重組雞GSTA3蛋白對福美雙誘導肉雞TD的血清GST-α含量的影響

李 欣，李 楨，李娜娜，張旭華，張 靖，陳柳妃，寧官保，張 鼎，田文霞

（山西農業(yè)大學動物科技學院，山西 太谷 030801）

重組雞GSTA3蛋白對福美雙誘導肉雞TD的血清GST-α含量的影響

李 欣，李 楨，李娜娜，張旭華，張 靖，陳柳妃，寧官保，張 鼎，田文霞

（山西農業(yè)大學動物科技學院，山西 太谷 030801）

為研究重組雞GSTA3蛋白對肉雞TD抗氧化功能的影響，先構建肉雞TD模型，即通過肌肉注射不同劑量（20，50 μg/kg）的原核表達雞GSTA3蛋白，運用ELISA技術檢測血清中GST-α的含量。結果表明，與空白組相比，飼喂福美雙第1，2，4天，血清GST-α的含量顯著上升（P＜0.05），注射蛋白組與飼喂福美雙組相比，試驗第1天，GST-α的含量沒有顯著差異，試驗第2，4天，GST-α的含量顯著降低（P＜0.05），而高劑量組與低劑量組之間GST-α的含量無顯著性差異。GSTA3可通過修復肝臟損傷增強其抗氧化能力，直接或間接調節(jié)軟骨組織中軟骨細胞在TD發(fā)生過程中的功能。

肉雞；脛骨軟骨發(fā)育不良；重組雞谷胱甘肽硫轉移酶；抗氧化功能

谷胱甘肽硫轉移酶（glutathione S-transferase，GSTs）是生物體內一類復雜的同工酶類，它廣泛存在于各種哺乳動物、植物、鳥類、昆蟲、寄生蟲以及微生物中，是生物體內解毒酶系統的重要組成部分之一。GSTs主要的功能是可以將共軛狀態(tài)中的還原型谷胱甘肽（GSH）轉化為親電子中心的物質，使其更易于透過細胞膜從而排出細胞外，最終起到解毒的作用；同時，GSTs還是一種不含硒的過氧化物酶，可以催化部分過氧化反應，進而防止脂質的過氧化損傷作用[1]。有研究顯示，GSTs的大量表達與機體自身的抗性有關，在魚類中，GSTs基因表達越多，對生存的水環(huán)境中微囊藻毒素的抵抗力就越強[2]。肉雞脛骨軟骨發(fā)育不良（Tibial dyschon dropla sia，TD）是一種骨骼性疾病，干擾脛骨生長板軟骨的正常骨化功能，在這個過程中同時伴隨著許多對細胞有毒的物質產生。福美雙的代謝主要在肝臟中進行，而機體許多與骨生成、重建的相關酶類的合成也是在肝臟中完成[3]，但是，肝臟在代謝福美雙的過程中，肝臟本身會受到影響，導致機體解毒能力和抗氧化能力降低[4]。劉紅霞[5]研究發(fā)現，GSTA3與CYP450共同參與機體解毒，可以清除易于誘發(fā)TD的毒性物質。

山西農業(yè)大學動物科技學院生物制品實驗室前期成功克隆表達雞GSTA3并獲得其活性蛋白，本試驗通過肌肉注射GSTA3蛋白到肉雞體內，探討重組雞GSTA3蛋白對TD肉雞血清中GST-α含量的影響，旨在為后期TD預防治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試肉雞為1日齡AA肉雞，共90羽，購自山西省文水縣大象農牧集團有限公司。

1.2 試驗試劑

雞谷胱甘肽硫轉移酶α（GST-α）酶聯免疫檢測試劑盒，購于南京建成生物工程研究所；重組雞GSTA3活性蛋白由山西農業(yè)大學生物制品實驗室前期成功表達。

1.3 試驗方法

根據田文霞等[6]方法復制肉雞TD模型，90羽1日齡AA肉雞預飼養(yǎng)7 d后，隨機分為6組，每組15羽，A，B，C組為基礎日糧對照組，D，E，F 組為飼喂福美雙組。具體分組及方法如表1所示。試驗期間，肉雞自由采食、飲水。分別在攻毒后第1，2，4天每組隨機選取5只雞，翅靜脈采抗凝血，離心，收集血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 動物分組及方法

1.4 血清GST-α測定

根據雞谷胱甘肽硫轉移酶α（GST-α）酶聯免疫檢測試劑盒說明書進行操作，根據標準品的質量分數及相應的OD值，繪制標準曲線并得出回歸方程，測得樣品的OD值代入回歸方程，即可計算出各樣品的質量分數。

1.5 數據分析

試驗結果運用SPSS軟件進行統計分析。

2 結果與分析

根據ELISAcalc軟件，得到回歸方程如下。

繪制得標準曲線如圖1所示，空白組及福美雙攻毒組肉雞血清GST-α含量如表2所示。

從表2可以看出，在肉雞日糧中添加福美雙，可以導致肉雞血清中GST-α含量顯著升高（P＜0.05）；試驗第1天，肌肉注射原核表達雞GSTA3蛋白后，血清中GST-α含量與飼喂福美雙組相比沒有顯著差異；而在試驗第2，4天，肌肉注射原核表達雞GSTA3蛋白，無論是低劑量（20 μg/kg）還是高劑量（50 μg/kg）與飼喂福美雙組相比，肉雞血清中GST-α的含量顯著降低（P＜0.05），與空白組相比沒有顯著性差異。

表2 重組雞GSTA3蛋白對正常和TD肉雞血清GST-α含量的影響 ng/mg

3 討論

脛骨軟骨發(fā)育不良（TD）主要在生長速度快的肉禽動物上常見，主要病變在腿部，是一種軟骨代謝障礙性的疾病[7]。該病于1965年首次在美國發(fā)現，無地域性，可在全世界范圍內發(fā)生，對禽類養(yǎng)殖所造成的損失較大。其主要表現有精神萎靡，食欲不振，早期跛行，中后期不能站立，雙翅常撐于地面，脛骨關節(jié)腫大。關節(jié)剖面可見生長板變厚，形成玉白色軟骨栓，與鈣化區(qū)顏色分明，且該區(qū)域缺乏血管。患有TD的肉雞極易引發(fā)其他疾病，免疫力和生產性能均受到嚴重影響，肉質等級下降[8-9]。目前可知的引發(fā)TD原因主要是人為的選育生長迅速的品種，飼養(yǎng)環(huán)境不適宜以及飼料成分比例不當，其具體的致病機理尚不清楚[10-12]。為了弄清引發(fā)TD的原因，并設法預防或治療TD，越來越多的學者加入到TD的研究大軍中。RATH[13]等研究發(fā)現，通過在飼料中添加一定濃度的福美雙可以顯著提高肉雞TD的發(fā)病率，這種由福美雙誘導的TD與自然狀態(tài)下發(fā)病的TD癥狀極為相近[14]。福美雙作為一種親脂化合物，可以與細胞膜結合，造成細胞膜損傷，同時激活細胞凋亡信號通路，直接或間接影響骨的重建過程，而細胞凋亡與谷胱甘肽代謝的異常也有著顯著的關系。

GST是機體中最為重要的抗氧化酶，在體內可以清除過氧化物，而GST-α是肝臟中表達并分泌最多的一種谷胱甘肽硫轉移酶[15]，這種酶類具有非硒依賴性的谷胱甘肽過氧化物酶活性，可催化過氧化脂肪酸的還原，并且抑制脂質過氧化物損傷的過程[16]；另外，氧化應激可以影響GST基因表達，還可以通過氧自由基（ROS）誘導γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性（GSH合成的限速酶），進而增加GSH的合成量[17]，而細胞內GSH的含量可以抑制GST基因的表達[18-19]。有研究發(fā)現，福美雙誘導肉雞TD發(fā)生過程中，肉雞肝的抗氧化能力降低[3]，肝臟中GSH含量減少[20]。在本試驗中，飼喂福美雙組肉雞血清GST-α的含量上升，由于福美雙在肝臟中的代謝，導致肝抗氧化能力減弱，GSH含量的降低對GST表達抑制的功能減弱，因此，GST-α合成分泌增加；在試驗第1天，與飼喂福美雙組相比，重組雞GSTA3蛋白對TD肉雞血清中GST-α含量的影響沒有顯著差異。在試驗第2，4天，注射重組雞GSTA3蛋白后，血清中GST-α含量降低。進一步說明，重組GSTA3蛋白可以通過一定的方法降低血清中GST-α含量，進而間接提高肝臟的抗氧化能力，降低肉雞TD的損傷程度，試驗中使用的2個劑量之間沒有差異。

4 結論

肌肉注射一定劑量的原核表達雞GSTA3蛋白，可以顯著降低血清GST-α水平，修復肝損傷，增強肝抗氧化能力，直接或間接地調節(jié)軟骨相關細胞的功能，GSTA3在TD發(fā)生過程中有著重要的作用。

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Effect of Recombinant Broiler Protein GSTA3 on the Expression of GST-α in Serum of TD Induced by Thiram

LI Xin，LI Zhen，LI Nana，ZHANGXuhua，ZHANGJing，CHENLiufei，NINGGuanbao，ZHANGDing，TIANWenxia
（College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

To study the effect ofthe recombinant chicken GSTA3 protein on the anti-oxidative function of TD of broiler,the broiler TDmodel was constructed firstly,and the chicken GSTA3 protein was expressed byintramuscular injection ofdifferent doses（20,50 g/kg）,and the content of GST-α in serum was detected by ELISA.The results showed that compared with the control group,the content of GST-α significantly increased in the first and second days（P＜0.05）.Compared with the feeding and injecting groups,there was no significant difference ofGST-α on the first day,but the content ofGST-α significantlydecreased at 2,4 days（P＜0.05）,and there was no significant difference between high dose group and low dose group.We suggest that GSTA3 can enhance the antioxidant capacity of the liver byrepairingthe liver injury,directlyor indirectlyregulate the cartilage cells in the cartilage cells in the process ofTD.

broiler;TD;recombinant chicken GSTA3;antioxidant function

S831.1

A

1002-2481（2017）11-1853-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.11.29

2017-06-05

晉中市重點科技創(chuàng)新平臺項目（P171002-3）；山西省回國留學人員科研資助項目（2017-073）；山西省科技攻關項目（20130311027-3）；2017年地方高校國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201710113001）；2017年山西省高等學校大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（2017081）

李 欣（1990-），女，山西太谷人，在讀碩士，研究方向：動物傳染病發(fā)病與免疫機理。田文霞為通信作者。