烤煙部位間葉面微觀形態(tài)特征的差異及其與部分外觀、物理指標的關系

過偉民，尹啟生，張艷玲，何斌，王信民，王廣山

1 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南鄭州市高新區(qū)楓楊街2號，450001；2 湖南省煙草公司郴州市公司，湖南郴州市北湖區(qū)，423000

烤煙部位間葉面微觀形態(tài)特征的差異及其與部分外觀、物理指標的關系

過偉民1，尹啟生1，張艷玲1，何斌2，王信民1，王廣山1

1 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，河南鄭州市高新區(qū)楓楊街2號，450001；2 湖南省煙草公司郴州市公司，湖南郴州市北湖區(qū)，423000

為探索微觀形態(tài)指標在煙葉品質評價中的應用，采用掃描電鏡結合圖像分析的方法，研究了不同部位煙葉微觀形態(tài)的差異及與部分外觀、物理指標的關系。結果表明：①烤后煙葉表面細胞輪廓清晰，中部向上凸起形成褶皺，隨部位上升細胞褶皺呈減弱趨勢；②不同部位煙葉表面微觀形態(tài)差異明顯，下部葉表面細胞相對較大且形狀不規(guī)則，中部葉表面細胞相對較小且形狀不規(guī)則，上部葉表面細胞形狀相對規(guī)則；③不同葉片結構和厚度煙葉的細胞形狀存在差異，葉片結構相對疏松和厚度相對較薄煙葉的細胞形狀相對不規(guī)則。④細胞形狀的不規(guī)則程度對煙葉葉片結構疏松程度存在直接和間接（通過細胞周長）正向作用。煙葉表面細胞形狀因子（表征細胞形狀不規(guī)則程度）在量化評價葉片結構、成熟度等方面有較好應用前景。

烤煙; 表面微觀形態(tài);掃描電鏡; 外觀品質; 物理特性

植物器官表皮提供的微形態(tài)學特征，可用于植物系統(tǒng)發(fā)育和品質形成的相關研究。如李鴻雁等[1]通過研究牧草葉片微觀性狀與抗寒性的關系，篩選出可用于評價抗寒性的葉片微觀結構指標，林嬌芬等[2]研究了油柿茶加工過程中細胞組織的變化，篩選出茶葉特征形成的關鍵細胞結構變化指標，江澤慧等[3]研究揭示了杉木微觀結構參數(shù)與物理力學特性的關系。近年來，隨著掃描電鏡（SEM）技術[4]的快速發(fā)展，眾多學者將掃描電鏡與圖像數(shù)字量化技術結合，開展了更為精細化的微觀形態(tài)結構研究。如Nishimoto等[5]利用Photoshop軟件對花崗巖的SEM圖像進行了模式分析，Morse等[6]定量分析了砂巖SEM圖像中的空隙比例，張學豐等[7]定量分析了巖石SEM圖像的顆粒百分含量、空隙率、瀝青含量等指標。這些研究為深入開展煙葉微觀形態(tài)特征分析提供了良好借鑒。

烤煙煙葉由于烘烤環(huán)節(jié)的特殊性（水分和營養(yǎng)雙重脅迫），細胞在烘烤過程中失水而引起皺縮，微觀形態(tài)發(fā)生重大變化。目前對于煙葉微觀形態(tài)特征的研究包括不同類型土壤[8]、品種[9]鮮煙葉顯微/超顯微結構的比較，利用不同成熟度鮮煙葉的微觀結構特征[10]、烘烤過程中微觀結構的變化[11]確定采收成熟度等，但對烤后煙葉表面微觀形態(tài)的研究較少。朱尊權[12]、于華堂[13]等認為煙葉成熟度、葉片結構與細胞形態(tài)特征密切相關。前期研究[14-15]中，建立了烤后煙葉表面細胞形態(tài)特征指標的量化方法，初步探討了不同產地煙葉表面微觀形態(tài)特征的相似性和差異性，細胞形態(tài)特征指標與外觀品質指標的關系。在此基礎上，本文通過同產區(qū)不同部位煙葉表面微觀形態(tài)特征、外觀品質（成熟度、葉片結構、身份）、物理特性（葉面密度、厚度）指標的分析評價，探討了煙葉表面微觀形態(tài)特征的部位間差異，并進一步篩選出了與煙葉外觀、物理指標相關性強的微觀形態(tài)指標，為利用微觀形態(tài)特征指標客觀、量化評價烤后煙葉的外觀品質提供方法參考，同時也為鮮煙葉表面微觀形態(tài)的分析和評價提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采樣點為湖南郴州，品種為云煙87。取樣方法為采集栽培和烘烤條件一致的初烤煙葉，每部位采集煙葉50~100片，按照葉位自下而上依次制備底腳葉（1個，葉位3~4）、下二棚（2個，葉位5~6、6~7）、腰葉（4個，葉位8~9、10、11、12）、上二棚（3個，葉位13~14、15~16、17~18）、頂葉（2個，葉位19、20）共5個部位代表性煙葉樣品12個，每樣品3~5片煙葉。為排除采收或烘烤不當對煙葉表面微觀形態(tài)的可能影響，所制備煙葉的外觀品質符合GB2635—92[16]中正組煙葉的要求。

1.2 分析方法

1.2.1 煙葉微觀形態(tài)指標

在每片煙葉的相同位置（從葉基部至頂部2/3，左右兩側距離主脈2cm）截取無雜色、病斑、損傷、含青和支脈的葉片局部，利用日立TM3030型掃描電子顯微鏡觀測，放大倍數(shù)為400倍，每片煙葉共采集8~12個視野（圖像）。采用PHOTOSHOP 16.0軟件，基于像素比值近似等于面積比值的原理，對每個圖像中的細胞面積、細胞周長等指標進行量化，具體方法參照文獻[14]。計算細胞形狀因子指標，細胞形狀因子是反映細胞形狀與圓相差的程度及不規(guī)則程度，在醫(yī)學領域中細胞生物學狀態(tài)觀測、病變發(fā)生評估等方面有較多應用，計算公式為[周長2÷（4×π×面積×1.064）]，數(shù)值越大，表示形狀偏離圓形越遠，形狀越不規(guī)則[17]。

1.2.2 煙葉物理特性指標

葉面密度：每個樣品所有煙葉在溫度22℃±1℃、相對濕度60%±3%條件下平衡水分72h，用圓形打孔器在每片煙葉主脈兩側平行于主脈的中線上均勻打取6個圓形小片，將圓形小片放入水分盒中，在烘箱100℃條件下烘2h后取出，放入干燥皿中冷卻30min后稱重，計算葉面密度。

厚度：每個樣品所有煙葉在溫度22℃±1℃、相對濕度60%±3%條件下平衡水分72h，用電動厚度儀分別測量每片煙葉主脈兩側平行于主脈中線的1/4、2/4、3/4位置處的葉片厚度，以所有測量點的平均厚度作為該片煙葉的厚度。

1.2.3 煙葉外觀品質指標

由分級專家逐片對煙葉的成熟度、葉片結構、身份指標進行量化賦分，以所有煙葉的平均分值作為該樣品的分值。分值由低到高，代表煙葉成熟度由低到高，葉片結構由緊密到疏松，身份由?。ê瘢┑街械龋唧w參照文獻[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS18.0軟件進行數(shù)據(jù)的方差分析、相關分析和通徑分析。方差分析前，利用方差同質性檢驗方法對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，滿足方差齊性后采用最小顯著差異法（LSD）進行多重比較。通徑分析前采用K-S檢驗和W檢驗方法對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗。

2 結果與分析

2.1 不同部位煙葉表面微觀形態(tài)特征差異

煙葉樣品表面掃描電鏡的代表性圖像見圖1。從圖中看出，烤后煙葉表面細胞輪廓清晰，細胞中部向上凸起，有褶皺，細胞形狀整體不規(guī)則，氣孔和腺毛可見。不同葉位煙葉表面細胞形態(tài)有所差異，底腳葉和下二棚煙葉表面細胞的褶皺較強，細胞中部向上凸起，形似陡峭的山尖；腰葉表面細胞的褶皺稍弱，上二棚~頂葉表面細胞的褶皺較弱，細胞形似平闊山包。總體而言，隨部位上升，煙葉表面細胞褶皺存在減弱趨勢。

采用最小顯著差異法，對不同部位煙葉的表面微觀形態(tài)指標進行方差分析和多重比較（表1）。從表中看出，下二棚煙葉的細胞面積相對較大，細胞形狀相對不規(guī)則；腰葉的細胞面積相對較小，細胞形狀相對不規(guī)則；上二棚、頂葉的細胞形狀相對規(guī)則。下二棚、腰葉的細胞形狀因子極顯著大于上二棚和頂葉，腰葉的細胞面積極顯著小于下二棚和上二棚煙葉。

表1 不同部位煙葉表面微觀形態(tài)指標量化結果Tab. 1 Quanti fi cation of surface microscopic morphology indices of fl ue-cured tobacco leaves of different stalk position

圖1 不同部位煙葉表面微觀形態(tài)Fig. 1 Surface microscopic morphology of fl ue-cured tobacco leaves of different leaf stalk position

2.2 煙葉表面微觀形態(tài)指標與外觀、物理指標的關系

2.2.1 不同外觀和物理指標煙葉表面微觀形態(tài)指標的差異

根據(jù)煙葉樣品外觀品質評價和物理特性檢測結果，采用最小顯著差異法，對不同外觀品質、物理特性煙葉的表面微觀形態(tài)指標進行方差分析和多重比較（表2）。從表中看出，葉片結構疏松程度不同的煙葉，細胞形狀因子存在顯著差異，葉片結構較好（“疏松”檔次中上限）煙葉的細胞形狀因子極顯著高于葉片結構稍差（“疏松”檔次下限）的煙葉，顯著高于葉片結構中等（“疏松”檔次中下限）煙葉，說明葉片結構相對疏松的煙葉表面細胞形狀相對不規(guī)則。細胞面積和周長在不同外觀品質指標各檔次間差異不顯著，成熟度較好的煙葉細胞面積稍小。不同葉面密度煙葉的細胞面積存在顯著差異，葉面密度較大煙葉的細胞面積顯著高于中等煙葉。不同厚度煙葉的細胞周長和細胞形狀因子存在顯著差異，厚度較薄的煙葉細胞周長和細胞形狀因子相對較大?？傮w來看，細胞形狀因子在不同葉片結構和厚度煙葉之間存在較明顯差異。

表2 不同外觀品質和物理指標煙葉表面微觀形態(tài)指標Tab. 2 Surface microscopic morphology indices of different appearance quality and physical characteristics

2.2.2 煙葉外觀和物理指標與表面微觀形態(tài)指標的相關分析

對煙葉外觀和物理指標與表面微觀形態(tài)指標進行了相關分析和檢驗（表3）。從表中看出，煙葉表面細胞形狀因子與外觀和物理指標的相關性較強，細胞形狀因子與葉片結構分值呈極顯著正相關，與厚度呈極顯著負相關。說明煙葉表面的細胞形狀越不規(guī)則，葉片結構相對疏松，厚度相對較薄。

表3 煙葉表面微觀形態(tài)指標與外觀、物理指標的相關性Tab. 3 Correlation analysis between microscopic morphology indices and appearance quality and physical characteristics

2.2.3 煙葉外觀和物理指標與表面微觀形態(tài)指標的通徑分析

利用通徑分析對細胞形狀因子與葉片結構和厚度的相關性進行了分解。通徑分析的前提條件為因變量符合正態(tài)分布，首先對葉片結構和厚度數(shù)據(jù)實施正態(tài)性檢驗。從表4中看出，兩種檢驗方法的顯著性水平均大于0.05，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布。從表5中看出，細胞形狀因子對葉片結構存在直接正向作用的同時，還通過細胞周長對葉片結構存在較大的間接正向作用，因此細胞形狀因子與葉片結構表現(xiàn)出較強正相關（0.80，P＜0.01）。細胞周長對葉片結構存在直接正向作用，但通過細胞面積對葉片結構的間接負向作用較強；細胞面積對葉片結構存在直接負向作用，但通過細胞周長的間接正向作用較強，因此細胞周長、細胞面積與葉片結構的相關系數(shù)相對較低。對于厚度指標，細胞形狀因子存在直接正向作用的同時，還通過細胞周長和細胞面積存在較強的間接負向作用，因此細胞形狀因子與葉片厚度表現(xiàn)出較強負相關（0.75，P＜0.01）。細胞周長對厚度存在直接負向作用，但通過細胞面積和細胞形狀因子的間接正向作用較強；細胞面積對厚度存在直接正向作用，但通過細胞周長的間接負向作用較強，因此細胞周長、細胞面積與厚度的相關系數(shù)相對較低。

表4 葉片結構和厚度數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗結果Tab. 4 Normality test of leaf structure and leaf thickness

表5 葉片結構、厚度與細胞形態(tài)特征的通徑分析結果Tab. 5 Path analysis between leaf structure, leaf thickness and cell morphology indices

3 討論

烤后煙葉表面細胞輪廓清晰，中部向上凸起形成褶皺，隨部位上升，細胞褶皺呈減弱趨勢。底腳葉~下二棚煙葉的褶皺明顯較強，這可能由于田間下部煙葉含水量相對較高且失水相對容易[19]，烘烤過程中大量失水而引起細胞的強烈皺縮，從而形成烤后煙葉形似陡峭山尖的細胞形態(tài)特征，上部煙葉含水量相對較少且失水相對困難，失水皺縮的變化過程相對較弱，從而形成烤后煙葉形似平闊山包的細胞形態(tài)特征。上部煙葉的表面細胞形狀因子極顯著較低，細胞形狀相對規(guī)則，這可能與上部煙葉烘烤過程中細胞形態(tài)變化的劇烈程度相對小于中下部煙葉有關，與齊娜等[20]研究不同部位煙葉烘烤過程中宏觀形態(tài)變化（葉長、寬、厚度）的規(guī)律相吻合，即上部煙葉變化的劇烈程度明顯小于中下部煙葉。

關于煙葉表面微觀形態(tài)與外觀品質的關系，本文發(fā)現(xiàn)，不同葉片結構煙葉的細胞形狀因子差異顯著，且細胞形狀因子與葉片結構分值呈極顯著正相關，即煙葉表面細胞形狀越不規(guī)則，葉片結構的疏松程度越高?？緹煼旨墖鴺薣16]將葉片結構定義為細胞排列的疏密程度，分為疏松、尚疏松、稍密、緊密4個檔次，細胞排列間隙大，則葉片結構相對疏松。細胞形狀越不規(guī)則，可能使細胞與細胞之間接觸的區(qū)域較大，則細胞的間隙可能越大，葉片結構表現(xiàn)為相對疏松。一般認為，煙葉葉片結構與成熟度高度正相關[13,21]，朱尊權[12]、于華堂[13]等認為，煙葉組織細胞在田間達到成熟時慢慢變大，烘烤過程中由于水分消失而收縮，田間成熟且烘烤后熟充分的煙葉細胞疏開狀態(tài)較好，細胞間隙或孔度較大。煙葉細胞的疏開與本文所發(fā)現(xiàn)的細胞形狀不規(guī)則程度提高相一致。此外，前期研究[15]發(fā)現(xiàn)，不同成熟度檔次的烤后煙葉，成熟度好的煙葉細胞形狀相對不規(guī)則，本文中成熟度分值與細胞形狀因子也表現(xiàn)出一定的正相關性。從物理指標來看，細胞形狀因子與厚度、葉面密度呈負相關性，即細胞形狀越趨向于規(guī)則，煙葉的厚度越厚，葉面密度越大，這可從煙葉成熟采烤過程中物質轉化的充分程度、細胞變化的劇烈程度加以解釋。

4 結論

不同部位烤后煙葉的表面細胞形態(tài)差異明顯，下部煙葉細胞褶皺強，細胞相對較大且形狀相對不規(guī)則；中部煙葉細胞褶皺一般，細胞相對較小且形狀不規(guī)則；上部煙葉細胞褶皺較弱，細胞形狀相對規(guī)則。

細胞形狀因子反映了細胞形狀的不規(guī)則程度，一定程度體現(xiàn)了煙葉成熟采烤過程中物質轉化的劇烈程度，與烤后煙葉的外觀和物理指標相關性強，在量化評價烤后煙葉葉片結構、成熟度等方面有較好的應用前景。

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：GUO Weimin, YIN Qisheng, ZHANG Yanling, et al. Surface microscopic morphology characteristics of fl ue-cured tobacco from di ff erent stalk positions and their relationships with selected apparent and physical quality indexes [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(1)

*Corresponding author. Email：zhangyl@ztri.com.cn

Surface microscopic morphology characteristics of fl ue-cured tobacco from di ff erent stalk positions and their relationships with selected apparent and physical quality indexes

GUO Weimin1, YIN Qisheng1, ZHANG Yanling1*, HE Bin2, WANG Xinmin1, WANG Guangshan1
1 Zhengzhou Tobacco Research Institute, China National Tobacco Corporation, Zhengzhou 450001, China；2 Hunan Chenzhou Municipal Tobacco Company, Chenzhou 423000, Hunan, China

In order to study the effect of micro morphological characteristics in quality evaluation, flue-cured tobacco leaves of di ff erent stalk positions were prepared and investigation was made into di ff erences of microscopic morphology and its relationship with apparentquality and physical index based on SEM combined with image analysis. Results showed that: (1) Cell outline of flue-cured leaves was clear with central part bulged and wrinkled, and the wrinkle declined with the rising of stalk position. (2) Micro-morphological characteristics of di ff erent leaf positions showed obvious di ff erence. Lower position leaves had large cell area and irregular cell shapes,while middle position leaves had relatively small cell area and irregular cell shape, and upper position leaves had regular cell shape. (3) Cell shape showed di ff erence among leaves of di ff erent leaf structure and thickness, in which cell shape was relatively irregular in leaves with relatively loose structure and thin thickness. (4) The degree of irregularity of cell shape had a direct and indirect (by cell circumference)positive e ff ect on leaf structure. The cell shape factor which characterized the degree of irregularity of cell shape had a better application prospect for evaluating leaf structure and maturity of fl ue-cured tobacco leaves.

fl ue-cured tobacco; surface microstructure; scanning electron microscope; appearance quality; physical character

過偉民，尹啟生，張艷玲，等. 烤煙部位間葉面微觀形態(tài)特征的差異及其與部分外觀、物理指標的關系[J]. 中國煙草學報，2017,23（1）

國家煙草專賣局科技項目“蛋白質和游離氨基酸在煙葉質量評價中的應用及主要影響因素研究”（122014AA0610），鄭州煙草研究院院長基金項目“基于掃描電鏡圖像分析的烤煙煙葉微觀結構特征研究”（112012CA0060）

過偉民（1984—），碩士，工程師，主要從事煙葉栽培及煙葉質量評價研究，Tel:0371-67672308,Email: guoweimin1984@sina.com

張艷玲（1972—），Tel:0371-67672315, Email: zhangyl@ztri.com.cn

2016-05-18；< class="emphasis_bold">網絡出版日期：

日期：2017-01-25