循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞在恩度聯(lián)合NP方案治療非小細(xì)胞肺癌中的變化及意義

楊宏　韓震　何敏　張翠英

【摘要】 目的：探討肺癌患者恩度聯(lián)合NP方案化療前后外周血循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞（CECs）以及活性循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞（aCECs）的變化及其臨床意義。方法：用流式細(xì)胞儀對2013年5月-2015年10月本院20例健康人（對照組）及68例肺癌患者（治療組）治療前后外周血CECs及aCECs進(jìn)行檢測。結(jié)果：對照組外周血CECs及aCECs的數(shù)量均低于治療組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。恩度聯(lián)合NP治療后CECs及aCECs數(shù)目出現(xiàn)分層變化，其中臨床獲益（CR+PR）患者CECs及aCECs數(shù)目與治療前比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；臨床進(jìn)展（PD）患者CECs及aCECs數(shù)目與治療前比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；臨床穩(wěn)定（SD）患者CECs及aCECs數(shù)目變化分層、CECs數(shù)目變化與治療前比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），aCECs數(shù)目與治療前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：恩度通過對腫瘤血管生成的負(fù)性調(diào)節(jié)，提高了抗腫瘤效果并抑制腫瘤生長速度，CECs及aCECs的聯(lián)合檢測可能是恩度聯(lián)合NP方案治療肺癌的較好療效預(yù)測指標(biāo)。

【關(guān)鍵詞】 恩度； 循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞； 活化循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞

The Changes and Significance of Circulating Endothelial Cells in Non-small Cell Lung Cancer Treatment of Endostar Combined with NP Regimen/YANG Hong，HAN Zhen，HE Min，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（27）：023-026

【Abstract】 Objective：To discuss the changes of endothelial cells（CECs） in peripheral blood circulation（CECs） and the changes of the active circulating endothelial cells（aCECs） and its clinical significance in patients with lung cancer patients.Method：CECs and aCECs were detected in 20 healthy people （the control group）and 68 lung cancer patients（the treatment group）by flow cytometry before and after treatmnet from June 2013 to October 2015.Result：The number of CECs and aCECs in control group were significantly lower than those of the treatment group，the differences were statistically significant（P<0.001）. Endostar combined with NP after the treatment of CECs and the number of aCECs layered changes，the number of CECs and aCECs in patients with clinical benefit（CR+PR） were decreased than before treatment，the differences were statistically significant（P<0.001），there were no significant differences of the number of CECs and aCECs in patients with clinical progress（PD） before and after treatment（P>0.05）.The number of CECs and aCECs in patients with clinical stability（SD） was stratified，and there were no significant differences CECs before and after treatment（P>0.05），and the differences of aCECs number before and after treatment was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Endostar can improve anti-tumor therapeutic effect and inhibit tumor growth speed by negative regulation of tumor angiogenesis， the combined detection of CECs and aCECs may be a good predictor to evaluate the Endostar combined with NP chemotherapy in patients with lung cancer.

【Key words】 Endu； Circulating endothelial cells； Activated circulating endothelial cells

First-authors address：Inner Mongolia Peoples Hospital，Hohhot 010017，Chinaendprint

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.27.007

非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer）是肺癌的特發(fā)病例，也是肺癌患者中占據(jù)比例較大的疾病類型，臨床統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，其占肺癌總數(shù)的75%～85%，且診斷難度較大[1]。恩度（Endostar）是我國自主設(shè)計(jì)研發(fā)的抗新生血管生成療法，治療機(jī)制以建立足夠的血管系統(tǒng)，從而為其生長提供氧氣和營養(yǎng)為目標(biāo)，對抑制血管生成和腫瘤生長具有遏制作用[2]。恩度聯(lián)合化療成為NSCLC一線治療非小細(xì)胞肺癌的可行性方案[3]。但是恩度價(jià)格很高而且有一定的副反應(yīng)，因此有必要尋找一種方法來預(yù)測其療效，從而可以指導(dǎo)臨床選擇減少患者不必要的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的方案，真正做到精準(zhǔn)治療?？寡苌伤幬锿ㄟ^抑制VEGF-VEGFR途徑來抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性生長。是調(diào)節(jié)血管生成細(xì)胞因子、誘導(dǎo)血管新生和抑制腫瘤生長方面起著重要作用，國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)它能在體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生、反映腫瘤血管生成及監(jiān)測血管治療藥物療效的標(biāo)記物[4]。其中活化內(nèi)皮細(xì)胞（activited Circulating endothelial cells，aCECs）更可以反映腫瘤的新生血管生成的活力[5]。本研究選用恩度聯(lián)合NP方案治療ⅢB/Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌，聯(lián)合檢測治療前后患者血清CECs、aCECs水平的變化，分析和比較變化的意義，為臨床決策提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年5月-2015年10月本院68例組織病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診的晚期非小細(xì)胞肺癌患者為治療組，具體納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)研究結(jié)果證實(shí)，確診為晚期非小細(xì)胞肺癌患者；KPS評分：0～1分；無化療禁忌證及抗血管生成藥物禁忌證患者。其中男41例，女27例，年齡45～72歲，平均（59±14）歲；鱗癌25例，腺癌43例；Ⅲb期4例，Ⅳ期64例。另選取健康人20例作為對照組，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）健康自愿者；（2）年齡20～70歲；（3）排除心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、腫瘤的患者。其中男15例，女5例，年齡37～64歲，平均（52.0±13.5）歲。兩組的一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 治療組為NP（長春瑞濱+順鉑）方案聯(lián)合恩度，具體為：長春瑞濱25 mg/m2，第1、8天，靜滴；順鉑25 mg/m2，第2～4天，靜滴，并在化療第1～14天靜脈滴注恩度15 mg，每21天為1個(gè)療程，至少完成2周期上述方案方可評價(jià)療效，至多不超過6個(gè)周期。

1.2.2 儀器與試劑 流式細(xì)胞儀（FACS AriaTM Cell Sorter）由美國Becton Dickinson公司生產(chǎn)；Beckman-Coulter公司生產(chǎn)的CD45-PE-Cy5抗體（PN：Im2653U）、CD146-PE抗體（Cat：550315）、CD106-FI TC抗體（Cat：551146），天津?yàn)笊镉邢薰镜牧馨图?xì)胞分離液（Cat：LTS1077），溶血?jiǎng)?.83%的氯化銨溶液，PBS液由本實(shí)驗(yàn)室自行配制。

1.2.3 檢測方法 采用熒光抗體標(biāo)記，流式細(xì)胞儀檢測。（1）標(biāo)本采集：健康對照組在體檢中心體檢時(shí)采血。NSCLC患者：在第一周期治療前1 d和第二周期的第22天采血。兩次取清晨靜脈血，分別為1 mL靜脈血和5 mL靜脈血于EDTA抗凝管4 ℃冰箱保存血，6 h處理后并用流式細(xì)胞儀自動(dòng)檢測CECs和aCECs。（2）標(biāo)本處理：應(yīng)用細(xì)胞分離技萃取單個(gè)核細(xì)胞約1.5 mL，以3倍PBS液1300 r/min離心5 min，取細(xì)胞懸液100～200 μL備測；三種流式試管CD45-PE-Cy5、CD146-PE、CD106-FITC容積分別為2、10、10 μL同時(shí)加入50 μL備測細(xì)胞懸液，搖勻震蕩，室溫下避光15 min；再于三試劑內(nèi)加入溶血?jiǎng)?00 μL，搖勻震蕩，室溫下避光10 min；完全溶血后在15 min內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。（3）標(biāo)本檢測：檢測前對設(shè)備性能進(jìn)行質(zhì)控，對光流路質(zhì)量調(diào)控和熒光補(bǔ)償?shù)脑试S范圍進(jìn)行定性，嚴(yán)格散射光信號(hào)對單個(gè)核細(xì)胞群進(jìn)行設(shè)門，標(biāo)本獲取設(shè)門內(nèi)細(xì)胞>100 000個(gè)，再據(jù)以Li stmode文件對檢測數(shù)據(jù)及其占比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)記錄。

1.3 療效評估標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)胸部CT、腦MR、骨掃描及腹部B超對比，2009年RECIST1.1版實(shí)體腫瘤療效評定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估。按照RECIST標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)療效，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩(wěn)定（SD）和進(jìn)展（PD）。CR：全部病灶消失，維持4周以上；PR：病灶縮小至少30%，維持4周以上；SD：介于部分緩解和進(jìn)展之間；PD：病灶增加超過20%，或出現(xiàn)新病灶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者治療情況 治療組68例患者中，可評價(jià)療效為44例，均至少完成2周期恩度聯(lián)合NP方案治療，沒有患者達(dá)到完全緩解（CR），9例患者部分緩解（PR），29例患者穩(wěn)定（SD），6例患者病情進(jìn)展（PD）。其余24例患者因各種原因未能完成治療。

2.2 兩組治療前CECs及aCECs數(shù)量比較 治療組68例晚期NSCLC患者化療前CECs數(shù)目明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。治療組化療前aCECs數(shù)目明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。對NSCLC患者進(jìn)一步分層分析顯示：治療前鱗癌的CECs及aCECs數(shù)目分別為（2677.0±208.5）、（997.0±110.5）個(gè)/mL，與腺癌的（2705.0±204.3）、（890.0±103.2）個(gè)/mL比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。endprint

2.3 治療組治療前后CECs及aCECs數(shù)量比較 治療組44例可評價(jià)療效NSCLC患者中，化療后外周血中CECs的數(shù)目較化療前變化出現(xiàn)分層。其中CR+PR患者外周血CECs數(shù)目較治療前降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；SD、PD患者外周血CECs數(shù)目與治療前比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。治療后CR+PR、SD患者外周血aCECs數(shù)目均低于治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；PD患者治療前后比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.545）。見表2。

3 討論

抗血管生成藥物通過抑制VEGF-VEGFR途徑來抑制內(nèi)皮細(xì)胞，在腫瘤生長中能加快結(jié)構(gòu)、功能異常的腫瘤血管的形成，產(chǎn)生大量的腫瘤血管[6-7]。其中aCECs是由成熟CECs被激活后進(jìn)入循環(huán)中轉(zhuǎn)變而成，通常在腫瘤周圍并參與形成新生血管。因?yàn)閮烧咴谀[瘤血管新生和腫瘤生長方面起著重要作用，所以筆者假設(shè)其數(shù)量變化可能反映血管生成的變化以及恩度的療效。目前有研究認(rèn)為其有可能為血管靶向藥物的理想標(biāo)記物[8-9]。其中活性CECs（aCECs）可以更好地反映腫瘤新生血管生成的活力。國內(nèi)也有關(guān)于CECs在不同腫瘤中的相關(guān)研究[10-11]。

本研究聯(lián)合檢測恩度聯(lián)合NP方案治療晚期NSCLC前后的CECs及aCECs變化，并對健康人群（對照組）與NSCLC患者（治療組）的CECs及aCECs進(jìn)行比較和探討。本研究結(jié)果顯示，對照組CECs與aCECs的數(shù)量均低于治療組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），這與文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道結(jié)果一致。同時(shí)本研究中所有完成2周期恩度聯(lián)合NP方案治療的患者在治療后的平均CECs與aCECs的數(shù)量比治療前出現(xiàn)了不同情況的變化，經(jīng)過分層后結(jié)果又有不同，其中CR+PR患者外周血CECs數(shù)目較治療前降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；SD、PD患者外周血CECs數(shù)目與治療前比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。治療后CR+PR、SD患者外周血aCECs數(shù)目均低于治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；PD患者治療前后比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.545）。文獻(xiàn)[14]研究結(jié)果顯示化療造成CECs下降。

以內(nèi)皮抑制素最為理想，它不僅抑制腫瘤血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移，使腫瘤細(xì)胞凋亡，而且不產(chǎn)生耐藥，毒副作用輕[15-16]，NP+恩度方案聯(lián)合熱療治療晚期非小細(xì)胞肺癌是合理、安全、有效的一種可行性方案，而恩度聯(lián)合放化療同步治療可以提高局部晚期非小細(xì)胞的局部控制和生存率，恩度聯(lián)合順鉑局部灌注治療晚期NSCLC合并胸腔積液具有一定的臨床效果，不良反應(yīng)較少，能提高部分患者的生活質(zhì)量，其作用機(jī)制與抑制VEGF、HIF-1α表達(dá)水平有關(guān)[17-20]。在不同的研究中所檢測的CEC亞群不同（活性或凋亡CEC），單純給予化療后誘發(fā)腫瘤的CECs重新釋放，它增加了即刻的CECs的暫時(shí)升高，通過抗血管生成治療克服這部分釋放。本研究采用恩度聯(lián)合NP方案治療NSCLC，結(jié)果是有效的，患者CECs及aCECs數(shù)量在治療后均出現(xiàn)下降。

綜上所述，恩度通過對腫瘤血管生成的負(fù)性調(diào)節(jié)，提高了抗腫瘤效果并抑制腫瘤生長速度，CECs及aCECs的聯(lián)合檢測可能是恩度聯(lián)合NP方案治療肺癌的較好療效預(yù)測指標(biāo)。

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（收稿日期：2017-07-03） （本文編輯：康玥）endprint