常用化學(xué)消毒劑對殺傷難辨梭狀芽胞桿菌孢子活性的影響

馬曉梅

【摘要】 目的：比較常用化學(xué)消毒劑對殺傷難辨梭狀芽胞桿菌孢子活性的效果。方法：納入常用化學(xué)消毒劑16種，依次編號，第1～4號有效成分為二氧化氯，第5～8號有效成分為過氧乙酸，第9～12號有效成分為次氯酸鈉，第13～16號有效成分為戊二醛。制備難辨梭狀芽胞桿菌孢子病原菌液，比較不同化學(xué)消毒劑在清潔與污濁兩種環(huán)境、1 min與60 min兩種處理時間殺滅難辨梭狀桿菌孢子的強度，以熒光顯微鏡觀察不同化學(xué)消毒劑處理下的孢子殺滅率。結(jié)果：納入研究的16種化學(xué)消毒劑產(chǎn)品，序號1～4的化學(xué)消毒劑的有效成分均為二氧化氯，在清潔與污濁兩種環(huán)境、1 min與60 min兩種處理時間下均可有效殺滅難辨梭狀桿菌孢子。序號5～8的化學(xué)消毒劑有效成分為過氧乙酸，均需消毒60 min才可使兩種環(huán)境中的孢子基數(shù)/消毒后存活數(shù)>104。序號9～12的化學(xué)消毒劑有效成分為次氯酸鈉，清潔環(huán)境下消毒60 min可有效殺滅難辨梭狀桿菌孢子活性，污濁環(huán)境下即使消毒60 min也無法確保達(dá)到有效殺滅效果。序號13～16的化學(xué)消毒劑有效成分為戊二醛，實驗結(jié)果顯示，兩種環(huán)境下、兩種清毒時間均未達(dá)到有效殺滅標(biāo)準(zhǔn)。4種化學(xué)消毒劑以示不同處理中以二氧化氯處理的孢子死亡率最高，為83.54%；其次是過氧乙酸，處理后孢子死亡率為78.85%；戊二醛處理后的孢子死亡率最低，為43.18%。對五組的孢子死亡率進(jìn)行兩兩比較，二氧化氯孢子滅活性優(yōu)于次氯酸鈉、戊二醛、對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（字2=24.265、35.083、57.536，P<0.05）；過氧乙酸孢子滅活性優(yōu)于次氯酸鈉、戊二醛、對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（字2=17.219、26.745、47.465，P<0.05）；次氯酸鈉孢子滅活性優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（字2=8.705，P<0.05）。結(jié)論：在眾多化學(xué)消毒劑中，有效成分為二氧化氯的化學(xué)消毒劑對難辨梭狀芽胞桿菌孢子的殺滅效果較好。在清潔環(huán)境下的消毒效果要優(yōu)于污濁環(huán)境，提示應(yīng)時刻注意保持消毒環(huán)境與設(shè)備清潔。此外，在條件許可情況下，應(yīng)盡量延長消毒時間，以提高對難辨梭狀桿菌孢子的殺滅效果。

【關(guān)鍵詞】 化學(xué)消毒劑； 難辨梭狀芽胞桿菌孢子； 活性

【Abstract】 Objective：To compare the effect of chemical disinfectants in killing spores of Clostridium difficile activity.Method：A total of 16 kinds of chemical disinfectants，numbering in sequence，the effective components of No.1-4 for chlorine dioxide，the effective components of No.5-8 for peracetic acid，the effective components of No.9-12 for sodium hypochlorite，the effective components of No.13-16 for glutaraldehyde.Prepared Clostridium difficile spores bacteria liquid，compared the intensity of different chemical disinfectants in clean and polluted environment，1 min and 60 min two kinds of processing time to kill Clostridium difficile spores，the spore killing rate under different chemical disinfectants was observed by fluorescence microscope.Result：16 kinds of chemical disinfectant products included in the study，chemical disinfectants No.1-4 were chlorine dioxide，might be in the clean and dirty environment，1 min and 60 min two treatment time could effectively kill Clostridium difficile.The effective component of chemical disinfectant No.5-8 was peracetic acid，which could be sterilized by 60 min to make the spore number in the two environments and the survival number after disinfection>104.Chemical disinfectant active ingredients No.9-12 for sodium hypochlorite，clean environment disinfection 60 min could effectively kill Clostridium difficile，spore activity，dirty environment even if 60 min could not achieve effective disinfection efficacy.The experimental results showed that the effective components of No.13-16 were two glutaraldehyde，and the time of the two kinds of chemical cleaning was not up to the standard.The results showed that 4 kinds of chemical disinfectants showed the highest mortality rate of spores treated with chlorine dioxide in the different treatments，the highest was 83.54%，the second was peracetic acid，and the mortality rate was about 78.85% after treatment，the mortality rate of spores treated with glutaraldehyde was the lowest，which was 43.18%.On 5 groups of spore mortality 2 vs 2 comparison，the inactivation of chlorine dioxide spores was better than that of sodium hypochlorite，glutaraldehyde and the control group，the differences were statistically significant（字2=24.265，35.083，57.536，P<0.05）；the spore killing activity of peracetic acid was better than that of sodium hypochlorite，glutaraldehyde and control group，the differences were statistically significant（字2=17.219，26.745，47.465，P<0.05）；the spore killing activity of sodium hypochlorite was better than that of control group，the difference was statistically significant（字2=8.705，P<0.05）.Conclusion：Among the chemical disinfectants， the chemical disinfectant with chlorine dioxide as the effective component is effective for killing spores of Clostridium difficile.The disinfection effect in clean environment is better than that in polluted environment，prompt attention should be paid to keeping the disinfection environment and equipment clean.In addition，disinfection time should be extended as far as possible to improve the efficacy of Clostridium difficile spores.endprint

【Key words】 Chemical disinfectant； Clostridium difficile spores； Activity

First-authors address：Heze Municipal Hospital，Heze 274000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.21.006

難梭狀芽胞桿菌感染是醫(yī)院獲得性腹瀉的主要病因，通過糞-口途徑傳播可形成芽孢，具有強物理、化學(xué)適應(yīng)性，在自然環(huán)境中存活時間長[1]。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，尤其在老年、住院患者中帶菌率較高[2]。研究表明，難辨梭狀芽胞桿菌孢子可在不良環(huán)境中存活數(shù)月[3]。醫(yī)院病房難辨梭狀芽胞桿菌孢子存在的機率較高。由于難辨梭狀芽胞桿菌感染的患者通常有長時間的住院史，導(dǎo)致其易成為院內(nèi)疾病大規(guī)模爆發(fā)的常見原因[4]。本研究對常用化學(xué)消毒劑殺傷難辨梭狀芽胞桿菌孢子活性的效果進(jìn)行比較評價，從而為化學(xué)消毒劑的選用提供參考，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 化學(xué)消毒劑 共納入常用化學(xué)消毒劑16種，依次編號，第1～4號有效成分為二氧化氯，第5～8號有效成分為過氧乙酸，第9～12號有效成分為次氯酸鈉，第13～16號有效成分為戊二醛。

1.2 難辨梭狀芽胞桿菌孢子病原菌液的制備 使用頭孢甲氧噻吩-環(huán)絲氨酸-果糖-黃瓊（CCFA）選擇性培養(yǎng)皿，培養(yǎng)溫度為（37±2） ℃，培養(yǎng)24 h后得到難辨梭狀芽胞桿菌，將培養(yǎng)皿置于4～8 ℃厭氧環(huán)境中，3～5 d后厭氧環(huán)境70 ℃加熱20 min。將難辨梭狀桿菌孢子分別配置成清潔環(huán)境與污濁環(huán)境兩種待測樣本，兩種含白蛋白量分別為0.3%與3%。并將其配制為濃度為106個休眠孢子/mL懸浮液。

1.3 實驗方法

1.3.1 兩種環(huán)境不同處理時間下孢子活性評價 按照消毒劑產(chǎn)品使用說明中所推薦的最低劑量，在厭氧環(huán)境、室溫下分別消毒處理兩種待測樣本1、60 min。以孢子基數(shù)/消毒后存活數(shù)>103作為有效殺滅的評價標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 熒光顯微鏡觀察孢子活性 量取5.0 mL病原菌液注入干凈培養(yǎng)皿，將菌液涂開均勻覆蓋培養(yǎng)皿底部。室溫下自然晾干后，使用噴壺向培養(yǎng)皿里噴灑16種的消毒劑，以培養(yǎng)皿底部均勻噴濕為宜。每種消毒劑均處理3皿，同時1皿噴灑蒸餾水作為對照。另作4皿平行蒸餾水，菌液涂開均勻覆蓋3皿底部，以便作為對照組。待培養(yǎng)皿中消毒劑揮發(fā)后，加入蒸餾水，刮擦皿底，使病菌孢子懸浮于水溶液，集中3皿中懸浮液分析病原菌的存活孢子情況。取1 mL消毒劑處理后的孢子懸浮液與1 mL熒光素二乙酸酯（FDA）熒光染液混合，用熒光顯微鏡觀察孢子活性。經(jīng)FDA單染后，活孢子呈亮綠色熒光，死孢子發(fā)出紅色熒光；計算100個以上孢子中死亡孢子的比率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同化學(xué)消毒劑在不同環(huán)境及處理時間對難辨梭狀桿菌孢子活性的影響 納入研究的16種化學(xué)消毒劑產(chǎn)品，序號1～4的化學(xué)消毒劑有效成分均為二氧化氯，在清潔與污濁兩種環(huán)境、1 min與60 min兩種處理時間下均可有效殺滅難辨梭狀桿菌孢子。序號5～8的化學(xué)消毒劑有效成分為過氧乙酸，均需消毒60 min才可使兩種環(huán)境中的孢子基數(shù)/消毒后存活數(shù)>104。序號9～12的化學(xué)消毒劑有效成分為次氯酸鈉，清潔環(huán)境下消毒60 min可有效殺滅難辨梭狀桿菌孢子活性，污濁環(huán)境下即使消毒60 min也無法確保達(dá)到有效殺滅效果。序號13～16的化學(xué)消毒劑有效成分為戊二醛，實驗結(jié)果顯示，兩種環(huán)境下、兩種清毒時間均未達(dá)到有效殺滅標(biāo)準(zhǔn)。見表1。

2.2 不同化學(xué)消毒劑對孢子活性的影響 二氧化氯處理的孢子死亡率為83.54%，過氧乙酸為78.85%，次氯酸鈉為50.83%，戊二醛為43.18%，對照組為30.34%。二氧化氯孢子滅活性優(yōu)于次氯酸鈉、戊二醛、對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（字2=24.265、35.083、57.536，P<0.05）；二氧化氯孢子滅活性與過氧乙酸相當(dāng)，兩者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義

（字2=0.720，P>0.05）；過氧乙酸孢子滅活性優(yōu)于次氯酸鈉、戊二醛、對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（字2=17.219、26.745、47.465，P<0.05）；次氯酸鈉孢子滅活性優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義

（字2=8.705，P<0.05）；次氯酸鈉與戊二醛孢子滅活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（字2=1.175，P>0.05）；戊二醛與蒸餾水孢子滅活性比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（字2=3.546，P>0.05）。見表2。

3 討論

難辨梭狀芽孢桿菌（c-diff）又稱艱難梭菌，屬厭氧性細(xì)菌，而人的腸道正好是一個相對無氧的環(huán)境，在自然界中屬非常獨特的種類，當(dāng)其進(jìn)入到人或動物體內(nèi)時，會產(chǎn)生一種或多種毒素，從而引起肌肉和軟組織感染、腸道疾病和神經(jīng)中毒性疾病[5]。近年來臨床不合理地濫用抗生素使腸道艱難梭菌具有了耐藥性[6]。醫(yī)院內(nèi)不斷暴發(fā)艱難梭菌的報道出現(xiàn)。2005年因艱難梭菌所致死亡例數(shù)較1997年已翻倍[7]?？股剡M(jìn)入體內(nèi)，打破了腸內(nèi)正常菌群的平衡，導(dǎo)致梭狀芽孢桿菌繁殖生長，產(chǎn)生大量的外毒素。其中外毒素A可綁定黏膜細(xì)胞從而導(dǎo)致出血，由腸道毒素和細(xì)胞毒素組成。外毒素B不能直接定植于黏膜細(xì)胞，但可與被破壞的細(xì)胞綁定，使細(xì)胞損傷加劇。

當(dāng)過度服用抗生素時，其生長速度加快，影響腸道中正常菌群，引發(fā)炎癥，是住院患者最常見的腸道感染的病因，也是主要的院內(nèi)腹瀉的代表，往往感染住院患者，并在體內(nèi)定植[8]。難辨梭狀芽孢桿菌最常見的引發(fā)的疾病為偽膜性腸炎（pseudomenbranous colitis，PMC）與抗生素相關(guān)性腹瀉（antibiotic-associated diarrhoea，AAD）[9]。研究發(fā)現(xiàn)，約20%入院時感染陰性的住院患者在住院期間發(fā)生了AAD[10]，提示抗生素及一些化療藥物可能與難辨梭狀芽孢桿菌所引發(fā)的腹瀉或假膜狀結(jié)腸炎有關(guān)，最常見的是氨芐青霉素、克林達(dá)霉素和頭孢菌素[11]。此外，還可引起腎盂腎炎、腦膜炎、腹腔及陰道感染、菌血癥和氣性壞疽等[12]。近年來已成為醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌之一。難辨梭狀芽孢桿菌可通過手、器材和染菌雜物傳播，其芽孢可在環(huán)境中幸存幾年，其孢子存活能力較強，是供應(yīng)室消毒工作中的難題[13-14]。本研究通過對比常用的不同化學(xué)消毒劑對難辨梭狀芽孢桿菌孢子活性的影響，旨在為醫(yī)院供應(yīng)室消毒劑的選擇提供指導(dǎo)與參考。endprint

目前臨床常用的化學(xué)消毒劑包括醛類、過氧化物類、鹵素類、酚類、醇類、胍類、季銨鹽類等。本實驗共納入常用化學(xué)消毒劑16種，依次編號，有效成分分別為二氧化氯（第1～4號）、過氧乙酸（第5～8號）、次氯酸鈉（第9～12號）及戊二醛（第13～16號）。

過氧乙酸又叫過醋酸，于1902年首次合成。在我國20世紀(jì)70年代至80年代，是我國使用較多的化學(xué)滅菌劑之一，現(xiàn)在仍然是一種廣譜、高效、速效、廉價的滅菌劑，被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)療器械表面、空氣或預(yù)防性消毒。其殺菌機制主要依靠其強大的氧化能力。過氧乙酸的分解產(chǎn)物包括醋酸、過氧化氫、水和氧。其中活性氧起著主導(dǎo)作用。過氧乙酸可與孢子中的酶、氨基酸和核酸發(fā)生廣泛的反應(yīng)，分解DNA的堿基，使DNA雙鏈解鏈和斷裂。此外過氧乙酸還可破壞芽孢的通透性屏障，RNA、DNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)破壞漏出，致使芽孢死亡。

次氯酸的消毒機制主要依賴含氯消毒劑較強的氧化作用。其消毒殺菌原理包括：通過水解作用形成次氯酸，后者再分解產(chǎn)生新生態(tài)氧，新生態(tài)氧具有極強的氧化性，可使病原微生物的蛋白質(zhì)變性；次氯酸分子小，不帶電荷，在殺菌、殺病毒過程中，除了可作用于細(xì)胞壁和病毒外殼，還可滲透入病原微生物體內(nèi)氧化細(xì)菌或病毒內(nèi)的蛋白、核酸和酶等，破壞代謝所必需的酶，導(dǎo)致細(xì)胞代謝失調(diào)，從而殺死病原微生物；此外，次氯酸產(chǎn)生出的氯離子能改變細(xì)菌和病毒的滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。實驗發(fā)現(xiàn)，次氯酸的濃度與其消毒作用成正相關(guān)。

戊二醛于1908年由Harries和Tank首次合成。1962年，美國的Pepper等在尋找新的高效消毒滅菌劑的過程中發(fā)現(xiàn)，乙二醛、丙二醛、丁二醛、戊二醛等雙醛類化合物均有殺芽孢作用，其中以戊二醛最強。此后，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，戊二醛殺菌具有廣譜、高效、快速、腐蝕性小、水溶液穩(wěn)定、受有機物影響小等諸多優(yōu)點[15]。因此被譽為繼甲醛和環(huán)氧乙烷之后，化學(xué)消毒滅菌劑發(fā)展史上第三個里程碑。因其對細(xì)菌繁殖體、芽孢、真菌和病毒均有較強的殺滅作用，因此在醫(yī)療器械消毒中最為常用。戊二醛殺菌原理：醛類消毒劑主要依靠醛基產(chǎn)生殺滅作用。醛基可與肽聚糖發(fā)生反應(yīng)，使細(xì)胞壁破裂；作用于細(xì)胞內(nèi)的核酸，使其無法繁殖；與菌體蛋白的疏基、羥基、羧基和氨基反應(yīng)，破壞菌體蛋白，導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝固變性，從而發(fā)揮殺菌作用。不同濃度的戊二醛殺菌效果有明顯區(qū)別，氣化后活性更強，效果更好[16]。

1811年由英國科學(xué)家Humpheny Davey在實驗初次制備出二氧化氯，但當(dāng)時并未意識到它的用途。二氧化氯最早被應(yīng)用于造紙與紡織工業(yè)中的漂白脫色。近年來，開始作為一種滅菌劑引起人們重視，且被證實具有無毒無害、無殘留、不污染環(huán)境等特點。目前被作為第四代消毒劑，其應(yīng)用不斷得到擴展[17]，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、農(nóng)牧與工業(yè)消毒滅菌、食品保鮮保藏等方面。二氧化氯是國際上公認(rèn)的含氯消毒劑中唯一的高效消毒劑，可以殺滅包括細(xì)菌繁殖體、細(xì)菌芽孢、真菌、分枝桿菌和病毒在內(nèi)的一切微生物[18]。分子是由1個氯原子和2個氧原子組成，共結(jié)合19個電子，外層軌域有一個未成對電子，具有很強的氧化作用，遇到氧氣可產(chǎn)生出生態(tài)氧，以強氧化力進(jìn)行表面電子奪取，使病毒衣殼上的蛋白質(zhì)酪氨酸斷鏈，抑制病毒的特異性吸附，并與病毒蛋白質(zhì)中的氨基酸發(fā)生反應(yīng)，控制病毒蛋白質(zhì)的合成，破壞病毒的酶系統(tǒng)，使病毒失去活性分解而死亡[19]。二氧化氯雖可使病毒表面的蛋白質(zhì)酪酸斷鏈，但它對動植物機體并不會產(chǎn)生不良影響，而原理在于病菌是原核細(xì)胞生物，大多數(shù)的酶系分布于細(xì)胞膜表面，易遭受二氧化氯攻擊，而動物及人是真核細(xì)胞生物酶系深入細(xì)胞質(zhì)之中，不易遭受攻擊[2]。

本實驗中納入研究的16種化學(xué)消毒劑產(chǎn)品，序號1～4的化學(xué)消毒劑在清潔與污濁兩種環(huán)境、1 min與60 min兩種處理時間下均可有效殺滅難辨梭狀桿菌孢子；此4種化學(xué)消毒劑的有效成分均為二氧化氯，提示二氧化氯對于難辨梭狀桿菌孢子有較強的效果。對4種化學(xué)消毒劑所造成的孢子死亡率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示二氧化氯處理的孢子死亡率最高，為83.54%；其次是過氧乙酸，處理后孢子死亡率為78.85%；戊二醛處理后的孢子死亡率最低，為43.18%。對5組的孢子死亡率進(jìn)行兩兩比較，5組的孢子死亡率從高到低順序依次為二氧化氯（83.54%）>過氧乙酸（83.54%）>次氯酸鈉（50.83%）>戊二醛（43.18%）>對照組（30.34%），進(jìn)一步印證了上述結(jié)論。

綜上所述，在眾多化學(xué)消毒劑中，有效成分為二氧化氯的化學(xué)消毒劑對難辨梭狀芽胞桿菌孢子的殺滅效果較好。在清潔環(huán)境下的消毒效果要優(yōu)于污濁環(huán)境，提示應(yīng)時刻注意保持消毒環(huán)境與設(shè)備清潔。此外，在條件許可情況下，應(yīng)盡量延長消毒時間，以提高對難辨梭狀桿菌孢子的殺滅效果。

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（收稿日期：2017-05-22） （本文編輯：張爽）endprint