無(wú)籽刺梨及其近緣種ITS序列分析

陳興銀+石建明+楊鵬+張凱凱+關(guān)萍

摘要：為探討無(wú)籽刺梨及其近緣種的關(guān)系，對(duì)采自貴州興仁的無(wú)籽刺梨（Rosa sterilis S. D. Shi）、貴州安順的光枝無(wú)籽刺梨（Rosa sterilis S.D.Shi var.leioclada M.T.An，Y.Z.Cheng et M.Zhong）及采自貴州遵義、興仁的繅絲花（Rosa roxburghii Tratt.）以及從美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上下載的長(zhǎng)尖葉薔薇（Rosa longicuspis Bertal.）進(jìn)行內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列分析。利用MEGA6.0軟件對(duì)ITS序列進(jìn)行分析，ITS序列總長(zhǎng)為629 bp，其中ITS1序列長(zhǎng)度為253 bp，5.8S長(zhǎng)度為164 bp，ITS2長(zhǎng)度為212 bp；對(duì)無(wú)籽刺梨、繅絲花、長(zhǎng)尖葉薔薇進(jìn)行組合分析，組合1（無(wú)籽刺梨、長(zhǎng)尖葉薔薇、興仁繅絲花）和組合2（無(wú)籽刺梨、長(zhǎng)尖葉薔薇、遵義繅絲花）中整個(gè)ITS序列共有26個(gè)變異位點(diǎn)，占序列總長(zhǎng)度的4.10%，組合3（光枝無(wú)籽刺梨、長(zhǎng)尖葉薔薇、興仁繅絲花）、組合4（光枝無(wú)籽刺梨、長(zhǎng)尖葉薔薇、遵義繅絲花）中共有30個(gè)變異位點(diǎn)，占序列總長(zhǎng)度的4.76%。4個(gè)組合中ITS1變異位點(diǎn)數(shù)都為7個(gè)，占ITS1序列長(zhǎng)度的2.76%，占序列總長(zhǎng)度的1.11%；5.8S序列均沒(méi)有變異位點(diǎn)；組合1、2中ITS2的變異位點(diǎn)數(shù)為19個(gè)，占ITS2序列長(zhǎng)度的896%，占序列總長(zhǎng)度的3.02%；組合3、4中ITS2的變異位點(diǎn)數(shù)為23個(gè)，占ITS2序列長(zhǎng)度的10.8%，占ITS序列總長(zhǎng)度的3.65%。4個(gè)組合中無(wú)籽刺梨與光枝無(wú)籽刺梨都含有2種堿基疊加的變異位點(diǎn)，疊加的2種堿基中1個(gè)來(lái)自長(zhǎng)尖葉薔薇，1個(gè)來(lái)自繅絲花，無(wú)籽刺梨同時(shí)具有繅絲花、長(zhǎng)尖葉薔薇的2種ITS序列。通過(guò)最大簡(jiǎn)約法（MP）進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示，無(wú)籽刺梨與長(zhǎng)尖葉薔薇聚為1支，通過(guò)形態(tài)學(xué)比較發(fā)現(xiàn)，無(wú)籽刺梨與貴州繅絲花、繅絲花較為接近。研究結(jié)果為進(jìn)一步探討無(wú)籽刺梨的物種起源提供了一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：無(wú)籽刺梨；ITS序列；變異位點(diǎn)

中圖分類號(hào)： S685.120.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）17-0042-05

通信作者：關(guān)萍，博士，教授，研究方向?yàn)橹参锓肿由飳W(xué)。E-mail：guanp508@163.com。無(wú)籽刺梨（Rosa sterilis S. D. Shi）別稱搭鉤刺梨，為薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Roses）多年生落葉攀援性灌木，為貴州省特有種[1]。其果實(shí)清爽可口，酸甜適中，并富含維生素C、氨基酸、超氧化物歧化酶（SOD）、多種微量元素等，無(wú)籽刺梨因富含大量維生素C，得名“維C之王”，具有廣闊的食品加工、營(yíng)養(yǎng)保健品等資源開發(fā)前景[2-3]。無(wú)籽刺梨因不能產(chǎn)生可育種子而得名，無(wú)籽刺梨主要通過(guò)扦插進(jìn)行無(wú)性繁殖，而多代的無(wú)性繁殖可能會(huì)導(dǎo)致無(wú)籽刺梨品質(zhì)退化[4]。因此可見，分析無(wú)籽刺梨的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列，可為進(jìn)一步選育無(wú)籽刺梨近緣種進(jìn)行雜交，進(jìn)而保存無(wú)籽刺梨優(yōu)良特性奠定一定理論基礎(chǔ)。

季祥彪等對(duì)無(wú)籽刺梨進(jìn)行形態(tài)解剖研究，認(rèn)為無(wú)籽刺梨有可能是1個(gè)自然雜交種[5]；在時(shí)圣德等報(bào)道的薔薇屬新種中，無(wú)籽刺梨與繅絲花（Rosa roxburghii Tratt）近緣，其形態(tài)主要有小葉數(shù)量、花的顏色、果實(shí)大小及果實(shí)有無(wú)籽的差異[6]。鄧亨寧等利用核基因和葉綠體基因片段進(jìn)行建樹，得出無(wú)籽刺梨為長(zhǎng)尖葉薔薇（Rosa longicuspis Bertal.）和繅絲花的天然雜交種[7]。雜交是指2個(gè)在遺傳上有明顯分化的個(gè)體間的交配，交配后一般不能產(chǎn)生有生殖能力的后代[8]。雜交，特別是異源雜交多倍化是新物種形成、多樣化的重要機(jī)制之一[9]。傳統(tǒng)上通常通過(guò)中間性狀來(lái)判斷一個(gè)種是否為雜交種，但是在一些中間性狀不明顯或者不清楚親本的情況下，此方法會(huì)判斷不準(zhǔn)確。因此，正如Soltis等研究表明，即使已經(jīng)從形態(tài)學(xué)或細(xì)胞遺傳學(xué)上確定某個(gè)物種為雜交種，仍需要其他一些證據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證[10-11]。相較于其他一些新方法，如同工酶、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）等，含有豐富的堿基變化及信息位點(diǎn)的核糖體DNA序列分析更能準(zhǔn)確反映雜交種與親本間的遺傳關(guān)系[12-14]。本研究以天然雜交種無(wú)籽刺梨及其可能的親本繅絲花、長(zhǎng)尖葉薔薇作為研究對(duì)象，以核糖體ITS基因作為分子標(biāo)記，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹分析，探討無(wú)籽刺梨與繅絲花、長(zhǎng)尖葉薔薇在ITS序列上的變化規(guī)律和特點(diǎn)。

1材料與方法

1.1材料

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)來(lái)自14個(gè)無(wú)籽刺梨的親緣物種，其中6個(gè)種的ITS序列由測(cè)序所得，測(cè)序樣品來(lái)自6個(gè)種的新鮮葉片，經(jīng)硅膠干燥后，保存于-20 ℃，材料詳細(xì)來(lái)源見表1。其他8個(gè)種的ITS序列從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載，長(zhǎng)尖葉薔薇是根據(jù)無(wú)籽刺梨ITS序列在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上利用BLAST通過(guò)相似搜索法得到的最為相似的序列，詳見表2。表1供試試驗(yàn)樣品的采集地等信息

樣品編號(hào)材料名稱拉丁學(xué)名采集地1無(wú)籽刺梨Rosa sterilis S.D.Shi貴州省黔西南州興仁縣巴鈴鎮(zhèn)2光枝無(wú)籽刺梨Rosa sterilis S. D. Shi var. leioclada M.T.An，Y.Z.Cheng et M.Zhong貴州省安順市3繅絲花Rosa roxburghii Tratt.貴州省黔西南州興仁縣巴鈴鎮(zhèn)4小果薔薇Rosa cymosa貴州大學(xué)南區(qū)后山5繅絲花Rosa roxburghii Tratt.貴州省遵義市道真縣上壩鄉(xiāng)6金櫻子Rosa laevigata貴州梵凈山

1.2方法

1.2.1DNA提取稱取經(jīng)硅膠干燥的材料10～20 mg，用植物DNA提取試劑盒提取，試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。DNA提取后，用1%瓊脂糖凝膠與紫外-可見分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度，將DNA濃度稀釋至 20 ng/μL，保存?zhèn)溆谩?

1.2.2PCR擴(kuò)增與測(cè)序引物選用ITS1（5′-TCCGTAGG TGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3′）[15]，引物序列由昆明碩擎有限公司合成。25 μL PCR反應(yīng)體系：1 μL DNA模板，各1 μL正反向引物，125 μL Mix，用ddH2O補(bǔ)齊剩余體積。擴(kuò)增程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 10 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共計(jì)38個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min。純化后的PCR產(chǎn)物送至昆明碩擎有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3序列分析測(cè)序得到的序列利用DNAStar中的SeqmanⅡ軟件進(jìn)行編輯和拼接，并進(jìn)行人工矯正。ITS序列的范圍參照GenBank上繅絲花（AB038459.1）序列，確定樣品ITS1、5.8S和ITS2的邊界，拼接好的序列用MEGA6.0軟件進(jìn)行序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，以自展法進(jìn)行檢測(cè)，共循環(huán) 1 000 次，采用最大簡(jiǎn)約法建樹。

2結(jié)果與分析

2.1PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

6個(gè)樣品的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)均有1條明顯的750 bp左右的條帶，與ITS序列大小相似，證明擴(kuò)增程序可行，且擴(kuò)增產(chǎn)物可用于測(cè)序。

2.2ITS序列分析

參照GenBank上繅絲花（AB038459.1）ITS序列的范圍排序，數(shù)據(jù)庫(kù)上的繅絲花序列排序后缺失3個(gè)堿基，2種來(lái)自不同地方的繅絲花及無(wú)籽刺梨、光枝無(wú)籽刺梨、下載的長(zhǎng)尖葉薔薇（FJ416657.1）ITS序列（包括ITS1、5.8S、ITS2）長(zhǎng)度范圍為604～626 bp。遵義繅絲花缺失25個(gè)堿基，無(wú)籽刺梨缺失18個(gè)堿基，光枝無(wú)籽刺梨缺失5個(gè)堿基。長(zhǎng)尖葉薔薇與興仁繅絲花一樣缺失3個(gè)堿基。ITS1序列長(zhǎng)度范圍為231～251 bp，其中興仁繅絲花、長(zhǎng)尖葉薔薇缺失2個(gè)堿基，光枝無(wú)籽刺梨缺失3個(gè)堿基，無(wú)籽刺梨缺失6個(gè)堿基，遵義繅絲花缺失22個(gè)堿基。5.8S序列長(zhǎng)度均為164 bp，沒(méi)有變異位點(diǎn)。ITS2序列長(zhǎng)度為200～211 bp，其中來(lái)自興仁繅絲花、長(zhǎng)尖葉薔薇花的缺失1個(gè)堿基，光枝無(wú)籽刺梨、長(zhǎng)尖葉薔薇序列長(zhǎng)度為208 bp，遵義繅絲花缺失3個(gè)堿基，無(wú)籽刺梨缺失12個(gè)堿基。排序后ITS全長(zhǎng)為629 bp，ITS1序列長(zhǎng)度為253 bp，5.8S序列長(zhǎng)度為164 bp，ITS2序列長(zhǎng)度為212 bp。

2.3形態(tài)學(xué)分析

通過(guò)觀察無(wú)籽刺梨、刺梨新鮮標(biāo)本與貴州繅絲花花期臘月標(biāo)本，同時(shí)參考《貴州植物志》[16]上長(zhǎng)尖葉薔薇的形態(tài)進(jìn)行比較分析，從形態(tài)上來(lái)看，無(wú)籽刺梨的形態(tài)特征與貴州繅絲花、繅絲花較為接近（表3、圖1）。表3無(wú)籽刺梨及其近緣種形態(tài)學(xué)比較分析[6，15]

植物種名葉花果繅絲花橢圓形，長(zhǎng)1.0～2.2 cm，寬0.6～1.2 cm，托葉大部分與葉柄貼生，離生部分展開花單生，稀，1～2朵簇生，花徑5～6 cm，花瓣重瓣至半重瓣，粉紅色至深紅色果實(shí)扁球形無(wú)籽刺梨橢圓形或長(zhǎng)卵形，長(zhǎng)1.3～4.5 cm，寬0.5～2.2 cm，托葉附生于葉柄上，披針形花簇生，5～10朵組成傘房花序，花徑 5 cm，花瓣白色果實(shí)球形，外形略像金櫻子，直徑約2 cm貴州繅絲花橢圓形或長(zhǎng)卵形，長(zhǎng)1.0～3.5 cm，寬0.7～1.8 cm，托葉下部與葉柄貼生，上部離生，呈披刺形花簇生，7～10朵組成傘房花序，花徑 3 cm長(zhǎng)葉尖薔薇卵形，卵狀長(zhǎng)圓形，橢圓形，長(zhǎng)3～7 cm，寬1.0～3.5 cm，托葉大部分與葉柄貼生，離生部分披針形花數(shù)朵至10余朵組成傘房花序，花徑3～4 cm，白色果實(shí)倒卵球形，直徑1.0～1.2 cm

2.4聚類分析

基于ITS序列，利用最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建系統(tǒng)樹，從圖2可看出，來(lái)自貴州遵義和興仁的繅絲花與GenBank上下載的繅絲花序列聚為1支的支持率為98%，貴州銅仁金櫻子與GenBank上下載的金櫻子序列聚單聚為1支的支持率為75%，金櫻子單聚為1支，形態(tài)學(xué)上將金櫻子分在金櫻子組中。無(wú)籽刺梨和光枝無(wú)籽刺梨聚為1支，支持率為99%，無(wú)籽刺梨與光枝無(wú)籽刺梨為同一種，無(wú)籽刺梨和光枝無(wú)籽刺梨與長(zhǎng)尖葉薔薇構(gòu)成姐妹群。碩苞薔薇單聚為1支，根據(jù)形態(tài)學(xué)分類，碩苞組中只含有碩苞薔薇。小果薔薇和木香花聚為1支，形態(tài)學(xué)上將小果薔薇與木香花歸為木香組。腺齒薔薇、尾萼薔薇和玫瑰聚為1支，形態(tài)學(xué)分類中腺齒薔薇、尾萼薔薇和玫瑰為桂味組，蘋果為外類群，其系統(tǒng)發(fā)育樹與形態(tài)學(xué)上分類基本一致。

2.5變異位點(diǎn)及堿基類型

通過(guò)MEGA 6.0對(duì)序列進(jìn)行分析，以無(wú)籽刺梨和光枝無(wú)籽刺梨為中心，進(jìn)行組合分析變異位點(diǎn)、堿基類型。興仁繅絲花、無(wú)籽刺梨、長(zhǎng)尖葉薔薇為第1個(gè)組合，遵義繅絲花、無(wú)籽刺梨、長(zhǎng)尖葉薔薇為第2個(gè)組合，貴州興仁繅絲花、光枝無(wú)籽刺梨、長(zhǎng)尖葉薔薇為第3個(gè)組合，遵義繅絲花、光枝無(wú)籽刺梨、長(zhǎng)尖葉薔薇為第4個(gè)組合。組合1中共有26個(gè)變異位點(diǎn)，占ITS序列總長(zhǎng)度的 4.10%，其中ITS1有7個(gè)變異位點(diǎn)，占ITS1序列長(zhǎng)度的 2.76%，占ITS序列總長(zhǎng)度的1.11%，5.8S中沒(méi)有變異位點(diǎn)，ITS2中含有19個(gè)變異位點(diǎn)，占ITS2序列長(zhǎng)度的8.96%，占ITS序列總長(zhǎng)度的3.02%。組合2、組合1的變異位點(diǎn)數(shù)與變異比例一樣。組合3中總變異位點(diǎn)為30個(gè)，占ITS序列總長(zhǎng)度的4.76%，其中ITS1有7個(gè)變異位點(diǎn)，占ITS1序列長(zhǎng)度的2.76%， 占ITS序列總長(zhǎng)度的1.11%，ITS2

中有變異位點(diǎn)23個(gè)，占ITS2序列長(zhǎng)度的10.8%，占ITS序列總長(zhǎng)度的3.65%。組合4與組合3變異位點(diǎn)數(shù)與變異比例一樣。每個(gè)組合具體的堿基變異類型見表4，其中4個(gè)組合為不同個(gè)體間的4個(gè)重復(fù)，4個(gè)組合中的ITS序列中，無(wú)籽刺梨第46個(gè)位點(diǎn)上發(fā)生了堿基的疊加，在這個(gè)位點(diǎn)上這2個(gè)堿基1個(gè)來(lái)自繅絲花，1個(gè)來(lái)自長(zhǎng)尖葉薔薇。由圖3、表4可以看出，所有組合上的64位點(diǎn)，組合1、組合2上的第63、103、220位點(diǎn)，組合3、組合4上的第104位點(diǎn)都發(fā)生了堿基疊加。

3討論與結(jié)論

光枝無(wú)籽刺梨為安明態(tài)等于2009年發(fā)表的新變種[17]，同年后幾個(gè)月，鄧朝義等在對(duì)無(wú)籽刺梨形態(tài)分類修訂中，對(duì)光

枝無(wú)籽刺梨進(jìn)行歸并[18]。從形態(tài)學(xué)上無(wú)籽刺梨的分類存在一定爭(zhēng)議，基于ITS序列，從構(gòu)建系統(tǒng)樹上可見，無(wú)籽刺梨和光枝無(wú)籽刺梨聚為1支，支持率為99%，即光枝刺梨和無(wú)籽刺梨為同一個(gè)種，其結(jié)果與李旦等運(yùn)用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）分子標(biāo)記和DNA條形碼對(duì)無(wú)籽刺梨的鑒定結(jié)果一致[19]。

根據(jù)孟德爾遺傳學(xué)定律和植物有性生殖的特點(diǎn)可知，當(dāng)2個(gè)親本進(jìn)行雜交時(shí)，如果2個(gè)親本在相同位點(diǎn)上的等位基因序列不同，那么在子代，尤其是F1代中，將會(huì)含有這2種不同序列的等位基因?；贒NA測(cè)序儀的工作原理和測(cè)序反應(yīng)的特點(diǎn)，當(dāng)1個(gè)雜交發(fā)生后，如果2個(gè)親本在同一基因的相同位點(diǎn)上的堿基不同，那么，在其雜交后代的相同基因的相同位點(diǎn)上將檢測(cè)出2種不同的堿基，其中1個(gè)來(lái)自父本，1個(gè)來(lái)自母本，因而在原始測(cè)序圖上，將呈現(xiàn)出這2種堿基峰的疊加[20]。由本研究可知，所有組合上的第64位點(diǎn)，組合1、組合2上的第63、103、220位點(diǎn)均發(fā)生了堿基峰的疊加，此外還有組合3、組合4上的第104位點(diǎn)。從本研究還可以看出，以無(wú)籽刺梨為重復(fù)，來(lái)自興仁、遵義不同個(gè)體繅絲花為對(duì)照的組合1和組合2的變異位點(diǎn)及變異堿基類型基本一致，以光枝無(wú)籽刺梨為重復(fù)，來(lái)自興仁和遵義不同個(gè)體繅絲花為對(duì)照的組合3、組合4的變異位點(diǎn)及變異堿基類型也基本一致。其中第46位點(diǎn)上4個(gè)組合中的無(wú)籽刺梨堿基都為K，均發(fā)生了堿基疊加，且疊加的堿基中1個(gè)來(lái)自繅絲花，另1個(gè)來(lái)自長(zhǎng)尖葉薔薇。組合1、組合2的第103位和組合3、組合4的第104位也發(fā)生相同堿基疊加，其位點(diǎn)不一樣的原因?yàn)樽窳x和興仁繅絲花不同個(gè)體間有堿基缺失，導(dǎo)致排序后堿基位點(diǎn)發(fā)生變化，無(wú)籽刺梨和光枝無(wú)籽刺梨為同一種，其中組合1和組合2中第63位上無(wú)籽刺梨為堿基疊加，而組合3、組合4中的第63位上光枝無(wú)籽刺梨堿基為T，與長(zhǎng)尖葉薔薇堿基一樣，4個(gè)組合中繅絲花和長(zhǎng)尖葉堿基一樣。組合1、組合2上第220位點(diǎn)，以及組合3、組合4上的第221位點(diǎn)情況與第63位點(diǎn)一樣。組合3、組合4在第63、221位點(diǎn)上出現(xiàn)此種情況的原因可能是經(jīng)歷了較長(zhǎng)時(shí)間的繁衍和生境的不同，而導(dǎo)致光枝無(wú)籽刺梨第63位點(diǎn)上的G被替換成了T，第221位上的C被替換成A，ITS2中大多出現(xiàn)繅絲花與長(zhǎng)尖葉堿基一致，無(wú)籽刺梨堿基不一致，如組合1中的第443位點(diǎn)，繅絲花和長(zhǎng)尖葉堿基都為G，無(wú)籽刺梨卻為C，其原因可能是無(wú)籽刺梨上堿基突變，G被C替換，其他變異位點(diǎn)也發(fā)生了替換。即無(wú)籽刺梨與繅絲花、長(zhǎng)尖葉薔薇ITS上的基因變化部分符合孟德爾遺傳學(xué)定律。由本研究還看出，組合1和組合2的疊加堿基比組合3和組合4的多，其原因是組合1和組合2中的來(lái)自興仁的野生無(wú)籽刺梨為原始種，采自時(shí)圣德等在貴州薔薇屬新分類群中發(fā)布的新種無(wú)籽刺梨本種采集地，位于海拔1 500 m興仁縣巴鈴[6]，安順光枝無(wú)籽刺梨則經(jīng)過(guò)大規(guī)模人工無(wú)性栽培繁殖，通過(guò)多次無(wú)性繁殖栽培及環(huán)境改變等都可能導(dǎo)致其堿基發(fā)生變化。

綜上所述，無(wú)籽刺梨核基因序列與繅絲花和長(zhǎng)尖葉薔薇的核基因序列上部分堿基符合孟德爾遺傳學(xué)定律，從用最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建的進(jìn)化樹來(lái)看，無(wú)籽刺梨與長(zhǎng)尖葉薔薇聚為1支，形態(tài)上對(duì)比可知，無(wú)籽刺梨與貴州繅絲花較為接近。文曉鵬等認(rèn)為，無(wú)籽刺梨為貴州繅絲花的高度不育種[21]。貴州繅絲花僅存1份花期標(biāo)本，存于貴州大學(xué)南校區(qū)博物館內(nèi)，未見果期標(biāo)本，且筆者于2016年多次在貴州繅絲花采集地花溪進(jìn)行搜尋采樣，未發(fā)現(xiàn)貴州繅絲花，并對(duì)貴州繅絲花標(biāo)本葉片進(jìn)行DNA反復(fù)提取，由于年代久遠(yuǎn)，未提取到貴州繅絲花DNA，所以無(wú)法獲取有關(guān)貴州繅絲花的分子信息，基于上述情況，無(wú)籽刺梨與貴州繅絲花的親緣關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

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