鄰苯二甲酸二甲酯暴露對凡納濱對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶的影響

高平章+簡迪強(qiáng)+呂鳳嬌+謝曉蘭

摘要：以凡納濱對蝦為試驗(yàn)對蝦，通過不同濃度0、2、10、20 μg/L鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）暴露不同時(shí)間（120、240 h）后，采用酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)法及實(shí)時(shí)PCR檢測分析對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶比活力及幾丁質(zhì)酶 mRNA表達(dá)量差異。結(jié)果顯示，DMP暴露對對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶比活力具有抑制作用，但不具有顯著性。不同濃度DMP暴露不同時(shí)間后，對對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶系列基因的mRNA表達(dá)量均受到不同程度的影響，2 μg/L DMP 暴露120 h時(shí)，對蝦殼膜LvCHT3 mRNA 表達(dá)量顯著上升；2 μg/L DMP暴露240 h時(shí)，LvCHT2 mRNA表達(dá)量顯著下降；20 μg/L DMP暴露240 h時(shí)，LvCHT6 mRNA表達(dá)量也顯著下降，說明DMP對對蝦生長發(fā)育具有毒性。

關(guān)鍵詞：凡納濱對蝦；鄰苯二甲酸二甲酯；暴露；殼膜幾丁質(zhì)酶；響應(yīng)機(jī)制；比活力；mRNA表達(dá)量；水體塑化劑監(jiān)控

中圖分類號： S945.4+9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）17-0155-04

通信作者：謝曉蘭，博士，教授，主要從事生物化學(xué)及生態(tài)毒理學(xué)研究。E-mail：xxl_qztc@163.com。凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）別稱南美白對蝦，分類上隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱十足目游泳亞目對蝦科對蝦屬亞屬，在沿海地區(qū)廣泛養(yǎng)殖[1]。福建省地處沿海，海產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是主要產(chǎn)業(yè)，近年來隨著對蝦人工養(yǎng)殖越來越多，養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的問題也越來越多，特別是養(yǎng)殖水體的污染問題。養(yǎng)殖水體中嚴(yán)重超標(biāo)的金屬離子、有機(jī)化合物等都將導(dǎo)致對蝦體內(nèi)生理生化的變化，引發(fā)對蝦的蛻殼困難、生長發(fā)育緩慢、健康程度下降、患病率和死亡率升高等問題[2]。鄰苯二甲酸二甲酯（DMP）、鄰苯二甲酸二乙酯（DEP）、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）等鄰苯二甲酸酯類（PAEs）化合物是常見的塑化劑（別稱酞酸酯），常用作增塑劑添加劑，會(huì)干擾人體內(nèi)分泌和生殖系統(tǒng)，影響人體健康[3-4]。隨著塑料制品的廣泛應(yīng)用，鄰苯二甲酸酯類塑化劑已成為一種分布廣泛的內(nèi)分泌干擾物，對生態(tài)及環(huán)境健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[5-6]。

幾丁質(zhì)酶（EC3.2.1.14）廣泛分布于各種生物體內(nèi)，與對蝦的生長發(fā)育、食物消化及疾病防御密切相關(guān)[7]。幾丁質(zhì)酶是多基因家族，黃乾生等已從凡納濱對蝦中克隆出多個(gè)幾丁質(zhì)酶基因，這些基因具有不同的組織分布特異性，其中凡納濱對蝦幾丁質(zhì)酶基因LvCHT1、LvCHT3和LvCHT4主要表達(dá)于肝胰腺；LvCHT2在眼柄中表達(dá)量；LvCHT6和LvCHT7主要在殼膜中表達(dá)；而LvCHT5組織表達(dá)差異性較小[8]。本試驗(yàn)通過暴露不同濃度的DMP于對蝦生長環(huán)境中，觀察研究暴露不同時(shí)間后，對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶比活力和基因表達(dá)量的變化，從而判斷DMP暴露對對蝦生長發(fā)育的影響。試驗(yàn)結(jié)果有助于闡明幾丁質(zhì)酶對DMP暴露的響應(yīng)機(jī)制及DMP對對蝦生長發(fā)育的影響機(jī)制，同時(shí)也可為對蝦養(yǎng)殖水體的塑化劑監(jiān)控提供借鑒。

1材料與方法

1.1材料與試劑

試驗(yàn)材料為凡納濱對蝦，購于福建省泉州秀土對蝦養(yǎng)殖場，體長約（8.0±1.0） cm。

試驗(yàn)試劑：RNA提取試劑盒，OMEGA bio-tek公司；5×Prime Script Buffer，TaKaRa公司；Taq酶，TaKaRa公司；β-actin 引物（actin-F：5′-TACACCTTCACGACCACCGC-3′；actin-R：5′-TCTCCAGCGAGGAGGAGGAA-3′）、LvCHT2引物（LvCHT2-F：5′-CGGCAAGTACAGACCTGAAGACAT-3′；LvCHT2-R：5′-ATCATAATCAGCCCAAGTGTCGTG-3′）、LvCHT5引物（LvCHT5-F：5′-TGTCTCCGCTTTGGTGAGG-3′；LvCHT5-R：5′-ATGGTGGTGGGCGTATTGTT-3′）、LvCHT6引物（LvCHT6-F：5′-CGCTTTCATCCAACACCACC-3′；LvCHT6-R：5′-CCTCGCGGAGTTCCTTAACC-3′）、LvCHT7引物（LvCHT7-F：5′-CTTGTTCCAGATGGCACTG TATTT-3′；LvCHT7-R：5′-TGGTTCTTGTTCAGGTGTC TTTTC-3′），均由上海生工生物工程股份有限公司合成；牛血清蛋白，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二甲酸二乙酯，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖，天津市福晨化學(xué)試劑廠；其他化學(xué)試劑，均為西隴化工股份有限公司生產(chǎn)，使用的蒸餾水均為玻璃重蒸水。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1酶濃度的測定配制0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液與001%考馬斯亮藍(lán)G-250，取6個(gè)15 mL離心管，將其標(biāo)好號，分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，再加入5 mL考馬斯亮藍(lán)染液，用蒸餾水補(bǔ)足至6 mL，試劑空白對照，用UV-1800紫外分光光度計(jì)測定其在595 nm下的D值，然后以標(biāo)準(zhǔn)蛋白量（μg）為橫坐標(biāo)、以D值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，過原點(diǎn)回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=4.62×0.001x，r2=0.992。采用相同的方法，以提取的幾丁質(zhì)酶液代替標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液測定酶蛋白濃度。

1.2.2凡納濱對蝦DMP暴露試驗(yàn)與取樣凡納濱對蝦在實(shí)驗(yàn)室馴養(yǎng)穩(wěn)定后進(jìn)行暴露試驗(yàn)。對蝦養(yǎng)殖條件：水溫為（22±1） ℃，比重為1.010，鹽度為1%，pH值為7.6。DMP暴露設(shè)計(jì)：設(shè)置4個(gè)DMP梯度濃度組，分別為0、2、10、20 μg/L（二甲亞砜助溶），每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)平行組。暴露試驗(yàn)在 50 cm× 35 cm×30 cm的養(yǎng)殖桶中進(jìn)行，放試液 20 L，隨機(jī)放入試驗(yàn)對蝦50尾，試驗(yàn)期間每天喂食一定量，每天定時(shí)換 10 L 試液，持續(xù)增氧。分別暴露120、240 h后，每桶分別取3尾對蝦，用蒸餾水將取樣對蝦沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分，將殼膜放入研缽中加入適量Tris-HCl緩沖液研磨，置 4 ℃ 抽提1 h后，12 000 r/min下冷凍離心，取中間澄清液，即得幾丁質(zhì)酶粗酶液，冷凍以備分析幾丁質(zhì)酶比活力和mRNA表達(dá)量。endprint

1.2.3幾丁質(zhì)酶比活力的測定參見文獻(xiàn)[9]，以葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)物，采用DNS法測定還原糖濃度，以葡萄糖量（mg）為橫坐標(biāo)、以D500 nm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸曲線方程y=1.25x（r2=0.998）。參照文獻(xiàn)[10]制備膠體幾丁質(zhì)，再用蒸餾水調(diào)膠體幾丁質(zhì)溶液至終濃度為1%。取0.5 mL 1%膠體幾丁質(zhì)溶液和0.5 mL （pH值為 6.0）0.1 mol/L磷酸緩沖液混合后，在45 ℃下預(yù)熱10 min，加入0.3 mL幾丁質(zhì)酶液和02 mL蒸餾水，45 ℃下反應(yīng)1 h，沸水浴20 min終止反應(yīng)，并迅速冷卻后再加入1.5 mL DNS試劑，再沸水浴20 min，冷卻到室溫后用蒸餾水定容至25 mL，搖勻，離心后取上清，并以滅活的等量酶液按上述步驟作空白對照，在500 nm下測吸光度。以還原糖的生成速度來衡量幾丁質(zhì)酶活力。酶活力單位定義為：在45 ℃、pH 值6.0的測活條件下，水解膠體幾丁質(zhì)生成1 μg N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量為1個(gè)活力單位。比活力定義為：1 mg酶蛋白具有的酶活力單位。

1.2.4幾丁質(zhì)酶mRNA表達(dá)量的測定

1.2.4.1總RNA的提取、純化與反轉(zhuǎn)錄快速取約100 mg殼膜加入1 mL RNA-組織裂解液和3顆鋼珠，用勻漿機(jī)勻漿3 min，4 ℃放置30 min，加入200 μL三氯甲烷，混勻，在冰上放置10 min，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液加入250 μL無水乙醇混勻，用HiBind RNA Spin柱子過濾，分別用300、400 mL Wash Buffer Ⅰ沖洗柱子各1次，再用500 mL Wash Buffer Ⅱ沖洗柱子2次，并在10 000 r/min離心1 min去除緩沖液，在14 000 r/min下離心2 min甩干，用40 μL DEPC-水將mRNA溶解轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即得到總RNA。用微量核酸蛋白分析儀測定RNA濃度。

RT-PCR反應(yīng)體系：2 μL的5×Prime Script Buffer（含有Prime Script RTase、RNase Ⅰnhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反應(yīng)Buffer），500 ng RNA，最后用 DEPC-水補(bǔ)足至10 μL；反應(yīng)條件為：37 ℃反轉(zhuǎn)錄15 min，85 ℃ 反轉(zhuǎn)錄酶失活5 s。在該反轉(zhuǎn)錄體系及條件下反轉(zhuǎn)錄得cDNA。

1.2.4.2幾丁質(zhì)酶的實(shí)時(shí)熒光PCR在LightCycle 480 Ⅱ?qū)崟r(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：Taq酶（含有TaKaRa Ex Taq HS DNA 聚合酶、dNTP mixture、Mg2+ 、Tli RNaseH和SYBR Green Ⅰ）10 μL，前后引物（0.4 μmol/L）各0.8 μL，DEPC-水6.4 μL，cDNA模板2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃引物退火20 s，40個(gè)循環(huán)。

1.2.5SPSS數(shù)據(jù)分析將試驗(yàn)數(shù)據(jù)用 SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因子方差（ANOVA）和Duncans統(tǒng)計(jì)分析，得到“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，當(dāng)P<0.05時(shí)，表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1DMP暴露對對蝦殼膜幾丁質(zhì)酶比活力的影響

以“1.2.2”節(jié)的試驗(yàn)方法對凡納濱對蝦進(jìn)行不同濃度DMP的養(yǎng)殖暴露，分別于暴露120、240 h后取樣制備殼膜幾丁質(zhì)酶粗酶液，測定酶濃度和酶活力，SPSS分析比較對蝦在0、2、10、20 μg/L DMP暴露120、240 h下的殼膜幾丁質(zhì)酶比活力變化情況，具體試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.2DMP暴露對對蝦殼膜LvCHT2基因mRNA表達(dá)量的影響

采用“1.2.4”節(jié)的方法，快速取0、2、10、20 μg/L DMP暴露組凡納濱對蝦的蝦殼，提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，記錄其復(fù)制次數(shù)。以Lv-actin為內(nèi)參，根據(jù)文獻(xiàn)[11]中ΔΔCT（差別循環(huán)數(shù)）=（CT，目的基因 -CT，內(nèi)參基因）DMP暴露組-（CT，目的基因-CT，內(nèi)參基因）空白對照組用濃度代替其中的時(shí)間即可計(jì)算在不同濃度下的ΔΔCT 值，再計(jì)算2ΔΔCT 即可得出差別擴(kuò)增倍數(shù)。暴露DMP 120、240 h對LvCHT2 mRNA表達(dá)量的擴(kuò)增結(jié)果見表2。不同濃度DMP暴露120 h后，隨著暴露的DMP濃度增大，LvCHT2 mRNA表達(dá)量起著先降后升的影響趨勢，進(jìn)一步采用SPSS單因素方差分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果得P=0.218<0.05，說明影響趨勢沒有顯著差異。但隨著暴露時(shí)間延長，隨著DMP暴露濃度增大，LvCHT2 mRNA表達(dá)量變成先降后升的趨勢，進(jìn)一步采用SPSS單因素方差分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果得P=0.048<0.05，說明該影響趨勢具有顯著差異。2 μg/L DMP暴露對LvCHT2 mRNA表達(dá)量的影響與其他濃度組（0、10、20 μg/L）相比顯著下降，其中與空白對照組相比，LvCHT2 mRNA表達(dá)量下降78.8%。

2.3DMP暴露對對蝦殼膜LvCHT3 mRNA表達(dá)量的影響

由表 3可見，不同濃度DMP暴露120 h對對蝦殼膜LvCHT3 mRNA表達(dá)量的影響如同對LvCHT2 mRNA表達(dá)量的影響。不同濃度DMP對LvCHT3 mRNA表達(dá)量的影響趨勢也是呈現(xiàn)先降后升的影響趨勢，進(jìn)一步采用SPSS單因素方差分析得P=0.007<0.05，說明影響趨勢具有顯著差異。2 μg/L DMP暴露對LvCHT3 mRNA表達(dá)量的影響與其他濃度組的表

2.6DMP暴露對對蝦殼膜LvCHT7 mRNA表達(dá)量的影響

由表6可見，不同濃度的DMP暴露120 h后，LvCHT7 mRNA的表達(dá)量均受到不同程度的抑制，進(jìn)一步采用SPSS單因素方差分析，結(jié)果得P=0.104>0.05，說明抑制效果沒有顯著性。但隨著暴露時(shí)間的延長，當(dāng)不同濃度的DMP暴露 240 h 后，與空白組相比，LvCHT7 mRNA表達(dá)量出現(xiàn)大幅提升，進(jìn)一步采用SPSS單因素方差分析，結(jié)果得P=0.475>005，說明影響沒有顯著性。與其他濃度組相比，2 μg/L DMP暴露240 h后，LvCHT7 mRNA表達(dá)量的提升幅度最大，與空白組相比，LvCHT7 mRNA表達(dá)量提升了480%。endprint

3討論與結(jié)論

DMP在當(dāng)今社會(huì)生產(chǎn)中大量使用，DMP已經(jīng)成為環(huán)境檢出率較高的重要環(huán)境污染物之一，福建九龍江水樣含有DMP、DEHP、DEP、DOP、BBP和DBP等各種PAEs有機(jī)化學(xué)污染物，最高含量分別達(dá)1.64、3.77、11.70、0.31、0.14、17.20 μg/L[12]。福建泉州灣表層海水中DMP等PAEs 的總含量在18.77～191.51 ng/L 之間，平均值為 82.28 ng/L [13]。PAEs 易溶于脂肪，所以水體中PAEs可在水生動(dòng)物體內(nèi)富集，具有較強(qiáng)的生態(tài)毒性。李文英等對斑馬魚進(jìn)行20 d 的PAEs類物質(zhì)慢性染毒試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨PAEs類物質(zhì)濃度增大和暴露時(shí)間延長，斑馬魚肝臟、鰓中的SOD和ATPase 活力均顯著受到抑制[14]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DMP暴露240 h對對蝦的體長、體質(zhì)量沒有顯著影響，但隨著暴露時(shí)間增長，對蝦的死亡率有所上升；DMP暴露后，與對蝦生長發(fā)育密切相關(guān)的殼膜幾丁質(zhì)酶比活力均出現(xiàn)不同程度下降，但這種抑制效果沒有顯著性，沒有顯著性可能是DMP的暴露時(shí)間不夠長及暴露濃度不夠高。但2 μg/L DMP暴露120 h時(shí)，使對蝦殼膜LvCHT3 mRNA表達(dá)量顯著上升，其他不同濃度組暴露120 h后也出現(xiàn)不同的影響效果，但不具有顯著性；各濃度組DMP暴露120 h對殼膜LvCHT2、LvCHT5、LvCHT6、LvCHT7也均有不同的影響趨勢，同樣不具有顯著性。不同濃度的DMP暴露240 h后，對各種幾丁質(zhì)酶基因的mRNA表達(dá)量也出現(xiàn)不同程度的影響，2 μg/L DMP暴露 240 h 時(shí)，LvCHT2 mRNA表達(dá)量顯著下降；20 μg/L DMP暴露240 h時(shí)，LvCHT6 mRNA表達(dá)量也顯著下降；而其他濃度組暴露240 h對LvCHT2 mRNA、LvCHT6 mRNA的表達(dá)影響均不具有顯著性；各濃度DMP暴露240 h后對LvCHT3、LvCHT5、LvCHT7的mRNA影響也均沒有顯著性。說明DMP暴露具有基因毒性，DMP暴露可能通過對與對蝦生長密切相關(guān)的幾丁質(zhì)酶系基因表達(dá)影響來影響對蝦的生長發(fā)育，這種毒害會(huì)造成永久性毒害并相應(yīng)產(chǎn)生具體的表觀病態(tài)現(xiàn)象。

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