鹽堿脅迫對柳樹抗氧化酶的影響

劉 鐸, 叢日春, 高衛(wèi)東, 黨宏忠, 李慶梅, 劉德璽, 楊慶山

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 荒漠化研究所, 北京100091； 2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所國家林業(yè)局林木培育重點實驗室, 北京 100091； 3.山東省林科院, 山東 濟南 250014)

鹽堿脅迫對柳樹抗氧化酶的影響

劉 鐸1, 叢日春1, 高衛(wèi)東2, 黨宏忠1, 李慶梅2, 劉德璽3, 楊慶山3

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 荒漠化研究所, 北京100091； 2.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所國家林業(yè)局林木培育重點實驗室, 北京 100091； 3.山東省林科院, 山東 濟南 250014)

[目的] 探討柳樹抗氧化系統(tǒng)對鹽脅迫和堿脅迫響應(yīng)的差異機制,以期為今后耐鹽堿柳樹選育工作提供科學(xué)依據(jù)。[方法] 以鹽柳1號為試驗材料,分別以中性鹽NaCl和NaSO4、堿性鹽NaHCO3和Na2CO3混合模擬鹽、堿脅迫(兩者摩爾比均為9∶1),共設(shè)計了5個梯度處理(0～200 mmol/L),共脅迫14 d來研究鹽與堿脅迫下柳樹幼苗相關(guān)生理表現(xiàn)。[結(jié)果] 在堿脅迫情況下隨著鹽濃度升高,柳樹葉片的SOD，POD，CAT這3種酶活性呈先升后降變化趨勢,其中SOD在鹽濃度為100 mmol/L時達到最大為對照的1.48倍,POD和CAT在鹽濃度為150 mmol/L達到最大,分別為對照的4.26和5.24倍。中性鹽脅迫下SOD和POD活性一直保持增大,在鹽濃度為200 mmol/L時達到最大值分別對照的1.33和3.26倍,在鹽濃度為150 mmol/L時CAT活性達到最大值為對照的2.79倍。堿脅迫下柳樹葉片中丙二醛(MDA)含量明顯高于中性鹽脅迫下,當(dāng)鹽濃度為150 mmol/L時為同濃度中性鹽脅迫下的2.23倍。[結(jié)論] 從氧化脅迫角度分析,堿脅迫和鹽脅迫是兩種不同性質(zhì)的脅迫,堿脅迫對柳樹抗氧化系統(tǒng)造成的危害更大。

柳樹; 酶活性; 丙二醛; 鹽脅迫; 堿脅迫

柳樹是中國重要的造林綠化水土保持樹種，具有速生、耐水濕、抗性強、易繁殖等特點，同時柳樹也是非常好的用材與能源樹種，對于生態(tài)環(huán)境建設(shè)具有非常重要的作用[6]。但是有關(guān)堿性鹽對于柳樹造成氧化脅迫的影響目前還未見報道。本試驗擬通過人工模擬天然鹽堿生境分析鹽脅迫和堿脅迫對柳樹幼苗的各種抗氧化酶活性及過氧化物含量差異性變化，探討柳樹抗氧化系統(tǒng)對鹽脅迫和堿脅迫響應(yīng)的差異機制，以期為今后耐鹽堿柳樹選育工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

本試驗在中國林業(yè)科學(xué)研究院科研溫室內(nèi)進行，所選用的柳樹無性系材料為引種自山東省濱州由山東林科院選育的“鹽柳1號(SalixpsammophilaYanliu yihao)”新品種。2014年3月選取長度為15 cm，直徑1 cm左右的當(dāng)年生柳樹插條，扦插定植在高和直徑均為15 cm的裝有洗凈河沙并加入適量珍珠巖的花盆內(nèi)進行盆栽。定期澆灌1/2 Hogland營養(yǎng)液進行培養(yǎng)，扦插后培養(yǎng)45 d，枝條長到30～40 cm時，選取長勢一致的柳樹幼苗進行鹽脅迫。以1/2 Hogland營養(yǎng)液為本底配制鹽溶液，2種中性鹽NaCl，Na2SO4及2種堿性鹽NaHCO3，Na2CO3均按照摩爾比9∶1進行配制，保持Na+濃度不變。鹽脅迫與堿脅迫均設(shè)置0，50，100，150，200 mmol/L這5個梯度，用pH電子筆測定各梯度處理液pH值，中性鹽pH值變化范圍為6.5～6.9，堿性鹽pH值變化范圍為9.1～9.28，每處理設(shè)置6個重復(fù)。脅迫時澆透鹽水，為了避免鹽沖擊現(xiàn)象，逐次增加澆灌鹽水濃度，最終達到最高濃度，以后定期按稱重法補充澆灌營養(yǎng)液。鹽脅迫時間從達到最高鹽濃度之日算起，總共脅迫14 d。

1.2 試驗指標(biāo)測定方法

鹽堿脅迫14 d之后，采集各個植株相同部位的功能葉片進行生理指標(biāo)測定，每個指標(biāo)重復(fù)測定4次。

(1) 酶液制備。取0.5 g葉片并剪碎，置于預(yù)冷的研缽中，準(zhǔn)確加入10 ml預(yù)冷的50 mmol/L的pH=7.8的磷酸緩沖液及適量石英砂，在冰浴中進行研磨，然后將勻漿轉(zhuǎn)入10 ml離心管中，于4 ℃下12 000 r離心10 min，最后提取上清液在4 ℃下保存?zhèn)溆肹6]。超氧化物歧化酶(SOD)的活性測定采用四唑氮藍法，以一直NBT光化還原50%為一個酶活性單位[7]過氧化物酶(POD)的測定用愈創(chuàng)木酚法，以每1 min內(nèi)A470讀數(shù)增加0.01為一個過氧化物酶活性單位[6],過氧化氫酶(CAT)的測定用紫外吸收法，以每min內(nèi)A240減少0.01為一個酶活性單位[6]。

(2) 丙二醛(MDA)測定。用硫代巴比妥酸法，取新鮮葉片0.5 g，加入10%TCA5.0 ml和少量石英砂研磨；轉(zhuǎn)移到離心管中，4 000 r離心10 min。上清液即為提取液，然后取1.5 ml提取液與2.0 ml硫代巴比妥酸(TBA)在恒溫水浴鍋反應(yīng)20 min，最后測定MDA含量[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽堿脅迫對柳樹SOD活性的影響

SOD是存在于植物中活性氧清除系統(tǒng)的主要酶之一，其主要作用是清除超氧自由基，它能夠催化活性氧發(fā)生歧化反應(yīng)產(chǎn)生H2O2，以提高植物的抗氧化能力[9]。圖1為鹽與堿脅迫下柳樹葉片內(nèi)SOD活性變化關(guān)系。

圖1 鹽與脅迫下柳樹葉片內(nèi)SOD活性變化

由圖1可以看出，隨著鹽濃度的升高，柳樹葉片中的SOD活性總體呈上升趨勢，但是在堿脅迫的情況下，SOD活性呈先升后將降的變化趨勢。當(dāng)堿性鹽濃度達到100 mmol/L時，SOD活性達到最大值為對照的1.48倍(p<0.05)達到顯著差異，為同濃度中性鹽脅迫下的1.24倍(p>0.05)差異不顯著。但是在堿脅迫下，隨著鹽濃度的繼續(xù)增大，葉片SOD活性開始下降。這可能是由于鹽濃度的增大，使得植物的活性氧清除系統(tǒng)遭到破壞，而導(dǎo)致SOD活性降低。在中性鹽脅迫下，隨著鹽濃度的升高，SOD活性則一直呈上升趨勢，當(dāng)鹽濃度為200 mmol/L時達到最大，為對照的1.33倍(p>0.05)差異不顯著。由此可看出：堿性鹽對柳樹SOD活性的影響更大，造成的損傷更嚴(yán)重。

2.2 鹽堿脅迫對柳樹POD活性的影響

在活性氧清除系統(tǒng)中，POD的作用是催化H2O2與其底物反應(yīng)，以充分分解H2O2，從而解除由于逆境脅迫產(chǎn)生的活性氧對于植物細(xì)胞的傷害[10]。圖2為鹽堿脅迫下柳樹葉片內(nèi)POD活性變化關(guān)系。

由圖2可以看出，在2種鹽脅迫14 d的情況下，隨著鹽濃度的升高，柳樹葉片的POD活性總體呈現(xiàn)上升趨勢，但在堿脅迫下POD活性呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢，并且相比中性鹽脅迫情況下變化幅度更大。當(dāng)堿性鹽濃度達到150時，葉片POD活性達到最大值為對照的4.26倍(p<0.01)達到極顯著性差異。當(dāng)中性鹽濃度達到50，100，150，200 mmol/L時，葉片POD活性分別為對照的1.55，2.05，2.55，3.26倍?？梢钥闯鲈谙嗤}濃度下，堿脅迫下葉片中POD活性高于中性鹽脅迫下葉片中POD活性，并且當(dāng)堿性鹽濃度為150 mmol/L時POD活性達到最大值，堿脅迫下為中性鹽脅迫下的1.71倍(p<0.05)，差異顯著。隨著堿性鹽濃度的升高，葉片中POD活性開始下降，說明在堿性鹽濃度超過150 mmol/L時柳樹葉片的抗氧化系統(tǒng)遭受到了損害，抗氧化功能有所下降。而在中性鹽脅迫下，隨著鹽濃度的增加，POD活性一直在增大，抵抗由于鹽脅迫造成的氧化損傷。由上面分析可以看出，隨著鹽濃度的升高，在中性鹽脅迫的情況下，葉片中POD活性一直呈上升趨勢，但是在堿脅迫的情況下，隨著鹽濃度的升高，葉片中POD活性呈現(xiàn)，先升后降的變化趨勢，由此可以看出，隨著堿性鹽濃度的升高對于葉片POD活性調(diào)節(jié)功能會造成損傷，使得POD活性有所降低，由此可得出堿脅迫對于柳樹葉片的POD活性造成的損傷更大。

圖2 鹽與堿脅迫下柳樹葉片內(nèi)POD活性變化

2.3 鹽堿脅迫對柳樹CAT活性的影響

由圖3可以看出，在鹽脅迫的情況下，隨著鹽濃度的升高柳樹葉片的CAT活性呈上升趨勢。在中性鹽脅迫情況下，隨著鹽濃度的升高，葉片CAT活性也緩慢升高，當(dāng)鹽濃度為、50，100，150，200 mmol/L時葉片CAT活性分別為對照的1.74，2.07，2.79，2.29倍，當(dāng)鹽濃度為150 mmol/L時達到最大值。在堿脅迫下，隨著堿性鹽濃度的升高，葉片中CAT活性先緩慢上升又降低，當(dāng)濃度為150 mmol/L時又急劇增加而達到最大值為對照的5.24倍(p<0.01)達到極顯著性差異，隨著堿性鹽濃度繼續(xù)升高到200 mmol/L時CAT活性略有下降為對照的3.54倍。在相同鹽濃度情況下，相比于中性鹽在堿脅迫下，葉片中CAT活性更高。當(dāng)鹽濃度為150，200 mmol/L時，分別為中性鹽脅迫下CAT活性的1.88，1.55倍。試驗表明：在堿脅迫下柳樹葉片CAT活性所受影響更大。

圖3 鹽與堿脅迫下柳樹葉片內(nèi)CAT活性變化

2.4鹽堿脅迫對柳樹MDA含量的影響

植物在非生物逆境脅迫條件下，在植物體內(nèi)會發(fā)生膜質(zhì)過氧化作用，從而使植物細(xì)胞膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能受損，丙二醛(MDA)是膜質(zhì)過氧化作用的終產(chǎn)物，是膜系統(tǒng)受傷害的重要標(biāo)志之一，在逆境條件下植物積累的MDA越多，則表明植物組織細(xì)胞的保護能力越弱，細(xì)胞質(zhì)膜遭受的破壞越嚴(yán)重[11]。圖4為鹽與堿脅迫下柳樹葉片內(nèi)MDA含量變化關(guān)系。

圖4 鹽與堿脅迫下柳樹葉片內(nèi)MDA含量變化

由圖4可以看出，隨著中性鹽與堿性鹽處理濃度的升高，柳樹葉片中的丙二醛(MDA)含量發(fā)生了相應(yīng)的變化。其中，隨著鹽濃度的升高，在堿脅迫下相比對照處理柳樹葉片中丙二醛含量大幅增加，但中性鹽脅迫下葉片中的丙二醛(MDA)含量相比于對照處理變化不大。在鹽濃度較低為50 mmol/L時，相比于對照鹽脅迫下的柳樹葉片中的MDA含量差異并不大。但隨著堿性鹽的濃度繼續(xù)升高，葉片中MDA含量急劇增加。當(dāng)堿性鹽濃度達到100，150時，葉片中MDA含量分別為對照的1.59，1.95倍，其中在濃度為200 mmol/L時葉片中MDA含量達到最大值，為對照的2.19倍(p<0.05)達到顯著性差異。并且當(dāng)堿性鹽濃度達到100，150，200 mmol/L時葉片中MDA含量分別為同濃度中性鹽脅迫下的1.58，2.23，2.13倍(p<0.05)差異顯著，當(dāng)鹽濃度為150 mmol/L時差異最大。試驗表明：相比于中性鹽在堿脅迫下，柳樹葉片中會積累更多的MDA，由此可見堿脅迫下會使柳樹質(zhì)膜過氧化作用更強，對于柳樹葉片細(xì)胞膜系統(tǒng)與功能損傷更大。

3 討論與結(jié)論

袁琳等[18]發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，長果阿渾子和Kerman葉片中SOD，CAT，POD活性隨著鹽濃度升高而增強。李會云等[19]鹽脅迫對葡萄砧木品種研究的結(jié)果表明，隨著土壤含鹽量的增加，SOD，CAT，POD均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。馬麗清等[20]在研究鹽脅迫對珠美海棠和山定子膜保護酶系統(tǒng)的影響中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)超過一定鹽濃度時山定子葉片中SOD，CAT，POD活性，隨著鹽濃度的升高3種酶活性降低。

本研究表明：在鹽與堿脅迫14 d情況下隨著鹽濃度的增大，柳樹葉片的SOD，POD和CAT這3種酶活性總體呈上升趨勢。在中性鹽脅迫14 d的情況下，除CAT活性在鹽濃度在150 mmol/L時達到最大值，隨著鹽濃度繼續(xù)升高活性略有下降外，SOD和POD活性一直保持上升。相比于中性鹽，堿脅迫下柳樹葉片內(nèi)3種酶活性變化幅度更大。并且，隨著堿性鹽濃度的增大，3種酶活性并不是一直保持增大。如SOD，POD和CAT分別在鹽濃度為100和150 mmol/L時酶活性達到峰值之后開始下降。與此同時，當(dāng)鹽濃度相同時，相比于中性鹽在堿脅迫下，柳樹葉片中會積累更多的MDA，當(dāng)堿性鹽濃度為200 mmol/L時葉片中MDA為對照的2.19倍，為同濃度中性鹽脅迫下MDA含量的2.13倍。造成以上現(xiàn)象的原因主要是由于，植物細(xì)胞在鹽脅迫下所能忍受的活性氧水平存在一個閾值。在此閾值內(nèi)，植株能通過提高抗氧化酶的活性，有效消除活性氧自由基所帶來的傷害；當(dāng)超過這個閾值時，植物抗氧化系統(tǒng)遭到破壞，抗氧化酶活性就會下降，活性氧的積累量將超過其被清除的量，從而使植株受到損害。由此得出，在中性鹽及低濃度堿脅迫14 d的情況下，SOD，POD和CAT能有效清除脅迫所產(chǎn)生的超氧陰離子自由基和H2O2，但在高濃度堿脅迫的情況下，由于高pH值的影響，SOD，POD和CAT這3種酶的保護作用受到了明顯抑制。

綜上所述，鹽與堿脅迫對于柳樹幼苗的抗氧化系統(tǒng)的影響表現(xiàn)出明顯的不同，是兩種不同的脅迫，一定濃度鹽與堿脅迫對于柳樹都會造成不同程度的氧化脅迫。尤在高pH堿脅迫的影響下，會對柳樹造成更嚴(yán)重的氧化脅迫，堿脅迫對于柳樹各項抗氧化生理指標(biāo)的影響明顯大于鹽脅迫。植物適應(yīng)鹽與堿脅迫是一個受到多基因控制的復(fù)雜過程，目前有關(guān)植物耐鹽堿性的很多機理尚不是很清楚有很多疑問，還有待進一步深入研究。

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EffectsofSaltandAlkaliStressesonAntioxidasesofWillow

LIU Duo, CONG Richun, GAO Weidong, DANG Hongzhong, LI Qingmei, LIU Dexi, YANG Qingshan

(1.InstituteofDesertificationStudies,ChineseAcademyofForestry,Beijing100091,China; 2.KeyLaboratoryofForestSilvicultureofStateForestryAdministration,ResearchInstituteofForestry,ChineseAcademyofForestry,Beijing100091,China, 3.ShandongForestryResearchInstitute,Jinan,Shandong250014,China)

[Objective] To illustrate the comparative effects of salt and alkali stresses on antioxidases of willow, and to provide scientific basis for willow breeding. [Methods] A willow cultivarSalixpsammophila(Yanliu yihao) was used in this study. The stress conditions were simulated by five levels of salinities and alkalities with 14 days duration. The salinities were simulated by two neutral salts (NaCl and NaSO4) and alkalities were simulated by two alkaline salts (NaHCO3and Na2CO3). The two neutral and alkaline salts were both mixed in the molar ratio of 9∶1. The concentrations ranged from 0 to 200 mmol/L both for salt and alkali stress. [Results] Under alkali stress, the activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase(POD) and CAT all presented a tendency of increasing at low concentration stress and then decreasing at high stress. The peak of SOD activity emerged when the willow was treated with 100 mmol/L, which was 1.48 times of the control’s; the peak of POD and CAT activities emerged when it was treated with 150 mmol/L, which were 4.26 and 2.79 times of the control’s values. Under alkali stress, the activities of SOD,POD and CAT all presented an increasing tendency. The peaks of SOD,POD and CAT activities all emerged at highest contrcentration of 200 mmol/L, they were 1.33,3.26 and 2.29 times of the control’s corresponding values. The content of MDA of willow leaf was higher in alkali treatment than that in salt treatment. When the concentrations of neutral and alkaline salts were at 150 mmol/L, the difference of MDA content was biggest. [Conclusion] The alkali stress is different from salt stress, the alkali has stronger injury to willow than the salt stress has.

willow;enzymeactivity;MDA;saltstress;alkalistress

A

1000-288X(2017)05-0053-05

Q945.78

文獻參數(shù)： 劉鐸, 叢日春, 高衛(wèi)東, 等.鹽堿脅迫對柳樹抗氧化酶的影響[J].水土保持通報，2017,37(5)：53-57.

10.13961/j.cnki.stbctb.2017.05.009； Liu Duo, Cong Richun, Gao Weidong, et al. Effects of salt and alkali stresses on antioxidases of willow[J]. Bulletin of Soil and Water Conservation, 2017,37(5)：53-57.DOI:10.13961/j.cnki.stbctb.2017.05.009

2014-08-08

2017-04-25

中央級公益性行業(yè)科研院所基本科研業(yè)務(wù)費“柳樹抗復(fù)雜鹽脅迫機理研究”(CAFYBB2016MA011)； 江蘇省科技支撐計劃項目(BE2016328)

劉鐸(1991—),男(漢族),甘肅省白銀市人,碩士,研究方向為鹽堿地治理、耐鹽堿樹種篩選。E-mail:liuduo6125358@163.com。

叢日春(1963—),男(漢族),內(nèi)蒙自治區(qū)赤峰市人,博士,研究員,主要從事鹽堿地治理、耐鹽堿樹種篩選工作。E-mail:congrichun888@163.com。