重組雞GSTA3蛋白對福美雙誘導(dǎo)的TD肉雞血清中Bax含量的影響

張 寧，李 楨，李娜娜，張旭華，張 靖，陳柳妃，寧官保，張 鼎，田文霞

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801）

重組雞GSTA3蛋白對福美雙誘導(dǎo)的TD肉雞血清中Bax含量的影響

張 寧，李 楨，李娜娜，張旭華，張 靖，陳柳妃，寧官保，張 鼎，田文霞

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801）

為研究谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶A3（GSTA3）對脛骨軟骨發(fā)育不良（TD）肉雞血清中凋亡因子Bax的影響，試驗(yàn)將90羽1日齡AA肉仔雞預(yù)飼7 d后，隨機(jī)分為6組（A，B，C，D，E和F組），分別在8，9日齡對D，E，F(xiàn)組飼喂添加100 mg/kg福美雙的日糧，將飼喂基礎(chǔ)日糧組（A，B，C組）和添加福美雙日糧組（D，E，F(xiàn)組）的肉雞各分對照組（A，D組）、重組 GSTA3蛋白低劑量（20 μg/kg）注射組（B，E 組）和高劑量（50 μg/kg）注射組（C，F(xiàn)組），在試驗(yàn)第8，10，12天腿部肌肉注射重組GSTA3蛋白，對照組注射稀釋用PBS。在飼喂福美雙后第1，2，4天分別采集各組肉雞血液、分離血清，利用ELISA方法測定肉雞血清中Bax的含量。結(jié)果顯示，低劑量的重組GSTA3蛋白顯著降低第2天基礎(chǔ)日糧（B）組肉雞血清中Bax的濃度，同時顯著降低第4天福美雙處理（E）組肉雞血清中Bax的濃度；高劑量的重組GSTA3蛋白顯著降低第4天基礎(chǔ)日糧（C）組和福美雙處理（F）組肉雞血清中Bax的濃度。低劑量的重組雞GSTA3蛋白對降低TD肉雞血清中Bax含量的效果較好，這一研究將為肉雞TD的防治提供新的方向和研究基礎(chǔ)。

肉雞；脛骨軟骨發(fā)育不良；重組雞GSTA3蛋白；細(xì)胞凋亡；Bax

脛骨軟骨發(fā)育不良（Tibial Dyschondroplasia，TD）是肉雞常見的骨骼性疾病，以脛骨干骺端形成無血管的玉白色的“軟骨楔”為特征[1-2]。肉雞TD可導(dǎo)致機(jī)體抵御疾病能力下降，誘發(fā)多種疾病，降低肉品質(zhì)，影響肉雞養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[3]。RATH等[4]采用TUNEL法研究表明，在10日齡TD癥狀不明顯時，福美雙誘導(dǎo)的肉雞脛骨生長板的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，隨后幾天，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞死亡增加，并伴隨著生長板的過渡區(qū)軟骨細(xì)胞的大量死亡。Bax（Bcl-2-associated Xprotein，Bax）是 Bcl-2家族中典型的促凋亡基因，主要分布于胞質(zhì)中[5]，當(dāng)接受凋亡信號刺激后，從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上形成PT孔道，破壞線粒體膜的完整性，與Bcl-2形成異二聚體，或自身形成同源二聚體來抑制或促進(jìn)Cyt-C的釋放，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生[6-7]。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶A3（GSTA3）是GSTs家族成員，主要參與機(jī)體的解毒，以及與氧化應(yīng)激相關(guān)的信號通路的調(diào)節(jié)。GSTA3能夠降解某些化學(xué)物質(zhì)的毒性，尤其是對致癌物質(zhì)的毒性具有一定程度的降解作用[8]。用脂多糖（LPS）誘導(dǎo)人的PC12細(xì)胞建立神經(jīng)元細(xì)胞模型，引發(fā)適應(yīng)性反應(yīng)，在亞致死濃度下，用LPS處理PC12細(xì)胞后，導(dǎo)致GSTA3基因表達(dá)及其他GSTs酶活性增加，顯著高于未處理組。核因子紅細(xì)胞2p45相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2p45-related factor 2，Nrf2）由 LPS轉(zhuǎn)錄激活，Nrf2 小干擾RNA可以減弱GSTA3 mRNA水平的增加，以及LPS誘導(dǎo)的適應(yīng)性應(yīng)答。此外，外周注射LPS亞致死濃度，可以增加小鼠大腦中的GSTs活性。亞致死濃度的LPS可以刺激誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)，并增強(qiáng)PC12細(xì)胞耐受性，主要是由于GSTA3誘導(dǎo)Nrf2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的轉(zhuǎn)錄激活[9]。

本試驗(yàn)將重組GSTA3蛋白注射到肉雞體內(nèi)，以期探明重組GATA3蛋白對肉雞血清中Bax含量的影響，為TD的緩解尋找新的防治方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動物

1日齡健康A(chǔ)A（艾維茵）肉仔雞90羽，購自山西省文水縣大象農(nóng)牧集團(tuán)有限公司。

1.2 試驗(yàn)試劑

福美雙（JL131223002）購自美國Amresco公司；重組雞GSTA3純化蛋白為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制品實(shí)驗(yàn)室自行制備；Bax酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自南京建成生物工程有限公司；0.2，1.5 mL離心管購自美國Axygen公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 動物處理 試驗(yàn)參照田文霞等[10]和張建鵬[11]試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將90羽肉雛雞預(yù)飼7 d后，分為基礎(chǔ)日糧組和福美雙處理組，對福美雙處理組肉雞于8，9日齡通過添加100 mg/kg福美雙誘發(fā)肉雞建立TD模型，之后恢復(fù)基礎(chǔ)日糧。并將具有活性的重組GSTA3蛋白分為低劑量（20 μg/kg）和高劑量（50 μg/kg）組，分別在第8，10，12天對基礎(chǔ)日糧組和福美雙處理組的肉雞進(jìn)行腿部肌肉注射，共分為6組：A組（空白對照）.飼喂基礎(chǔ)日糧，腿部肌肉注射35 μg/kg的PBS，以達(dá)到相同的刺激；B組.飼喂基礎(chǔ)日糧，腿部肌肉注射低劑量（20 μg/kg）重組GSTA3蛋白；C組.飼喂基礎(chǔ)日糧，腿部肌肉注射高劑量（50 μg/kg）重組GSTA3蛋白；D組（對照）.添加福美雙（100 mg/kg）日糧，腿部肌肉注射35 μg/kg的PBS，以達(dá)到相同的刺激；E組.添加福美雙（100 mg/kg）日糧，腿部肌肉注射低劑量（20 μg/kg）重組 GSTA3蛋白；F 組.添加福美雙（100 mg/kg）日糧，腿部肌肉注射高劑量（50 μg/kg）重組 GSTA3 蛋白。

1.3.2 樣品采集 在福美雙攻毒后的第1，2，4天每組隨機(jī)挑選5只雞，翅靜脈采集血液，凝固后離心，收集上層血清，保存于-20℃，備用。

1.3.3 肉雞血清中Bax含量的測定 肉雞血清中Bax含量的測定采用競爭ELISA法，使用前先將試劑盒放置于室溫平衡0.5 h以上，嚴(yán)格按照Bax酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bax標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 1所示?；貧w方程為：y＝（2.264－0.151）/（1＋（x/3.396）1.421）＋0.151 （R2＝0.996 09）。

2.2 樣品血清中的Bax濃度

由圖2分析得出，試驗(yàn)第1天，與空白對照A組相比，福美雙對照D組肉雞血清中Bax的濃度升高，但差異不顯著，高劑量的重組GSTA3蛋白顯著提高基礎(chǔ)日糧組肉雞血清中的濃度（P＜0.05）；與福美雙對照D組相比，低劑量的重組GSTA3蛋白顯著提高福美雙處理組肉雞血清中的濃度（P＜0.05）。

由圖3分析得出，試驗(yàn)第2天，與空白對照A組相比，福美雙對照D組肉雞血清中Bax的濃度顯著升高（P＜0.05），低劑量的重組GSTA3蛋白顯著降低基礎(chǔ)日糧組肉雞血清中Bax的濃度（P＜0.05）；與福美雙對照D組相比，低劑量的重組GSTA3蛋白降低福美雙處理組肉雞血清中Bax的濃度，但差異不顯著。

由圖4分析得出，試驗(yàn)第4天，與空白對照A組相比，福美雙對照D組肉雞血清中Bax的濃度顯著升高（P＜0.05），高劑量的重組GSTA3蛋白顯著降低基礎(chǔ)日糧組肉雞血清中Bax的濃度（P＜0.05）；與福美雙對照D組相比，高劑量和低劑量的重組GSTA3蛋白顯著降低福美雙處理組肉雞血清中 Bax的濃度（P＜0.05）。

3 討論

GSTs主要參與細(xì)胞的2期解毒，細(xì)胞1期代謝產(chǎn)生的ROS和氧自由基一般為親電子物質(zhì)，細(xì)胞進(jìn)入2期代謝以后，GSTs作為機(jī)體的解毒酶之一，可以通過催化GSH的硫原子、ROS、氧自由基以及其他異源產(chǎn)物發(fā)生親核加成反應(yīng)，生成更易于被清除的水溶性產(chǎn)物[12]。GSTs在防止脂質(zhì)過氧化、修復(fù)DNA損傷以及對抗外界氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和抗腫瘤形成等方面發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞色素P450是一種1期代謝酶，廣泛存在于機(jī)體多個臟器，能夠催化體內(nèi)多種反應(yīng)，主要在肝臟進(jìn)行。劉紅霞等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞色素P450能夠減少外源化合物的毒性，可能是由于與GSTs共同發(fā)揮解毒作用，緩解了TD損傷。劉晶英[15]在基礎(chǔ)飼糧中添加表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG），結(jié)果顯示，熱休克蛋白HSP90基因和蛋白的表達(dá)量均出現(xiàn)下調(diào)，病變區(qū)軟骨細(xì)胞的分化和血管生成能力得以恢復(fù)，EGCG還能夠提高GSH的表達(dá)量和相關(guān)抗氧化酶的活性，能夠有效減輕TD的癥狀。

Bcl-2家族成員是細(xì)胞凋亡的中樞細(xì)胞因子，因?yàn)樗鼈冃纬闪嗽缙谛盘杺鲗?dǎo)，使細(xì)胞進(jìn)入凋亡過程，并且賦予細(xì)胞凋亡特征。Bax是Bcl-2家族中的主要促凋亡因子，長期以來，人們認(rèn)為，從細(xì)胞質(zhì)到線粒體的Bax易位是單向過程，但在非凋亡細(xì)胞中，Bax基本上在細(xì)胞溶質(zhì)中擴(kuò)散，而在細(xì)胞凋亡被引發(fā)后，其被重新定位到線粒體上[16]，以形成負(fù)責(zé)插入的寡聚體MOMP[17-18]。Bax的過表達(dá)不僅能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞通過線粒體途徑發(fā)生凋亡，而且可以促進(jìn)多種因素誘導(dǎo)的多種細(xì)胞發(fā)生凋亡[19]?？沟蛲鲆蜃覤cl-2通過2種途徑抑制Bax/Bak的活性，可以抑制與僅含BH3結(jié)構(gòu)域的蛋白相互作用，或通過限制Bax/Bak自身結(jié)合的激活。因此，任何小分子抑制凋亡的有效性取決于阻斷這2條途徑的能力。一旦Bax和Bak被激活，它們經(jīng)歷一系列構(gòu)象變化，便誘導(dǎo)凋亡[20]。本試驗(yàn)中，福美雙誘導(dǎo)肉雞TD發(fā)生后，在第1天福美雙對照組肉雞血清中Bax的濃度較空白對照組升高，但差異不顯著，但在第2，4天，福美雙對照組肉雞血清中Bax的濃度顯著升高。可能是由于福美雙誘發(fā)TD后，在第1天對機(jī)體的影響不是太大，所以升高不明顯，而第2，4天時，福美雙所引起的毒性較強(qiáng)，肉雞血清中Bax的濃度顯著升高，則說明肉雞脛骨生長板軟骨細(xì)胞的凋亡程度增加。而第1天重組GSTA3蛋白并沒有開始發(fā)揮解毒作用，導(dǎo)致福美雙處理組與基礎(chǔ)日糧組肉雞血清中Bax的濃度并沒有明顯降低。低劑量的重組GSTA3蛋白顯著降低第2天基礎(chǔ)日糧組肉雞血清中Bax的濃度，同時顯著降低第2，4天福美雙處理組肉雞血清中Bax的濃度；高劑量的重組GSTA3蛋白顯著降低第4天基礎(chǔ)日糧組和福美雙處理組肉雞血清中Bax的濃度。這進(jìn)一步說明，重組GSTA3蛋白可以通過一定的途徑降低肉雞血清中細(xì)胞凋亡通路中關(guān)鍵促凋亡因子Bax的濃度，進(jìn)而緩解TD肉雞脛骨生長板軟骨細(xì)胞的凋亡程度，降低肉雞TD引發(fā)的損傷。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，福美雙誘導(dǎo)的TD肉雞血清中Bax的含量顯著升高，腿部肌肉注射高劑量和低劑量的重組雞GSTA3蛋白可以顯著降低基礎(chǔ)日糧組和福美雙處理組肉雞血清中Bax的含量，且低劑量的重組雞GSTA3蛋白對減少TD肉雞血清中Bax的含量效果較好。

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Effect of Recombinant Broiler GSTA3 Protein on the Expression of Bax in Serum of TD Induced by Thiram

ZHANGNing，LI Zhen，LI Nana，ZHANGXuhua，ZHANGJing，CHENLiufei，NINGGuanbao，ZHANGDing，TIANWenxia
（College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

To investigate the effect of glutathione S-transferase A3 （GSTA3）on the expression of apoptotic factor Bax in serum of tibial dyschondroplasia（TD）,the study used 90 one-day-old AA broilers were divided into 6（A,B,C,D,E and F）groups at random after basal-diet feeding for 7 days.D,E and F of above 6 groups were fed with diets containing 100 mg/kg of thiram at 8 and 9 days old.Subsequently,feedingbasal-diet（A,Band C）and addingthiramdiets（D,E and F）were divided intocontrol group（Aand D）,lowdose（20 μg/kg）injection group（B and E）and high dose（50 μg/kg）injection group（C and F）.The recombinant broiler protein GSTA3 was injected of leg intramuscularly at 8,10,12 days old,and the control group was injected with PBS for dilution.The blood collected after day 1,2 and 4 in TD broilers induced by thiram.The serum was isolated and the content of Bax was determined by ELISA.The results showed that the level ofBaxin serumofbroiler significantly decreased in basal-diet group（B）at 2 days and the level ofBax in serum of broiler significantly decreased in treated group（E）at 4 days because of the injection of lowdoses of GSTA3 recombinant protein（P＜0.05）.The level ofBaxin serumofbroiler significantlydecreased in basal-diet group（C）and treated group（F）at 4 days because ofthe injection ofhigh doses ofGSTA3 recombinant protein（P＜0.05）.Low-dose recombinant protein GSTA3 has a better effect on reducing Baxcontent in TDbroiler serum,and this studywill provide a newdirection and research basis for the prevention and treatment ofTD.

broiler;TD;recombinant chicken protein GSTA3;apoptosis;Bax

S831.1

A

1002-2481（2017）11-1849-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.11.28

2017-06-05

晉中市重點(diǎn)科技創(chuàng)新平臺項(xiàng)目（P171002-3）；山西省回國留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目（2017-073）；山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20130311027-3）；2017年地方高校國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201710113001）；2017年山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（2017081）

張 寧（1990-），女，河南安陽人，在讀碩士，研究方向：動物傳染病發(fā)病與免疫機(jī)理。田文霞為通信作者。