基于快相熒光的高等植物光合速率測量儀設計

覃志松+趙南京+殷高方+石朝毅+甘婷婷+肖雪+段靜波+張小玲++陳雙+劉建國+劉文清

摘要：通過對植物葉綠素熒光的測量，可以實時獲得植物生理狀態(tài)信息。為了得到植物光合作用速率，通過對光合作用的電子傳遞進行分析，設計基于快相熒光技術高等植物速率測量儀。利用高速脈寬可調技術產(chǎn)生激發(fā)光信號，并利用高速采樣技術獲得微秒量級的快相熒光曲線，最后利用滑動窗口和最小二乘算法在數(shù)字信號處理器（DSP）平臺上計算獲得光合作用參數(shù)最小熒光產(chǎn)率（Fo）、最大光熒光產(chǎn)率（Fm）等信息，并基于光合作用吸收模型計算植物的光合速率（JVPSⅡ）。通過對高溫脅迫條件的高等植物光合參數(shù)進行測量，結果表明，可以獲得光化學效率產(chǎn)率（Fv/Fm）、光合速率（JVPSⅡ）連續(xù)變化趨勢，F(xiàn)v/Fm與國外的PAM技術測量結果線性相關性達到0.982，該測量儀為研究植物光合作用提供了一種新的測量手段。

關鍵詞：光合速率測量；快相熒光；非負最小二乘算法；葉綠素熒光動力學

中圖分類號： X835文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0230-04

作者簡介：覃志松（1977—），男，廣西容縣人，博士，講師，主要從事熒光檢測技術研究。E-mail：zsqin@aiofm.ac.cn。

通信作者：趙南京，博士，研究員，主要從事環(huán)境污染光學與光譜學監(jiān)測新技術與方法研究。E-mail：njzhao@aiofm.ac.cn。光合作用測量的方法包括直接測量法、間接測量法。直接測量法依據(jù)光合作用過程CO2+2H2O→CH2O+O2+H2O，通過測量光合作用過程中反應物消耗速率或產(chǎn)物生成速率反映其生理狀態(tài)[1-2]。常用測量方法是測量有機物的積累速率、CO2氣體交換或光合放氧來反演光合作用速率[3]。20世紀30年代，Kautsky發(fā)現(xiàn)葉綠素熒光誘導現(xiàn)象[4]，以后國內外學者對該現(xiàn)象進行了深入研究，發(fā)展并形成了光合作用熒光誘導理論，成為研究植物光合作用快速而有效的探針[5]。目前廣泛使用Water-PAM作為測量系統(tǒng)[6-8]，其原理根據(jù)Schreiber等提出的脈沖振幅調制技術（pulse amplitude modulation，簡稱PAM），該技術使用飽和脈沖光還原全部PQ和PSⅡ初級電子受體來測量植物光合作用可變熒光產(chǎn)率Fv/Fm參數(shù)[9]。1992年Kolber等提出高速重復脈沖技術（fast repetition rate，簡稱FRR），使用快速光脈沖光激發(fā)誘導熒光產(chǎn)率曲線來反演出光合作用細節(jié)參數(shù)：功能吸收截面σPSⅡ和QB氧化還原時間τQA進行反演[10]；2014年石朝毅等提出了可變光脈沖誘導熒光的檢測方法[11]，對激發(fā)條件進行了詳細的分析。

由于快相熒光技術可在微秒量級的時間分辨率下獲得熒光快速變化曲線，瞬時的激發(fā)條件可獲得更高的信噪比[11]；同時由于測量時間足夠快，使得測量光合系統(tǒng)Ⅱ時，避免了光合系統(tǒng)Ⅰ的電子傳遞影響，使得測量的光合作用參數(shù)更加準確。因此本研究采用快相熒光技術研制植物光速率測量系統(tǒng)，其主要思路是通過應用高速采樣技術獲得熒光動力學曲線，利用非線性回歸分析算法反演獲得Fo、Fm、Fv/Fm，再根據(jù)吸收模型獲得植物光合速率參數(shù)。

1基本原理

光合作用的實質是電子傳遞過程，圖1詳細闡述了電子傳遞和熒光激發(fā)原理[5]。光照后，PSⅡ反應中心發(fā)生原初電荷分離產(chǎn)生強氧化劑P680+，電子傳遞至QA，形成1個相對穩(wěn)定的還原劑QA-；在PSⅡ電荷分離產(chǎn)生1個非常穩(wěn)定的還原劑鐵硫蛋白（FeSX-）和1個弱氧化劑（P700+）。具強氧化勢的P680+可以使水放出1個電子，而QA-具有的還原勢驅動電子“下山”傳遞，最終傳給P700+1個電子。電子傳遞過程中在光合膜兩側建立的質子梯度驅動ATP的合成。PSⅡ電子傳遞過程中存在2個重要的時間節(jié)點：QA到PQ需要100～200 μs，PQ達到PSⅠ幾百微秒到幾十毫秒。

單周轉強光激發(fā)后，PSⅡ大量吸收電子導致在QA處阻塞，反應中心關閉，無法再接收后續(xù)的能量用于光化學反應，其光能僅能以熱量、熒光的形式耗散，引起熒光產(chǎn)率從靜態(tài)最小熒光Fo上升并達到最大熒光產(chǎn)率Fm，葉綠素熒光產(chǎn)率與激發(fā)光能量、PSⅡ的功能吸收截面σPSⅡ及QA的氧化還原狀態(tài)密切相關。根據(jù)FRR原理，光系統(tǒng)在強光激發(fā)下，時刻t與熒光產(chǎn)率函數(shù)可由式（1）表示[12]：

f（t）=Fo+（Fm-Fo）[1-exp（-σPSⅡt）]。（1）

式中：Fm為反應中心完全關閉后的最大熒光產(chǎn)率；Fo為最小熒光產(chǎn)率；Fv=Fm-Fo是最大可變熒光產(chǎn)率；C（x）=exp（1-σPSⅡx）為關閉的PSⅡ反應中心比例；σPSⅡ為PSⅡ功能吸收截面。通過式（1）可獲得光化學效率產(chǎn)率Fv /Fm、功能

吸收截面σPSⅡ等光合作用參數(shù)。

根據(jù)光合作用模型，獲得了上述的光合參數(shù)后，即可根據(jù)光量子吸收模型[13]對光合速率進行計算，由式（2）表示：

JVPSⅡ=Fm·FoFm-Fo·Fv′Fm′·KRELED·E。（2）

式中：Fo、Fm為在暗適應下由式（1）計算得到；Fm′、Fv′（Fm′-Fo）′為在光適應條件下計算獲得；ELED、KR分別表示LED的光照度[以單位時間、單位面積內的通過的光量子數(shù)計，單位：μmol/（m2·s），下同]和光譜糾正系數(shù)，這2個參數(shù)可以采用光譜儀進行測定；E表示環(huán)境光照度，可以使用光傳感器來獲得該參數(shù)，因而光合速率即可根據(jù)式（2）計算獲得。

2系統(tǒng)設計

光合速率測量儀構架如圖2所示，主要包括光學結構、激發(fā)單元、發(fā)射單元和程序算法控制等內容。

光源采用單個激發(fā)波長為560 nm的激光二極管，最大瞬時光照度為30 000 μmol/（m2·s）。由于激發(fā)光具有發(fā)散角度，為更好地匯聚到光纖內，采用透鏡組將其調成平行光后入射到光纖。光纖有15根細光纖組成，分別由6根激發(fā)光纖、9根熒光光纖組成，并設計為“Y”形結構，在1/4處將15根光纖匯成整體結構。光纖的剖面結構如圖3所示，由于激發(fā)光強較為集中，而熒光的發(fā)射是向各個方向分散發(fā)射，為更好地收集熒光，激發(fā)光纖置于內部，而熒光光纖則均勻放置在外圍。為了減少激發(fā)光的反射，設計專用的葉片夾，除了能將外界光照屏蔽以便更好地進行暗適應外，還可以將葉片平整地放置后，將光纖固定并與葉片呈45°。激發(fā)光經(jīng)玻璃濾光片BG39（截止波長650 nm）對樣品激發(fā)產(chǎn)生熒光，葉綠素熒光信號在685 nm效率較高，因此使用帶寬為10 nm的帶通濾波片HB680對熒光濾波再進行熒光檢測。endprint

激發(fā)單元由數(shù)字信號處理器（DSP）產(chǎn)生高速可調脈寬信號，并由驅動器（TC4421A，MICROCHIP）驅動激光二極管產(chǎn)生激發(fā)光信號。TC4421A是強電流緩沖器/驅動器，能夠用9.0 A的峰值電流驅動容性負載，可以驅動大功率N-MOSFET（IRF640，Vishay），可以滿足光脈沖的調制需要。由于瞬時電流可高達十幾安培，為提供足夠強的激發(fā)光強，電路采用3個300 μF并聯(lián)作為儲能元件。有激發(fā)單元產(chǎn)生的快相激發(fā)光強范圍從 2 400～30 000 μmol/（m2·s），最小分辨率為1 200 μmol/（m2·s）。

熒光采用電倍增管模塊（H6779-1，濱松公司）進行信號探測，它包括1個金屬封裝的光電倍增管（PMT）和1個高壓模塊，在685 nm處約為25 mA/W?？刂齐妷簽?.80 V時，探測器電容為10 pF，暗電流為0.4 nA，電流增益約為60 dB，上升時間為0.78 ns，響應特性完全滿足測量要求。

獲得熒光電流信號以后，采用500 MHz寬帶高速放大器OPA637完成I/V轉換，并由DSP內置的高速12位ADC完成轉換并保存在SRAM器件中，作為算法程序的熒光信息。控制和計算過程采用高性能DSP芯片（MK60FX150，F(xiàn)reescale），該DSP芯片采用單指令周期，最高處理速度達210 MIPS，滿足本測量系統(tǒng)的時間要求。該單片機采用Cortex-M4內核，集成有16通道的高精度12位A/D模數(shù)轉換器，采樣速率可達1.0 MSPS，可滿足本研究的高速采樣和數(shù)據(jù)計算的要求。

光照參數(shù)采用光學材料窗口集成的光傳感（NHZD210，武漢中科），量程范圍為0～2 000 lx，DSP使用RS485通信接口與傳感器連接。通過讀指令將光照參數(shù)讀入并保存在DSP的內存中，作為計算光合速率的其中1個參數(shù)。

2.2計算流程

參數(shù)的計算基于嵌入式DSP系統(tǒng)，由于復雜的非線性擬合算法不適用在本系統(tǒng)上運行，本研究對快速下降法進行優(yōu)化，根據(jù)熒光產(chǎn)率曲線采用線性擬合極值法對Fo、Fm進行估計，代入式（1）擬合獲得Fo、Fm和σPSⅡ，結合環(huán)境光照實時曲線計算測量區(qū)間的瞬時光照度Et，結合LED激發(fā)光譜曲線計算獲得Ek（即ELED）和KR參數(shù)，應用式（2）即可獲得該時刻的光合速率JVPSⅡ，詳細計算流程如圖3所示。

3結果與分析

基于快相熒光動力學原理研制的高等植物光合作用參數(shù)

測量系統(tǒng)實物如圖4所示，主要部分由主機、“Y”形導入光纖、樣品夾組成，質量約為3.0 kg，適合進行野外進行植物光合作用測量操作?？梢詫χ参锟煜酂晒鈩恿W曲線進行測量和分析，獲得光合作用細節(jié)參數(shù)Fo、Fm、Fv/Fm參數(shù)，其中 Fv/Fm 與采用PAM技術的國外商業(yè)化儀器 Mini-PAM作對比分析驗證。

高溫脅迫對高等植物光合葉片系統(tǒng)產(chǎn)生及其重要的影響，長時間的脅迫會導致光合系統(tǒng)Ⅱ和光合系統(tǒng)Ⅰ的電子傳遞收到嚴重破壞，主要表現(xiàn)為光合作用速率持續(xù)下降[14-15]，F(xiàn)v/Fm和Y（Ⅱ）和Y（Ⅰ）迅速下降[19]。高溫脅迫試驗選用筆者所在實驗室培育的綠蘿（Epipremnum aureum），其平均光照度約25.0 μmol/（m2·s），綠蘿屬常綠藤本且氣根發(fā)達，生長在溫度較為恒定的環(huán)境中，平均生長溫度在20 ℃左右。高等植物光合參數(shù)測量，由于溫度條件相比其他脅迫如水分、營養(yǎng)鹽、重金屬和毒性試驗條件較為容易建立，因此本研究采用溫度脅迫條件，對高等植物光合參數(shù)變化趨勢進行測量和分析。將儀器和綠蘿植株都置于恒溫箱中，設定溫度從20 ℃至60 ℃，通過人工調控20個檔位，每檔依次升高2.0 ℃。測量周期為30 min/次，測量前進行20 min的暗適應時間。通過連續(xù)監(jiān)測獲得的光合作用參數(shù)變化趨勢如圖5所示。

從圖5-a可知，在常溫25 ℃下，F(xiàn)v/Fm比較平穩(wěn)，隨著溫度的上升，F(xiàn)v/Fm呈現(xiàn)下降趨勢。最終溫度在50 ℃的時候已經(jīng)減弱到0.437，表明植物的光合系統(tǒng)已經(jīng)受損嚴重。其測量結果與Mini-PAM結果一致，線性相關系數(shù)為0.982（圖5-b）。通過對比主要的參數(shù)Fo、Fm和Fv/Fm等，證明本研究的光合速率測量儀的有效性。

4結論

本研究基于快相熒光動力學原理研制了植物光合作用速率測量系統(tǒng)，應用分支光纖方式對激發(fā)光與熒光進行收集，設計快相熒光硬件檢測電路，應用快速下降法算法對熒光曲線反演獲得光合作用參數(shù)信息， 并結合環(huán)境光照信息計算獲得

植物的光合速率。將獲得的光合參數(shù)與PAM技術進行了對比，結果表明具有較好的一致性，本研究成果為植物光合作用研究提供了一種新的測量手段。

致謝：衷心感謝國家環(huán)境保護環(huán)境光學監(jiān)測技術重點實驗室以及國家環(huán)境光學監(jiān)測儀器工程技術研究中心為本研究工作開展所提供的技術與平臺支持。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.17.062endprint