γ—聚谷氨酸發(fā)酵過程中體積氧傳遞系數(shù)的控制

李恩+白雪+冉茂雙+張慧莉

摘要：研究了發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速對(duì)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)速為500 r/min，體積氧傳遞系數(shù)KLa為250 h-1時(shí)，供氧比較合適，γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量為34 g/L。研究結(jié)果為進(jìn)一步通過改善發(fā)酵條件來提高γ-聚谷氨酸的產(chǎn)量奠定了良好基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)速；體積氧傳遞系數(shù)；γ-聚谷氨酸；發(fā)酵；產(chǎn)量

中圖分類號(hào)： S188+.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）17-0286-03

收稿日期：2016-04-08

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：21366028）。

作者簡介：李恩（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：932699007@qq.com。

通信作者：張慧莉，副教授，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。E-mail：79105878@qq.com。γ-聚谷氨酸（poly γ-glumatic acid，γ-PGA）是由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的水溶性多聚氨基酸，由L-谷氨酸、D-谷氨酸通過γ-酰胺鍵結(jié)合形成的高分子聚合物，通常相對(duì)分子質(zhì)量在10萬～100萬之間[1]。作為一種新型的綠色環(huán)保高分子聚合物，γ-PGA具有對(duì)人體和環(huán)境無毒害、可降解、可再生的優(yōu)點(diǎn)，廣泛用作藥物緩釋材料[2]，土壤、沙地的蓄水保水劑[3]，食品的水凝膠[4-5]，化妝品的保濕劑[6]以及高強(qiáng)度纖維[7]等。

微生物發(fā)酵過程優(yōu)化的主要目標(biāo)在于通過一系列調(diào)控措施實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)菌株和/或產(chǎn)物的高產(chǎn)量、高產(chǎn)率和高生產(chǎn)效率[8]。在此過程中，須要對(duì)影響發(fā)酵過程的各種因素進(jìn)行系統(tǒng)分析，包括外因（基于微生物反應(yīng)原理的培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化技術(shù)）和內(nèi)因（基于代謝特性的分階段培養(yǎng)技術(shù)）、外因定量化（基于動(dòng)力學(xué)模型分析的優(yōu)化和控制技術(shù)）和內(nèi)因定量化（基于代謝通量分析的過程優(yōu)化技術(shù)）等，其中動(dòng)力學(xué)模型和代謝通量分析還可以在優(yōu)化的基礎(chǔ)上對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行預(yù)測和驗(yàn)證[9]。

體積氧傳遞系數(shù)KLa是發(fā)酵罐放大的重要參數(shù)之一，目前大多采用氧電極在動(dòng)態(tài)下測定。由溶氧電極測得的響應(yīng)曲線使用傳遞函數(shù)法估算KLa，須要分別實(shí)測2條響應(yīng)曲線來定KLa，另須計(jì)算一階和二階導(dǎo)數(shù)[10]。在聚谷氨酸的生物發(fā)酵生產(chǎn)過程中，由于聚谷氨酸具有的高黏度的特性，導(dǎo)致了發(fā)酵液中后期黏度變大。聚谷氨酸發(fā)酵液的這種高黏度的特性給發(fā)酵過程中氧傳遞、氣液混合以及熱量傳遞等帶來了很大的困難，因此提高聚谷氨酸發(fā)酵中的氧傳遞系數(shù)這一問題也成了提高聚谷氨酸發(fā)酵水平的主要影響因素[11]。

1材料與方法

1.1菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis C10），為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

1.2培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨，5 g/L牛肉膏，10 g/L葡萄糖，5 g/L NaCl，自然pH值；分為固體平面培養(yǎng)基（須加瓊脂粉20 g/L）和液體培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：60 g/L葡萄糖，18 g/L NHCl4，0.5 g/L MgSO4·7H2O，1.5 g/L KH2PO4，0.04 g/L FeCl3·6H2O，0.104 g/L MnSO4·H2O，0.11 g/L CaCl2，20 g/L檸檬酸鈉和20 g/L谷氨酸鈉。

1.3發(fā)酵培養(yǎng)方法

1.3.1菌種活化從甘油管中吸取50～200 μL菌液，稀釋后涂布于平板固體種子培養(yǎng)基上，于32 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.2種子培養(yǎng)使用接種針從種子培養(yǎng)基平板挑取發(fā)育良好的單菌落接種于液體種子培養(yǎng)基上，裝液量為30 mL（250 mL搖瓶，下同），于32 ℃、200 r/min培養(yǎng)12～20 h。

1.3.3發(fā)酵培養(yǎng)將準(zhǔn)備好的種子菌液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10%，裝液量為30 mL，于32 ℃、200 r/min培養(yǎng)36～48 h。

1.3.4發(fā)酵罐培養(yǎng)方法發(fā)酵在15 L發(fā)酵罐（SY-3000E，上海世遠(yuǎn)生物設(shè)備工程有限公司）內(nèi)進(jìn)行，裝液量8 L，基本培養(yǎng)基原位蒸汽滅菌115 ℃，20 min，加入單獨(dú)滅菌的檸檬酸鈉（20 g/L）、谷氨酸鈉（20 g/L）和NH4CL（18 g/L）溶液。種子D600 nm達(dá)到4以上時(shí)接入發(fā)酵罐，接種量8%～10%；溫度自動(dòng)控制為32 ℃，通氣量400 L/h，攪拌轉(zhuǎn)速200～600 r/min。

1.4生物量的測定

細(xì)胞密度的測定：以水為空白對(duì)照，將培養(yǎng)液液稀釋后用Spectrumlab 22PC紫外/可見光分光光度計(jì)于600 nm處測定菌懸液的吸光度。調(diào)整稀釋倍數(shù)使分光光度計(jì)讀數(shù)在0.3～0.8之間。

1.5發(fā)酵液中PGA產(chǎn)量的測定（稱重法）

取10 mL發(fā)酵液，13 000 r/min離心30 min，去除菌體。取5 mL上清液，加入4倍體積甲醇，充分混合，置于4 ℃，30 min。8 000 r/min，10 min離心收集沉淀。棄去上清，沉淀在60 ℃烘干至恒質(zhì)量。將所用離心管精確稱質(zhì)量（萬分之一天平），沉淀烘干前后質(zhì)量相減，即得γ-PGA產(chǎn)量。

1.6葡萄糖含量的測定

采用DNS法進(jìn)行測定[12]

1.7氧傳遞系數(shù)KLa的測定

1.7.1亞硫酸鹽法測定搖瓶體積氧傳遞系數(shù)將50 mL 0.4 mol/L 亞硫酸鈉溶液裝入250 mL的三角瓶中，滴入 1 mL Cu2+，取樣m1=2 mL移入裝有20 mL 0.05 mol/L的碘、碘化鉀溶液置于100 mL三角瓶中。

然后將250 mL三角瓶上搖瓶機(jī)持續(xù)搖150 min后，再取樣m2=2 mL移入另一支裝有20 mL 0.05 mol/L碘、碘化鉀溶液的100 mL三角瓶中。endprint

用0.025 mol/L硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液滴定，在樣品液顏色由深藍(lán)色變成淺藍(lán)色時(shí)，加入1%淀粉指示劑，繼續(xù)滴定至藍(lán)色褪去即為終點(diǎn)。

1.7.2用動(dòng)態(tài)法測發(fā)酵罐的氧傳遞系數(shù)在發(fā)酵穩(wěn)定后溶氧量（DO）穩(wěn)定下降的階段暫停通氣，并將攪拌暫停，根據(jù)培養(yǎng)液中溶氧量變化速率可以求出攝氧率。當(dāng)液體的溶氧量下降到一定程度時(shí)（不應(yīng)低于臨界溶氧量）恢復(fù)通氣，則培養(yǎng)液中溶氧量逐漸升高，最后恢復(fù)到原先的水平[13]。

動(dòng)態(tài)法測定時(shí)，只需測定1個(gè)變量——溶氧量（C）隨時(shí)間的變化，因此對(duì)于安裝有快速響應(yīng)復(fù)膜氧電極的發(fā)酵罐，可以用記錄儀描繪的溶氧量變化曲線（圖1）非常方便地求出。

2結(jié)果與分析

2.1用亞硫酸鹽法測定搖瓶體積氧傳遞系數(shù)

為了給發(fā)酵放大提供依據(jù)，首先用亞硫酸鹽氧化法對(duì)250 mL錐形瓶溶氧性能進(jìn)行測定。在裝液量相同（30 mL）的條件下，測定不同轉(zhuǎn)速下?lián)u瓶的體積氧傳遞系數(shù)。結(jié)果所示，在裝液量相同的情況下，轉(zhuǎn)速越高，KLa的值越高，但其增長速度變緩，產(chǎn)量的增加幅度也隨之變小。由表1可知，最合適的轉(zhuǎn)速為200 r/min，KLa的值為260 h-1左右。

2.2動(dòng)態(tài)法測定發(fā)酵罐的體積氧傳遞系數(shù)

要將搖瓶中的各項(xiàng)優(yōu)化條件在大規(guī)模培養(yǎng)中完全重現(xiàn)是

2.3.1轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)物γ-PGA產(chǎn)量的影響試驗(yàn)中通過改變攪拌轉(zhuǎn)速控制不同的KLa值，從而達(dá)到控制發(fā)酵液的溶氧量水平。發(fā)現(xiàn)低溶氧量對(duì)發(fā)酵不利；隨著溶氧量的提高，聚谷氨酸的產(chǎn)量有明顯增長，發(fā)酵時(shí)間也進(jìn)一步縮短。將KLa值控制在 250 h-1 左右時(shí)，發(fā)酵結(jié)果較好（表3）。

2.3.4對(duì)底物葡萄糖消耗的影響葡萄糖作為聚谷氨酸發(fā)酵的碳源，其消耗曲線可以作為發(fā)酵過程的重要標(biāo)志。低轉(zhuǎn)速（200、300 r/min）下，由于KLa值的低下供氧不足，菌體的生長緩慢，葡萄糖的消耗隨之放緩。把發(fā)酵時(shí)間延長至 48 h 結(jié)束時(shí)，200 r/min轉(zhuǎn)速下葡萄糖剩余接近2/3， 300 r/min 轉(zhuǎn)速

下葡萄糖剩余接近1/2。在400 r/min轉(zhuǎn)速下，隨著KLa值的升高，發(fā)酵36 h結(jié)束時(shí)，葡萄糖剩余僅剩 1/3。而在KLa接近250 h-1（轉(zhuǎn)速為500、600 r/min）時(shí)，葡萄糖在發(fā)酵30 h時(shí)，接近消耗殆盡（圖4）。葡萄糖的消耗變化曲線從另一方面反映了KLa對(duì)發(fā)酵的重大影響。

3結(jié)論

本試驗(yàn)進(jìn)行了聚谷氨酸發(fā)酵過程中有關(guān)供氧條件的研究。結(jié)果表明，在最合適的轉(zhuǎn)速200 r/min下，KLa的最適值為260 h-1左右。在發(fā)酵罐進(jìn)行放大培養(yǎng)以后，得到最合適的發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速為500 r/min，此時(shí)KLa的最適值為250 h-1左右，兩者經(jīng)過相互驗(yàn)證，證明在提高轉(zhuǎn)速的情況下，KLa和產(chǎn)物γ-PGA的增長都極為有限。本研究為后期改良發(fā)酵條件來提高γ-PGA產(chǎn)量奠定了良好基礎(chǔ)，但是在此基礎(chǔ)上從錐形瓶的30 mL擴(kuò)大到發(fā)酵罐的8 L培養(yǎng)體系的過程中，發(fā)酵罐產(chǎn)量只有錐形瓶產(chǎn)量的60%左右，還有進(jìn)一步提升的空間。今后，將研究其他發(fā)酵條件對(duì)聚谷氨酸的產(chǎn)量影響的工作。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.17.075endprint