馬鏈球菌馬亞種的分離鑒定及fneB基因序列分析

王雨朦，何國文，買占海，沙婭·奴爾蘭，王德超，朱義忠，恩克·博力德，況 玲*，蘇戰(zhàn)強*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆伊犁種馬場，新疆昭蘇 835600)

馬鏈球菌馬亞種的分離鑒定及fneB基因序列分析

王雨朦1，何國文1，買占海1，沙婭·奴爾蘭1，王德超1，朱義忠2，恩克·博力德2，況 玲1*，蘇戰(zhàn)強1*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆伊犁種馬場，新疆昭蘇 835600)

新疆伊犁某地區(qū)一些馬群中不斷出現(xiàn)以全身多發(fā)性膿腫為特征的患病馬匹，為了查明其是否為馬腺疫，以及由何種馬鏈球菌感染所致,無菌采集典型患病馬匹膿汁樣品，常規(guī)THB增菌，綿羊鮮血平板劃線分離單菌落后，用透射電鏡對分離菌的微觀形態(tài)進行觀察，PCR對其fneB基因進行克隆與序列分析，最后用生化試驗進行驗證。結(jié)果表明，從12匹患病馬的膿腫組織中，共采集了25份樣品，從中分離鑒定出來源于不同患病馬的2株馬鏈球菌馬亞種菌株，這2株菌的形態(tài)均符合鏈球菌的特點；基因克隆測序結(jié)果表明，其中1株與英國源的獸疫亞種H70和馬亞種4047核苷酸同源性較高，均達97%～98%，另1株與英國源的馬亞種4047和瑞典源某馬亞種核苷酸同源性較高，均達98%～99%。這2株菌之間核苷酸序列同源性達98.3%，氨基酸同源性則達99.3%。馬鏈球菌馬亞種是引起伊犁某地區(qū)這些患馬全身多發(fā)性膿腫的主要致病菌，它們可能來源于之前從歐洲和美洲引進的馬匹，提示在進行疫病防控工作時，要特別注意海關(guān)檢疫，積極防止疫病的傳入。

馬；馬鏈球菌；分離鑒定；fneB基因；基因分析

馬鏈球菌作為條件致病菌，可以引起馬屬動物上呼吸道、子宮、臍帶等部位的疾病以及傷口感染[1]。馬鏈球菌(Streptococcusequi)屬于蘭氏分群(Lancefield group)的C群β溶血鏈球菌，包括獸疫亞種(Streptococcusequissp.zooepidemicus)、馬亞種(Streptococcusequissp.equi)和類馬亞種(Streptococcusequissp.equisimilis)3個不同的亞種[2]。其中獸疫亞種在哺乳動物中較常見，偶爾會引起嚴重的疾病[1]，相比之下，馬亞種作為專性病原體，可引起馬匹上呼吸道疾病，甚至導致具有高度傳染性的馬腺疫，是危害世界養(yǎng)馬業(yè)最重要的病原菌之一[3]。馬亞種是引起馬腺疫的病原菌，1251年Jordanus Ruffus在獸醫(yī)科學雜志中首次對馬腺疫進行了相關(guān)描述[4]，而馬鏈球菌于1888年被Schutz J W[5]首次鑒定出，盡管對這種疾病進行了一個多世紀的研究，它仍是世界上最常報道的馬的疾病之一。馬腺疫在英國，每年僅被發(fā)現(xiàn)的就有超過600次，每次疫情可以持續(xù)幾個星期，甚至幾年，其發(fā)病率可達100%，病死率達10%[6]。在我國，據(jù)效宏儒[7]的調(diào)查報告，甘肅山丹軍馬一場在1971年—1979年的14 745匹馬中，馬腺疫累計發(fā)生1 997例，發(fā)病率為13.55%，治愈1 914匹，治愈率達95.8%，死亡83匹，病死率4.2%。王積祿[8]1982年統(tǒng)計了青海海北地區(qū)某牧場552匹馬駒腺疫發(fā)病情況，發(fā)病517匹，發(fā)病率93.7%，死亡7匹，病死率為1.3%。據(jù)姜山[9]報道，1995年8月，四川省寶興縣1 241匹馬中發(fā)生馬腺疫868匹，發(fā)病率70% ，死亡7匹，病死率0.8%。吳家驥[10]2000年調(diào)查了貴州省黔西縣3個鄉(xiāng)的1 230匹馬，發(fā)生馬腺疫534匹，發(fā)病率43.4%。 馬腺疫感染最初的特征是發(fā)熱，咳嗽，之后出現(xiàn)淋巴結(jié)膿腫和黏膿性鼻腔出血[11]，即使馬匹發(fā)病嚴重，臨床癥狀明顯，但是對鼻拭子、鼻洗液、膿汁等的細菌學培養(yǎng)仍是該病的確診標準[12]。

馬鏈球菌感染的發(fā)生，涉及幾種表面錨定蛋白(黏附素)，使菌體能夠結(jié)合到宿主的扁桃體上皮細胞上。黏附因子FN結(jié)合蛋白有FNEB蛋白、FNE蛋白和SFS蛋白3種，其中FNEB蛋白被認為是細菌黏附和內(nèi)化到哺乳動物細胞過程中最重要的胞外蛋白[13]。本試驗選取編碼FNEB蛋白的fneB基因來鑒定馬鏈球菌馬亞種，并與其他馬亞種基因序列比較，對比它們的差異性，為建立馬鏈球菌病的防控措施提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 無菌采集新疆伊犁某馬場全身多發(fā)性膿腫馬匹的膿汁25份，編號N1～N25。

1.1.2 主要試劑 快速革蘭染液、THB培養(yǎng)基、細菌基因組DNA提取試劑盒、胎牛血清(Hyclone)，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司產(chǎn)品；鏈球菌細菌生化編碼鑒定管A203，杭州濱和微生物有限公司產(chǎn)品；DNA Marker、pMD-19T，TaKaRa公司產(chǎn)品；2×TaqPCR Green Mix、ddH2O、感受態(tài)細胞DH5α，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，Omega公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 自動高壓滅菌器(HVE-50)、離心機(Eppendorf AG 22331 Hamburg)、空氣浴振蕩培養(yǎng)箱(ST-F 160AC)、SW-CJ-2F雙人雙面垂直潔凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；透射電鏡，日立H-600A，日立公司產(chǎn)品；TPro fessional PCR儀，Biometra公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(Universal Hood Ⅱ)，Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離與培養(yǎng) 將采集到的樣品吸取200 μL加入到10 mL 50 mL/L血清THB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩18 h～24 h進行增菌培養(yǎng)。吸取增菌液20 μL畫線接種于50 mL/L綿羊鮮血培養(yǎng)基，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)18 h～24 h。觀察鮮血培養(yǎng)基表面的菌落形態(tài)，挑取β溶血的單菌落繼續(xù)在鮮血培養(yǎng)基上畫線，進行細菌純化，至鮮血培養(yǎng)基上呈現(xiàn)的菌落形態(tài)單一、穩(wěn)定，之后進行下一步鑒定。

1.2.2 細菌形態(tài)學觀察

1.2.2.1 光學顯微鏡觀察 挑取1.2.1中純化的單菌落進行革蘭染色，在油鏡下觀察。

1.2.2.2 透射電鏡觀察 挑取1.2.1中純化的單菌落于THB液體培養(yǎng)基中，180 r/min振蕩培養(yǎng)6 h，吸取20 μL菌液于預(yù)制好的銅網(wǎng)上，室溫放置2 min，使細菌吸附在FORMVAR膜表面，用20 g/L磷鎢酸負染后，用透射電鏡觀察。

1.2.3 引物合成 根據(jù)NCBI收錄的馬鏈球菌馬亞種4047全基因組中的fneB基因序列，利用DNA Star設(shè)計引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR擴增引物序列和反應(yīng)運行參數(shù)見表1。

表1 PCR擴增引物序列和反應(yīng)運行參數(shù)Table 1 Primer sequences and parameters of PCR

1.2.4 fneB基因的擴增 按細菌基因組DNA提取試劑盒的說明，取1.5 mL培養(yǎng)的菌液于EP管中12 000 r/min離心1 min，按照說明書進行，最后將所收集的DNA溶液于-20℃保存?zhèn)溆谩CR反應(yīng)體系為25 μL：2×TaqPCR Green Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補至25 μL。用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.5 fneB基因的克隆與鑒定 將瓊脂糖凝膠放于波長為365 nm的紫外燈照射下，切割含目的片段的凝膠，然后放入預(yù)先稱重的離心管中，根據(jù)DNA膠回收試劑盒的說明書操作，回收PCR產(chǎn)物。分別取1、5、4 μL的PCR回收產(chǎn)物、Solution Ⅰ、pMD19-T載體混勻，16℃過夜連接。

將連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細胞 DH5α 中，冰浴 30 min；42℃熱休克90 s，立即冰浴5 min； 無菌條件下加800 μL LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)40 min～60 min；吸取200 μL菌液均勻涂布于含有Amp抗性的LB平板上(40 μg/mL)，37℃培養(yǎng)12 h，同時設(shè)空白對照組。

挑取板上的單個菌落接種到含有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)6 h后，按照質(zhì)粒提取試劑盒的說明，提取細菌質(zhì)粒，所得陽性重組質(zhì)粒送與北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司測序。

1.2.6 生化鑒定 將PCR鑒定為陽性的菌株按照鏈球菌生化編碼鑒定手冊(GYZ—12ST)操作，對分離菌進行生化試驗驗證，觀察鑒定管顏色變化，結(jié)合鑒定手冊判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)

采集的25份樣品，經(jīng)多次培養(yǎng)純化，有2份樣品在綿羊鮮血培養(yǎng)基上可見β溶血的灰白色邊緣整齊、中間隆起且濕潤光滑，大小約1 mm的圓菌落。

2.2 細菌形態(tài)學觀察

革蘭染色鏡檢可見藍色成對或呈短鏈狀排列的球菌(圖1)。透射電鏡明顯可見排列成鏈狀的球菌，球菌大小在0.5 μm～1.0 μm之間，符合馬鏈球菌特征[14](圖2)。

圖1 革蘭染色鏡檢(1 000×)Fig.1 Gram staining(1 000×)

圖2 透射電鏡觀察Fig.2 Observation under transmission electron microscope

2.3 fneB序列的生物信息學分析

2.3.1 fneB基因擴增 按照所設(shè)計的fneB基因引物，所分離到的2株菌均能在435 bp處擴增出目的條帶(圖3)。

M.DNA 標準DL 2 000;1.N20；2.N25；3.陰性對照M.DNA Marker DL 2 000;1.N20；2.N25；3.Negative control圖3 fneB基因PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR amplification result of fneB gene

2.3.2 fneB基因的同源性比較 利用MegAlign軟件中的Clustal V將測序結(jié)果與GenBank登錄的fneB基因序列進行同源性比較，結(jié)果分離株N20與N25的核苷酸同源性達98.3%，氨基酸同源性達99.3%(圖4)。N20與英國源獸疫亞種H70、馬亞種4047核苷酸同源性較高，達97%～98%，N25與英國源馬亞種4047、瑞典源馬亞種核苷酸同源性較高，達98%～99%(圖5)。說明分離株N20、N25為馬鏈球菌馬亞種。

2.4 細菌生化鑒定

PCR鑒定為陽性的菌株生化試驗結(jié)果見表2。

3 討論

馬腺疫是由馬鏈球菌馬亞種引起馬屬動物的一種急性接觸性傳染病，具有高發(fā)病率的特點，它給世界養(yǎng)馬業(yè)帶來的直接影響是馬術(shù)活動的取消以及巨大的經(jīng)濟損失[15]。馬鏈球菌馬亞種是影響經(jīng)濟和動物福利重要的馬病原體。本試驗在春夏季節(jié)對全身多發(fā)性膿腫病例的馬匹膿汁進行馬鏈球菌馬亞種的分離，成功分離到2株馬鏈球菌馬亞種，經(jīng)fneB基因PCR鑒定、生化鑒定、同源性分析，表明分離株與4047菌株屬同一亞種。本試驗分離株與英國源分離株同源性高，可能與該地區(qū)引進的馬匹有關(guān)，這與Anzai T等[16]和Ivens P A S等[17]分析得出的馬鏈球菌馬亞種的傳播可能是世界馬匹貿(mào)易導致的結(jié)論一致，本研究為檢疫檢驗部門提供了理論依據(jù)。通過對比本研究分離株與新疆馬腺疫鏈球菌[18](ID:KF679507)發(fā)現(xiàn)，3株馬鏈球菌雖為同一亞種，但引發(fā)的臨床病征不同，說明馬鏈球菌馬亞種除引起馬腺疫外，還可引起全身多發(fā)性膿腫。Neamat-Allah A N F等[12]研究表明，馬腺疫在全年中所有季節(jié)都發(fā)生，但在春季發(fā)生率較高(達45.52%)，而 Radostits O M等[19]認為馬腺疫大多發(fā)生在寒冷潮濕的季節(jié)，本研究分離的馬鏈球菌馬亞種來自于夏季發(fā)生全身多發(fā)性膿腫的患馬，可以推斷當季節(jié)變換，天氣轉(zhuǎn)寒時，該馬場有暴發(fā)馬腺疫的危險。

圖4 分離株fneB基因核苷酸同源性分析Fig.4 Homology analysis of nucleic acids of fneB gene of isolates

圖5 分離株fneB基因編碼的氨基酸同源性分析Fig.5 Homology analysis of fneB gene encoding amino acid of isolates

表2 分離菌生化鑒定結(jié)果Table 2 Biochemical identification results of isolates

Boyle A G等[20]對3種分離鑒定馬鏈球菌的方法進行比較，發(fā)現(xiàn)直接PCR為檢測馬鏈球菌的優(yōu)選方法，本試驗先用PCR對分離菌進行鑒定，后用生化試驗進行驗證，發(fā)現(xiàn)生化試驗結(jié)果不符合鏈球菌生化特性，但細菌測序結(jié)果確定為馬鏈球菌馬亞種，這提示生化鑒定可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)果，不足以用于細菌鑒定，應(yīng)與分子生物學鑒定方法相結(jié)合，這是較為可靠的鑒定方法。

馬鏈球菌馬亞種在馬屬動物中建立持續(xù)感染的能力可能是造成世界各地馬腺疫高發(fā)病率的原因，所以鑒定健康攜帶者是預(yù)防馬腺疫發(fā)生的一個關(guān)鍵點。帶菌馬已被認為是維持病原體長期存在和暴發(fā)感染的重要因素[21]，但在健康馬群體中監(jiān)測馬亞種的存在是具有挑戰(zhàn)性的。Tirosh-Levy S等[22]強烈推薦血清學和細菌學組合的方法來鑒定持續(xù)感染的馬，這在馬腺疫發(fā)生期間，利用分子信息掌握馬亞種流行病學和追蹤新菌株有重要意義。

[1] Barnham M,Ljunggren A,Mcintyre M.Human infection withStreptococcuszooepidemicus(Lancefield group C):three case reports[J].Epidemiol Infect,1987,98(2):183.

[2] 杜茂昌.馬腺疫鏈球菌的分離鑒定及其滅活疫苗的研制[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學,2015.

[3] Lindmark H,Nilsson M,Guss B.Comparison of the fibronectin-binding protein FNE fromStreptococcusequisubspeciesequiwith FNZ fromS.equisubspecieszooepidemicusreveals a major and conserved difference[J].Infect Immun,2001,69(5):3159.

[4] 郭紀珂,王曉鈞.馬腺疫[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2013(10):16-18.

[5] Schütz J W.TheStreptococcusof strangles[J].J Compar Pathol Thera,1988(1):191-208.

[6] Laus F,Preziuso S,Spaterna A,et al.Clinical and epidemiological investigation of chronic upper respiratory diseases caused by beta-haemolytic streptococci in horses[J].Compar Immunol Microbiol Infect Dis,2007,30(4):247-260.

[7] 效宏儒.關(guān)于群牧馬馬腺疫發(fā)生規(guī)律的初步探討[J].畜牧獸醫(yī)雜志,1984(2):38-40.

[8] 王積祿.中西結(jié)合治療馬腺疫[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志,1982(3):103.

[9] 姜 山.馬腺疫病的診療[J].中國獸醫(yī)雜志,1997(9):38.

[10] 吳家驥,崔明志.馬腺疫的中草藥治療[J].中獸醫(yī)學雜志,2000(4):17-18.

[11] May J P,Walker C A,Maskell D J,et al.Development of aninvivoHimar1 transposon mutagenesis system for use inStreptococcusequisubsp.equi[J].Fems Microbiol Lett, 2004, 238(2):401-409.

[12] Neamat-Allah A N F,Damaty H M E.Strangles in Arabian horses in Egypt:Clinical,epidemiological,hematological,and biochemical aspects[J].Vet World,2016,9(8):820-826.

[13] Lannerg?rd J,Flock M,Johansson S,et al.Studies of fibronectin-binding proteins ofStreptococcusequi[J].Infect Immun,2005,73(11):7243.

[14] 赫什D C,麥克勞克倫N J,沃克R L.獸醫(yī)微生物學[M].北京：科學出版社,2007:65-68.

[15] Emma M，Kavanagh K S,Buckley T C,et al.Lineages ofStreptococcusequisspequiin the Irish equine industry[J].Irish Vet J,2013,66(1):10.

[16] Anzai T,Kuwamoto Y,Wada R,et al.Variation in the N-terminal region of an M-like protein ofStreptococcusequiand evaluation of its potential as a tool in epidemiologic studies[J].Am J Vet Res,2005,66(12):2167-2171.

[17] Ivens P A S,Matthews D,Webb K,et al.Molecular characterisation of strangles outbreaks in the UK:the use of M-protein typing ofStreptococcusequissp.equi[J].Equine Vet J,2011,43(3):359-364.

[18] 徐全圓.馬腺疫鏈球菌的分離鑒定及FN結(jié)合蛋白免疫原性的研究[D].新疆烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學,2014.

[19] Radostits O M,Blood D C,Done S H.Veterinary medicine:A textbook of the diseases of cattle,sheep,pigs,goats and horses[J].J Equine Vet Sci,2007(1):625.

[20] Boyle A G,Rankin S C,Duffee L,et al.Streptococcusequidetection polymerase chain reaction assay for equine nasopharyngeal and guttural pouch wash samples[J].J Vet Int Med,2015,30(1):276-281.

[21] Newton J R,Verheyen K,Talbot N C,et al.Control of strangles outbreaks by isolation of guttural pouch carriers identified using PCR and culture ofStreptococcusequi[J].Equine Vet J,2000,32(6):515.

[22] Tirosh-Levy S,Blum S E,Steward K F,et al.Streptococcusequisubspeciesequiin horses in Israel:seroprevalence and strain types[J].Vet Rec Open,2016,3(1):1-5.

Isolation,IdentificationandfneBGeneSequencingofStreptococcusequisubsp.equi

WANG Yu-meng1，HE Guo-wen1，MAI Zhan-hai1，SHAYA·Nuerlan1，WANG De-chao1，ZHU Yi-zhong2，ENKE·Bolide2，KUANG Ling1，SU Zhan-qiang1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，XinjiangAgriculturalUniversity，Urumqi,Xinjiang,830052，China;2.TheFieldofStallionIliXinjiang，Zhaosu,Xinjiang,835600，China)

There is a kind of disease happened among horses in Yili region of Xinjiang,which characterized by constantly appearance of multiple abscesses.In order to find if it is horse strangles,and to determine the type ofStreptococcusequi,pus samples from typical sick horses were collected.THB culture medium was used for enrichment,and sheep blood plate was streaked for getting single colony.Transmission electron microscopy was used to observe the microscopic morphology of the isolates,and the fneB gene was cloned by PCR.Finally,the biochemical tests were used to verify.A total of 25 samples were collected from abscess tissues of 12 diseased horses.There are 2Streptococcusequisubsp.equistrains were isolated and identified from 2 different horses,and the morphology of both strains were consistent with the characteristics ofStreptococcus.Gene cloning and sequencing results showed that compared to British sourcedStreptococcusequisubsp.zooepidemicusH70 andStreptococcusequisubsp.equi4047,one isolate has high nucleotide homology,which is up to 97%-98%.Another isolate has high nucleotide homology with British sourcedStreptococcusequisubsp.equi4047 and a Swedish strain,which is up to 98%-99%.The nucleotide sequence homology between this 2 isolates was up to 98.3%,and the amino acid homology between them was up to 99.3%.Streptococcusequisubsp.equiwas the main pathogenic bacteria of Ili horse multiple abscesses,they may origin from those imported Europe and the American horses.Suggesting that we should pay special attention to custom quarantine,and make sure that some diseases must not be introduced to our country when we carry out work on preventing and controlling of animal diseases.

equine;Streptococcusequi;isolation and identification;fneB gene;gene sequencing

2017-01-11

國家科技支撐計劃項目(2012BAD46B02)

王雨朦(1993-)，女，新疆烏魯木齊人，碩士研究生，主要從事獸醫(yī)臨床研究。*

S852.611;S852.21

A

1007-5038(2017)10-0008-05