MicroRNA-182在人肺腺癌中的表達(dá)及其臨床意義*

房延鳳，張紅軍，金發(fā)光，傅恩清，魯曦

（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 710038）

MicroRNA-182在人肺腺癌中的表達(dá)及其臨床意義*

房延鳳，張紅軍，金發(fā)光，傅恩清，魯曦

（第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，陜西 西安 710038）

目的 探討microRNA-182（miRNA-182）在人肺腺癌組織中的表達(dá)，以及與患者臨床特征及預(yù)后的相關(guān)性。方法 收集術(shù)后或穿刺活檢病理證實的人肺腺癌新鮮組織98例，以及其癌旁正常肺組織和良性病變旁正常肺組織98例，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測miRNA-182的相對表達(dá)量，分析其與臨床特征及生存預(yù)后的關(guān)系，用ROC曲線評估m(xù)iRNA-182對人肺腺癌的診斷能力。結(jié)果 miRNA-182在人肺腺癌組織相對表達(dá)量為（0.8001±0.2112），在正常肺組織相對表達(dá)量為（0.2721±0.1216），人肺腺癌組織中的表達(dá)高于正常肺組織（P＜0.05）；miRNA-182的表達(dá)水平與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及腫瘤分化相關(guān)（P＜0.05）。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)界值設(shè)置為0.52時，miRNA-182在人肺腺癌中的表達(dá)特異性為95.918%，敏感性為91.837%，陽性預(yù)測值為95.745%。結(jié)論 miRNA-182在人肺腺癌組織中表達(dá)量高于正常肺組織，有可能成為人肺腺癌診斷、預(yù)后評估的重要指標(biāo)。

microRNA-182；人肺腺癌；診斷；預(yù)后

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤，大多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時已處于中、晚期[1]。因此，尋找有關(guān)肺癌早期預(yù)警、診斷標(biāo)志物是目前研究的熱點之一[2]。近來研究顯示，microRNA-182（miRNA-182）的異常表達(dá)與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。本實驗采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測98例術(shù)后或穿刺活檢病理證實的人肺腺癌新鮮組織標(biāo)本中miRNA-182的表達(dá)，研究其與各臨床特征的關(guān)系，探討miRNA-182在人肺腺癌中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床標(biāo)本及資料

選取2010年6月-2011年6月第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院術(shù)后或穿刺活檢病理證實的人肺腺癌新鮮組織98例，以及其正常肺新鮮組織（癌旁正常肺組織或良性病變旁正常肺組織）98例。其中，年齡33～88歲，平均（60.67±9.76）歲。臨床病理分期采用UICC（2009年）制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。所有患者術(shù)前未行放、化療，亦無其他惡性病變病史，相關(guān)資料完整。正常肺組織選用標(biāo)準(zhǔn)為癌組織邊緣＞5 cm或手術(shù)后良性病變周圍正常肺組織。常規(guī)處理組織后，在-80℃冰箱中保存。術(shù)后隨訪至2016年6月，隨訪98例，失訪11例，隨訪率為88.775%（87/98），隨訪期間，把死于與肺癌無關(guān)或失訪的患者作為刪失患者。入組患者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器及設(shè)備

總 RNA提取試劑：miRNeasy FFPE Kit和RNase-Free DNaseⅠ（德國Qiagen公司）。儀器：微量移液器（德國Eppendorf公司），離心機（型號：3K-15，德國SIGMA公司），紫外分光光度計（美國熱電公司）。逆轉(zhuǎn)錄試劑：Prime ScriptRRT reagent Kit With gDNA Eraser（日本 TaKaRa公司）；PCR 試劑：SYBR Prime ScriptTMmiRNA RT-PCR kit（日本TaKaRa公司）；儀器：PCR基因擴(kuò)增儀和PCR儀（美國 Bio-Rad公司）。

1.3 引物及內(nèi)參

PCR引物用Oligo和Beacon 7.8軟件進(jìn)行熒光定量設(shè)計，由上海生工生物工程股份有限公司負(fù)責(zé)合成。正向引物：5'-GCTTTGGCAATGGTAGAACTCAC ACT-3'；反向引物：5'-TTTGGCAATGGTAGAACTCA CACT-3'。選擇β-actin作為內(nèi)參，正向引物：5'-GT GGGGCGCCCCAGGCACCA-3'；反向引物：5'-CTCCT TAATGTCACGCACGATTTC-3'。

1.4 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR

RNA提取按照日本TaKaRa公司RNA純化試劑盒說明書進(jìn)行操作，注意RNA降解。利用紫外分光光度計對RNA定量后于-80℃冰箱冷凍保存待用。隨后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。本研究采用SYBR法進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系的配置嚴(yán)格按說明書操作，反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性 3 min，94℃變性 30 s，57℃退火 30 s，72℃延伸40 s，共40個循環(huán)。對miRNA-182行相對定量分析，反應(yīng)結(jié)束后繪制熔解曲線，確認(rèn)引物特異性后記錄內(nèi)參基因和目的基因的CT值，同時計算相對表達(dá)量。每個標(biāo)本重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件行，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用方差分析或t檢驗，描述生存過程用Kaplan-Meier法，miRNA-182對人肺腺癌的診斷用ROC曲線，肺腺癌患者影響因素的分析采用COX比例風(fēng)險模型，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常肺組織與肺腺癌組織miRNA-182表達(dá)的比較

肺腺癌組織相對表達(dá)量為（0.8001±0.2112），正常肺組織相對表達(dá)量為（0.2721±0.1216），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=16.380，P=0.000），肺腺癌組織miRNA-182相對表達(dá)量高于正常肺組織。見圖1。

圖1 肺腺癌組織與正常組織miRNA-182的相對表達(dá)量比較

2.2 miRNA-182表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

不同性別、年齡患者的miRNA-182表達(dá)水平比較，經(jīng)t檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；不同腫瘤分化程度比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），低、中分化患者的miRNA-182表達(dá)水平高于高分化患者；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的miRNA-182表達(dá)水平高于無上述轉(zhuǎn)移患者（P＜0.05）；TNMⅢ、Ⅳ期患者的miRNA-182表達(dá)水平高于TNMⅠ、Ⅱ期患者（P＜0.05）。見表1。

表1 患者臨床病理特征與miRNA-182表達(dá)的關(guān)系

2.3 miRNA-182表達(dá)與患者生存分析

2.3.1 5年總體生存分析 用電話方式對98例患者進(jìn)行隨訪，隨訪時間為2010年6月-2016年6月，期間患者死亡78例，存活9例，失訪11例；總體中位生存時間35.253個月，5年生存率為10.345%（9/87）。見圖 2。

圖2 男女5年生存率比較

2.3.2 多因素生存分析 將人肺腺癌中miRNA-182表達(dá)有差異的相關(guān)變量：miRNA-182表達(dá)、人肺腺癌分化程度、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，以及TNM分期納入COX多因素比例風(fēng)險回歸模型。逐步回歸分析結(jié)果表明，miRNA-182表達(dá)狀態(tài)、TNM分期是影響肺腺癌患者預(yù)后的獨立因素（P＜0.05）。見表2。

表2 肺腺癌患者影響因素的多因素COX回歸分析相關(guān)參數(shù)

2.4 miRNA-182表達(dá)對人肺腺癌診斷能力的評價

采用98例人肺腺癌組織和98例正常肺組織miRNA-182的相對表達(dá)量建立ROC曲線，曲線下面積確定為0.95，界值0.52（見圖3）。以該界值對肺癌和正常肺組織重新進(jìn)行判斷，＜0.52判定為肺癌組織，＞0.52判定為正常肺組織。miRNA-182表達(dá)對肺癌診斷的特異性為95.918%（94/98），敏感性為91.837%（90/98），陽性預(yù)測值為 95.745%（90/94），陰性預(yù)測值為92.157%（94/102），陰性似然比為0.085（1-0.91837/0.95918），約登指數(shù)為87.755%（91.837%+95.918%-1），陽性似然比為 22.498（0.91837/1-0.95918）。

圖3 miRNA-182在肺腺癌組織和癌旁正常肺組織表達(dá)的ROC曲線

3 討論

miRNA為一類非編碼RNA分子，對轉(zhuǎn)錄后的基因進(jìn)行調(diào)控[5]。miRNA在細(xì)胞生長多個過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[6]。迄今發(fā)現(xiàn)，作為miRNA家族一員的miRNA-182的異常表達(dá)與人類很多腫瘤相關(guān)，miRNA-182作為一種癌基因或抑癌基因，具有調(diào)節(jié)腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移等功能[7]。新近研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-182在多株肺腺癌細(xì)胞包括SPC-A-1和A549細(xì)胞中表達(dá)高，使PDCD4表達(dá)量下調(diào)，從而加快肺癌細(xì)胞的增殖[8]。

本研究首先發(fā)現(xiàn)，miRNA-182在人肺腺癌組織中的表達(dá)高于正常肺組織，其中低、中分化癌組織中miRNA-182表達(dá)高于高分化組織，TNM Ⅲ、Ⅳ期表達(dá)高于TNM I、Ⅱ期，即腺癌組織惡性程度越高、分期越晚，其表達(dá)量越高。既往YANG等[9]研究得出，在人肺癌早期miRNA-182表達(dá)增加，可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移，與本研究結(jié)果一致。其次，本文COX多因素生存分析提示，miRNA-182表達(dá)狀態(tài)、TNM分期是影響肺腺癌患者預(yù)后的獨立因素，由此可見，miRNA-182對肺腺癌患者的預(yù)后評估有重要作用。最后，本實驗通過對98例人肺腺癌組織及其正常肺組織的miRNA-182相對表達(dá)量建立ROC曲線，明確診斷界值，重新判定肺癌和正常組織，得出其特異性、敏感性及陽性預(yù)測值均高于傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物。雖然該方法有局限性，但是一定程度上表明，miRNA-182對于人肺腺癌的診斷、分期及預(yù)后預(yù)測有重要意義，有望成為腺癌組織形態(tài)學(xué)改變前的分子學(xué)改變，其高表達(dá)預(yù)示腫瘤的高危性或進(jìn)展性。此外BARSHACK等[10]用qRT-PCR和微陣列分析對110個肺原發(fā)腫瘤及肺轉(zhuǎn)移癌組織標(biāo)本進(jìn)行檢測，得出miRNA-182在肺原發(fā)癌中明顯升高，而肺轉(zhuǎn)移癌中miRNA-126過表達(dá)，從而表明miRNA-182可能對鑒別肺轉(zhuǎn)移癌及肺原發(fā)腫瘤有一定意義。

LEI等[11]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-182在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，且與乳腺癌的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。因此miRNA-182并不是肺癌的特有指標(biāo)，應(yīng)聯(lián)合其他腫瘤標(biāo)志物及相關(guān)臨床資料，成為早期診斷肺癌的方法之一。最后，鑒于本研究樣本量有限，還需在多中心大樣本量中進(jìn)一步驗證其應(yīng)用價值。

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MicroRNA-182 expression and its clinical significance in human lung adenocarcinoma*

Yan-feng Fang,Hong-jun Zhang,Fa-guang Jin,En-qing Fu,Xi Lu
(Department of Respiratory and Critical Care Medicine,Tangdu Hospital,the Fourth Military Medical University,Xi'an,Shaanxi 710038,China)

Objective To study the level of microRNA-182(miRNA-182)in human lung adenocarcinomas,and to evaluate its correlations with clinical features and prognosis of the patients with lung adenocarcinomas.Methods The fresh human lung adenocarcinoma tissues and their paired adjacent normal lung tissues of 98 cancer patients,and normal lung tissues of 98 cases with benign lesions were collected.All tissues of surgery or biopsy were confirmed by pathology.miRNA-182 was measured by qRT-PCR.The correlations of miRNA-182 with clinical features and prognosis of human lung adenocarcinomas were analyzed.The ROC curve was used to evaluate the ability of miRNA-182 in diagnosis of human lung adenocarcinomas.Results The level of miRNA-182 in the human lung adenocarcinomas (0.8001±0.2112)was significantly higher than that in the normal lung tissues [(0.2721±0.1216),P＜0.05].The level of miRNA-182 in human lung adenocarcinomas was correlated with TNM stage,lymphatic metastasis,distant metastasis and tumor differentiation (P＜0.05).After further analysis by ROC curve,the results showed that when the cut-off value was set to 0.52,the specificity,the sensitivity and the positive predictive value of miRNA-182 in human lung adenocarcinomas were 95.918%,91.837% and 95.745% respectively.Conclusions Level of miRNA-182 in human lung adenocarcinomas is significantly higher than that in normal lung tissues,it may be an important index for the diagnosis of human lung adenocarcinomas and prognosis evaluation.

miRNA-182;human lung adenocarcinoma;diagnosis;prognosis

R734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.26.013

1005-8982（2017）26-0066-04

2016-10-19

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（No：31300121）[

魯曦，E-mail：luxi1126@163.com

（童穎丹 編輯）