復(fù)合植物提取物的安全性及抗球蟲作用的研究

孫 靜 王 振 張榮飛

（1.天津納爾生物科技有限公司，天津300457；2.北京五洲恒通認證有限公司，北京100068）

復(fù)合植物提取物的安全性及抗球蟲作用的研究

孫 靜1王 振2張榮飛1

（1.天津納爾生物科技有限公司，天津300457；2.北京五洲恒通認證有限公司，北京100068）

雞球蟲病是一種危害大且難以防治的寄生蟲病，該病可對養(yǎng)雞業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。本研究新型的復(fù)合植物提取物，通過細胞毒性試驗，驗證產(chǎn)品的安全性，然后根據(jù)最低有效濃度，設(shè)計體外試驗，研究產(chǎn)品對艾美爾球蟲病的抑制活性。結(jié)果顯示，該產(chǎn)品可以在一定濃度下可以有效地抑制球蟲病，且無細胞毒性。

植物提取物 細胞毒性 球蟲病

艾美耳球蟲和隱孢子蟲的寄生蟲無處不在，在原生動物以及在人類的免疫抑制人群，及其發(fā)展和傳播的風(fēng)險是持續(xù)的。

雞球蟲病由寄生在雞腸上皮細胞內(nèi)的艾美耳屬多種球蟲原蟲引發(fā)[1]。作為嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的全球流行性雞病之一，該病的發(fā)生率較高，分布范圍廣，危害嚴(yán)重，其病死率可達35%～82%。全球因雞球蟲病造成的經(jīng)濟損失可以達到1億～3億元美元[2，5]，給禽類養(yǎng)殖造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。長期以來，養(yǎng)殖業(yè)一直依賴于抗球蟲藥物，化學(xué)藥物和抗生素類藥物對雞球蟲有積極的治療作用，但是也產(chǎn)生極大的耐藥性[6，7]，而且這些藥物造成了雞肉和雞蛋中的藥物殘留，給人類食品安全帶來極大隱患，同時也不利于養(yǎng)殖業(yè)健康的發(fā)展[8]。

本實驗室研制出一種蛋雞用復(fù)合型植物提取物產(chǎn)品，體外試驗研究顯示了產(chǎn)品的安全性和良好的抗球蟲效果。

1 T-Rova細胞安全性評價

1.1 材料和方法

1.1.1 試驗材料

試驗細胞系：本次試驗選用了英國Rovamycine，100g/瓶，購自上海浩然生物技術(shù)有限公司，細胞被稱為T-Rova。

1.1.2 主要試驗用試劑

復(fù)合植物提取物，公司自有；MTT，F(xiàn)luka公司；細胞培養(yǎng)液M EM，GIBCO公司；胎牛血清，北京生物制品研究所；臺盼藍染色劑等。

1.1.3 試驗儀器

酶標(biāo)儀，Tecan Infinite F50，瑞士帝肯；二氧化碳培養(yǎng)箱，ICW190/ICA175，德國IRM；96孔培養(yǎng)板，康寧3599，北京賽因坦科技有限公司；生物顯微鏡，Eclipse Ni-U，日本尼康等。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)液的制備

100μl普通培養(yǎng)基加入15%～20%的胎牛血清，制備成細胞培養(yǎng)液。

1.2.2 試驗過程

在對照孔（T）中加入：100ul含有5000 TG180細胞培養(yǎng)液中加入100μl普通培養(yǎng)基（含15%～20%的胎牛血清）[9]。

試驗組中加入：100ul含有5000 TG180細胞培養(yǎng)液中加入100μl產(chǎn)品，作連續(xù)倍比稀釋

稀釋濃度分別為1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64。

1.2.3 臺盼藍染色法

將1×105細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板（100ul/孔），將7組試驗組和1組試驗組放于37°二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)[10]。5%C O2+95%空氣條件下培養(yǎng)四天后取出，通過生物顯微鏡觀察，細胞生長狀況，離心收集每四個孔板中的細胞，用臺盼蘭染色在顯微鏡下觀察、計數(shù)，活細胞不容易被染色，平滑，圓整，分離的；死細胞是藍色，無活力，呈海膽狀。吸取少量經(jīng)過染色的細胞，用血細胞計數(shù)板計數(shù)。計算活細胞率。

1.2.4 比色法

加入MTT液繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸除原液，加入DMSO，振蕩10min。用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長為630 nm下測定吸光度值，根據(jù)公式計算細胞的相對增殖度（RG R）[11]。

1.3 結(jié)果分析

通過細胞計數(shù)法計算活細胞率，對比不同組的試驗結(jié)果。

表1 球蟲病在畜牧業(yè)中的分類

表2 T-Rova細胞毒性反應(yīng)結(jié)果

通過試驗結(jié)果可知，稀釋到1/8濃度，該產(chǎn)品無細胞毒副作用，不影響細胞的正常生長和增殖。

2 抗球蟲有效性試驗

2.1 試驗方法

本研究的有效性試驗濃度由1/8開始。研究中有兩個對照組，一個對照組不含有球蟲，與其他含有球蟲對比檢驗細胞是否生長正常[12]。

2.2 試驗過程

對照組一（T1）無球蟲加入：100μl含有5000 TG180培養(yǎng)基加入150μl普通培養(yǎng)基。

對照組二（T2）有球蟲加入：100μl含有5000 TG180培養(yǎng)基加入100μl含有200艾美爾球蟲再加入50ul普通培養(yǎng)基。

試驗組中加入：100ul含有5000 TG180培養(yǎng)基加入100ul含有200艾美爾球蟲再加入50μl此時產(chǎn)品濃度的5倍，最終稀釋濃度為1/16、1/64、1/128。

將96孔板放置于37°二氧化碳培養(yǎng)箱中，5%C O2+95%空氣混合條件下，培養(yǎng)4d。

2.3 結(jié)果分析

試驗結(jié)果在低倍顯微鏡下觀察得出，陰性結(jié)果表明生長狀況不好，標(biāo)記為（-），陽性試驗結(jié)果表明生長狀況良好，標(biāo)記為（+），可以看到菌群迅速增殖，細胞破裂后又長出新的球蟲細胞[13，14]。

圖1 抗球蟲有效性試驗結(jié)果

反復(fù)進行生物學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在1/16濃度處有一個陽性對照，此外在1/16濃度處的細胞毒性結(jié)果表明此濃度下細胞可以緩慢生長[15]。1/32濃度下產(chǎn)品對所有孔板中的球蟲起到抑制作用，說明該濃度下產(chǎn)品對球蟲有良好的抑制作用。

3 討論

在我國植物資源豐富，尤其是藥用植物品類繁多，并且毒副作用小，無藥物殘留，不易產(chǎn)生耐藥性。不同于化學(xué)藥品只有單一的功能，本研究中利用天然植物薄荷、牛至等復(fù)合成新型的飼料添加劑產(chǎn)品，通過多種植物提取物互相促進、協(xié)同作用，可以有效地抑制球蟲病。

細胞安全性試驗結(jié)果表明：在≤1/8濃度下，添加產(chǎn)品的T-Rova細胞系可以正常生長和增殖，表明此濃度下不影響細胞正常的生長，無毒性反應(yīng)。

抗球蟲有效性試驗結(jié)果表明：在1/16濃度下，產(chǎn)品具有的抑制球蟲效果，在1/32濃度下，產(chǎn)品具有顯著的抑制球蟲效果，且此濃度下的細胞可以正常生產(chǎn)，無毒性反應(yīng)。

綜上所述，本研究中的復(fù)合植物提取物對球蟲有良好的抑制效果[16，17]，且不影響細胞的正常生長，不破壞細胞性能。產(chǎn)品來源于植物提取物，安全性高[18]，有望開發(fā)成新型的抗球蟲飼料添加劑產(chǎn)品。

[1]馬海利，鄭明學(xué)，李元平，等.中藥抗柔嫩艾美爾球蟲機制研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2001，23（1）：33-35.

[2]汪明，孔繁瑤，殷佩云，等.10株柔嫩艾美耳球蟲對四種藥物的抗藥性檢測[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1996，1（5）：110-114.

[3]劉永舉，郭世寧.中藥對雞人工感染柔嫩艾美耳球蟲的療效觀察[J].中獸醫(yī)學(xué)雜志，2000，（1）：3-4.

[4]劉萍，周茂林，胡海，等.抗球蟲中藥制劑“雞球康”對雞球蟲病的療效實驗[J].四川畜牧獸醫(yī)，1998，12（1）：13-17.

[5]費陳忠，薛飛群，趙其平.中草藥制劑T F-103抗雞柔嫩艾美耳球蟲病的臨床試驗[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2004，（5）：48-50.

[6]李致寶.化學(xué)抗球蟲中藥和中草藥對球蟲病的療效對比試驗[J].畜禽業(yè)，2000，（8）：16-17.

[7]杜愛芳.中草藥復(fù)方制劑對雞柔嫩艾美耳球蟲的療效研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2001，（3）：9-11.

[8]李蘊玉，李佩國，陳麗鳳，等.地克珠利與中藥聯(lián)合應(yīng)用對雞球蟲病的療效試驗[J].中國獸醫(yī)科技，2002，32（4）：26-27.

[9]黃哲瑋，孫皎，孟愛英.兩種體外細胞毒性檢測方法的比較研究[J].生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)進展，2005，26（4）：205-207.

[10]高梅，曹沖，馬會，等.細胞毒性試驗中兩種細胞計數(shù)方法的比較[J].醫(yī)學(xué)動物防治，2016，（12）：1313-1316.

[11]張茂貴.畜禽常用抗球蟲藥的使用和中毒診斷[J].現(xiàn)代畜牧科技，2017，（3）：68.

[12]周佰峰.雞球蟲病的診斷與防治技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，2016，33（4）：98.

[13]Xu，Z.Y.，E.Fitz，N.Riediger，and M.H.Moghadasian.Dietary octacosanol reduces plasma triacylglycerol levels but not atherogenesis in apolipoprotein E-knockoutmice[J].Nutr.Res，2007，（27）：212.

[14]Gouni-Berthold，I.，and H.K.Berthold.Policosanol：clinical pharmacology and therapeutic significance of a new lipid-lowering agent[J].Am.Heart.J，2002，（143）：356-365.

[15]Singh，D.K.，L.Li，and T.D.Porter.Policosanol inhibits cholesterol synthesis in hepatoma cells by activation of AMP-kinase[J].Pharmacol.Exp.Ther，2006，（318）：1020-1026.

[16]Junk，S.M.，A.Dharmarajan，and J.L.Yovich.FSH priming improves oocytematuration，but priming with FSH or hCG has no effect on subsequent embryonic development in an in vitromaturation program[J].Theriogenology，2003，（59）：1741-1749.

[17]Schoevers，E.J.，A.Kidson，J.H.M.Verheijden，and M.M Bevers.Effect of follicle-stimulating hormone on nuclear and cytoplasmicmaturation of sow oocytes in vitro[J].Theriogenology，2003，（59）：2017-2028.

[18]Wang，H.B.，G.L.Xia，L.I.Mei-Ling.Effects of Recombinant Human Follicle-Stimulating Hormone and Epidermal Growth Factor on the Development of Oocyte-Granulosa Complexes of Immature Mice in vitro[J].Develop.Reprod.Bio，2001，（10）：21-30.

國家科技支撐計劃 含有米糠活性物質(zhì)的安全高效新型飼料添加劑的研究與應(yīng)用（14ZCZDNC00006）

孫靜，碩士，畜牧師，動物遺傳育種與繁殖專業(yè)。