139、181、196)，1個(gè)酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(diǎn)(37)(圖4)。

圖3 EgM123蛋白的親/疏水性預(yù)測(cè)Fig.3 Hydrophobicity prediction of EgM123 protein

圖4 EgM123蛋白的磷酸化位點(diǎn)分析Fig.4 Phosphorylation site analysis of EgM123 protein

2.3.6 EgM123蛋白的亞細(xì)胞定位分析 采用TargetP在線軟件預(yù)測(cè)顯示EgM123蛋白主要位于細(xì)胞核(65.2%)，少量分布于細(xì)胞質(zhì)(13%)、線粒體(13%)，表明此蛋白可能主要在細(xì)胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用。

2.3.7 EgM123蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過在線軟件SOPMA預(yù)測(cè)細(xì)粒棘球絳蟲EgM123蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示α-螺旋(h)占9.64%，β-折疊(e)占22.84%，β-轉(zhuǎn)角(t)占4.57%，無規(guī)則卷曲(c)占62.94%(圖5)。通過在線軟件Phyre2預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖6)。

圖5 EgM123 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.5 Prediction of secondery structure of EgM123 protein

圖6 EgM123蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Prediction of 3D structure of EgM123 protein

2.3.8 EgM123蛋白抗原表位預(yù)測(cè)分析 抗原表位是決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)。通過DNAStar軟件對(duì)EgM123氨基酸序列進(jìn)行抗原表位預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，EgM123可能有6個(gè)潛在的抗原表位(23-34、67-75、102-106、114-120、138-142、150-182)區(qū)域，主要集中在67-184位(圖7)。

2.3.9 細(xì)粒棘球絳蟲EgM家族基因在不同時(shí)期表達(dá)量的RT-qPCR結(jié)果 以Actin基因?yàn)楣芗一颉⒃^節(jié)的EgM4作為參照，相對(duì)定量Ct法(Qr=2-ΔΔ Ct)的mRNA表達(dá)量差異性分析表明(圖8)，成蟲階段EgM4、EgM9、EgM123基因表達(dá)量極顯著高于原頭蚴階段，表達(dá)量分別為18、15、36倍。在成蟲階段，EgM123基因極顯著高于EgM4、EgM9基因的表達(dá)量。原頭蚴、成蟲發(fā)育階段各基因均有表達(dá)，但在成蟲階段表達(dá)較為旺盛，尤其EgM123表達(dá)量較高。

圖7 EgM123的抗原表位分析Fig.7 Analysis of antigenic epitopes in EgM123

3 討論

EgM123主要分布于成熟細(xì)粒棘球絳蟲的睪丸中，其次為子宮上皮細(xì)胞，主要調(diào)節(jié)精子的產(chǎn)生和受精后表達(dá)一種蟲卵膜蛋白[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)粒棘球絳蟲的原頭節(jié)感染試驗(yàn)犬35 d后，開始形成受精卵，此階段EgM123基因表達(dá)豐富，推測(cè)它在蟲卵成熟的過程中起決定作用[10]，但對(duì)EgM123基因編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析尚不清楚。本文通過在線軟件對(duì)EgM123基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、疏水性/親水性、跨膜區(qū)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)以及抗原表位的預(yù)測(cè)等分析EgM123基因編碼蛋白質(zhì)功能。就預(yù)測(cè)結(jié)果而言，EgM123基因主要分布在細(xì)胞核，編碼的197個(gè)氨基酸，構(gòu)成了一種不穩(wěn)定的非分泌蛋白。該蛋白有6個(gè)潛在的抗原表位區(qū)域，這是有效的抗原基因必備的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

**表明不同時(shí)期相同基因之間比較差異極顯著(P<0.01)；不同字母表示同一時(shí)期不同基因之間比較差異極顯著(P<0.01)
**Indicate that extremely significant difference between the same gene in different periods (P<0.01);With different letters mean extremely significant difference between the different genes at the same period (P<0.01)
圖8 EgM家族基因在細(xì)粒棘球絳蟲不同發(fā)育階段的mRNA轉(zhuǎn)錄水平
Fig.8 The mRNA transcription levels of EgM genes family in different development stages ofEchinococcusgranulosu

EgM家族基因?qū)?xì)粒棘球絳蟲病終末宿主免疫抗原的研究，Zhang W等[10]利用差異顯著逆轉(zhuǎn)錄PCR(DDRT-PCR)篩選出成熟蟲體與非成熟蟲體差異表達(dá)的基因，即EgM家族基因由24重復(fù)氨基酸序列構(gòu)成，其中EgM4、EgM9、EgM123中重復(fù)序列分別為6、4、5個(gè)，該重復(fù)序列是由正負(fù)電荷交互分布構(gòu)成α螺旋。免疫學(xué)試驗(yàn)證明，EgM基因家族與融合蛋白協(xié)同免疫感染犬后，能持續(xù)產(chǎn)生較高水平的特異性抗體，并被免疫熒光組織化學(xué)定位所證實(shí)[11-15]。通過EgM家族基因表達(dá)載體與谷胱甘肽構(gòu)建融合蛋白，免疫攻蟲犬，其保護(hù)率達(dá)到97%～100%[16]。通過以上研究表明，EgM家族蛋白對(duì)終末宿主具有良好的保護(hù)性。

本研究通過SYBR Green熒光定量PCR，檢測(cè)EgM4、EgM9、EgM123基因在細(xì)粒棘球絳蟲的原頭蚴、成蟲階段mRNA轉(zhuǎn)錄水平。本試驗(yàn)優(yōu)點(diǎn)為：采用SYRB Green Ⅰ熒光標(biāo)記物，無需設(shè)計(jì)探針，具有靈敏度高、操作簡單、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域能夠激發(fā)綠色波長；利用相對(duì)定量方法，以表達(dá)水平相對(duì)穩(wěn)定的管家基因作為內(nèi)參，測(cè)定目的基因的相對(duì)比例；采用Actin為內(nèi)參基因，將EgM家族基因在蟲體不同發(fā)育時(shí)期mRNA表達(dá)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在成蟲階段，EgM4、EgM9、EgM123的表達(dá)較高，尤其是EgM123的表達(dá)量是EgM4、EgM9的2.5倍，這表明EgM123基因是細(xì)粒棘球絳蟲成蟲階段攜帶的主要基因，參與蟲卵成熟階段的調(diào)節(jié)或代謝方面有著重要的調(diào)控，可作為預(yù)防細(xì)粒棘球絳蟲成蟲侵襲的候選基因抗原，但其抗原性與免疫原性、協(xié)同免疫以及免疫方法的研究還有待進(jìn)一步證實(shí)。本研究證實(shí)，EgM123基因在成蟲生長發(fā)育階段表達(dá)旺盛，為了能夠更好地抑制細(xì)粒棘球絳蟲的感染，可以通過抑制終末宿主(犬)排卵來降低細(xì)粒棘球絳蟲病發(fā)生、發(fā)展。

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AnalysesofEgM123GeneSequenceandDifferentialExpressionofEgMGeneFamilyinDifferentDevelopmentStagesofEchinococcusgranulosus

MAO Li-ping1,WANG Zheng-rong2,WANG Wei1,WEI Yu-yuan1,ZHAI Shao-hua1,GAN Shang-quan2,JIAN Zi-jian1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi，Xinjiang，830052，China;2.StateKeyLaboratoryforSheepGeneticImprovementandHealthyProduction，Shihezi，Xinjiang，832000，China)

Molecular cloning and bioinformatics analysis of EgM 123 gene were performed, moreover,the expressions of EgM family genes in different developmental stages at the mRNA level of transcription ofEchinococcusgranulosuswere detected in this study.The hydatid protoscoleces were collected from the ovine livers withEchinococcusgranulosusand the total RNA was extracted as a template.The amplification product of EgM123 gene was obtained by RT-PCR.Then the product was cloned into pGEM-T vector and sequenced.The results of sequence were analyzed to predict its structure and function.Using Actin gene as an internal control,the expressions of EgM4,EgM9 and EgM123 mRNA from the protoscoleces and the adults in the different stages were detected by qPCR.The results showed that the ORF of EgM123 gene contained 594 bp,encoding 197 amino acids.It had a molecular weight of 21.959 ku,and the isoelectric point of 7.94.It is a hydrophilic soluble protein with 23 phosphorylation sites and without signal peptide,transmembrane helix region and a coiled coil structure.The EgM123 protein was mainly located in the nucleus by subcellular localization and secondary structure contained 9.64% of alpha helix,22.84% of beta helix and 62.94% of random coil.The EgM123 had 6 potential antigenic epitopes by the indicated analysis of amino acid sequence.RT-qPCR results showed that the EgM family gene expression was significantly higher at the adult stage.The expression level of EgM123 gene was significantly higher than that of EgM4,and EgM9 genes in the same time period.EgM gene family was studied at the level of mRNA transcription in different developmental stages of the parasite,EgM123 gene is highly expressed in the adult stage,This study provided the theoretical basis on the candidate gene vaccine againstEchinococcusgranulosusin definitive hosts.

Echinococcusgranulosus;EgM123 protein;antigen gene;bioinformatics

S852.734;Q789

A

1007-5038(2017)10-0020-07

2017-01-17

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360623)；研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(XJAUGRI2015017)

毛麗萍(1989-)，女，安徽碭山人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物分子與免疫病理學(xué)研究。*