微型月季組培快繁關(guān)鍵技術(shù)研究

梁 崢，賈民隆，李永平，段九菊，王云山，曹冬梅，鄭梅梅

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，山西 太原 030031；2.山西梅芝園藝有限公司，山西 太原 030000）

微型月季組培快繁關(guān)鍵技術(shù)研究

梁 崢1，賈民隆1，李永平1，段九菊1，王云山1，曹冬梅1，鄭梅梅2

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，山西 太原 030031；2.山西梅芝園藝有限公司，山西 太原 030000）

以微型月季帶腋芽的幼嫩莖段為試材，對(duì)微型月季組培快繁中外植體消毒、愈傷組織誘導(dǎo)、叢芽增殖培養(yǎng)以及植株生根等關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行研究。結(jié)果表明，用75%酒精消毒2 min后，再用HgCl2消毒10～15 min時(shí)，外植體存活率最高；培養(yǎng)基MS＋2 mg/L6-BA＋0.1 mg/LNAA的愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)95%；愈傷組織增殖最適培養(yǎng)基為MS＋1 mg/L6-BA＋0.5 mg/LKT＋0.2 mg/LNAA；叢芽分化增殖最適培養(yǎng)基為MS＋3 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L KT＋0.2 mg/LNAA；生根最適培養(yǎng)基為1/2 MS＋0.1 mg/LNAA。

組織培養(yǎng)；微型月季；快繁

微型月季（Rosa hybrida）是薔薇科薔薇屬多年生木本。與常見的灌木月季和藤本月季相比，其株型矮小，花小而多，全年都可以開放[1-2]，作為盆花具有天然的優(yōu)勢(shì)[3-4]，露地栽培也具有很高的觀賞價(jià)值[5-9]。同時(shí)微型月季還可以用于提取香料、精油等產(chǎn)品。傳統(tǒng)月季栽培以扦插為主[10-11]，但微型月季莖稈比較細(xì)弱，繁殖效率不高，難以滿足規(guī)?；a(chǎn)的需要[12]。

近年來，對(duì)于微型月季的繁殖方法研究主要集中在對(duì)扦插方法方面的探討上，包括不同品種不同基質(zhì)不同激素等因素對(duì)扦插繁殖的影響[13-15]。而對(duì)于組培快繁方面的研究則鮮有報(bào)道。

本研究探討使用組織培養(yǎng)的方法進(jìn)行快速繁殖微型月季，旨在為工廠化生產(chǎn)育苗提供一定的技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 植物材料

微型月季帶腋芽的幼嫩枝條。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒 剪取月季幼嫩枝條，除去葉片，留葉柄，用帶腋芽的枝條莖段作外植體材料；將莖段沖洗干凈，切帶芽莖段約4 cm長(zhǎng)度，放于燒杯中，滴少許洗潔精，加水搖勻流水沖洗2 h；后放入超凈臺(tái)，用無菌水沖洗外植體4次，每次1 min，然后將莖段切1.5 cm左右，用75%酒精消毒2 min，無菌水沖洗3次，每次2 min；用0.1%HgCl2分別消毒5，10，15，20 min，無菌水沖洗 4 次，每次 5 min。30 d后觀察記錄污染率、褐化率。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 將消毒后的莖段置入不

同激素組合的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，室溫（25±2）℃培養(yǎng)，每天光照12 h，光照強(qiáng)度1 500 lx。30 d后記錄愈傷組織誘導(dǎo)率（誘導(dǎo)率＝誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)×100%）。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素組合設(shè)置為：（1）MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L NAA；（2）MS＋2 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L NAA；（3）MS＋4 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L NAA；（4）MS＋0.5 mg/L6-BA＋0.2 mg/LNAA；（5）MS＋2 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L NAA；（6）MS＋4 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L NAA；（7）MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L IAA；（8）MS＋2 mg/L6-BA＋0.1 mg/LIAA；（9）MS＋4 mg/L 6-BA＋0.1 mg/L IAA；（10）MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L IAA；（11）MS＋2 mg/L 6-BA＋0.2mg/LIAA；（12）MS＋4mg/L6-BA＋0.2mg/LIAA。1.2.3 愈傷組織增殖培養(yǎng) 取狀態(tài)一致，大小相似的微型月季愈傷組織于不同激素組合的增殖培養(yǎng)基上，溫度（25±2）℃，每天光照12 h，光照強(qiáng)度1 500 lx。30 d后記錄愈傷組織增殖情況，計(jì)算其增殖系數(shù)（愈傷組織增殖系數(shù)=增殖培養(yǎng)后的愈傷質(zhì)量/接種愈傷質(zhì)量）。愈傷組織增殖培養(yǎng)基激素組合設(shè)置為：（1）MS＋1 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L KT＋0.2 mg/LNAA；（2）MS＋1 mg/L6-BA＋0.5 mg/LKT＋0.2 mg/LNAA；（3）MS＋2 mg/L6-BA＋0.2 mg/LKT＋0.2 mg/LNAA；（4）MS＋2 mg/L6-BA＋0.5 mg/LKT＋0.2 mg/LNAA；（5）MS＋1 mg/L6-BA＋0.2 mg/L KT＋0.2 mg/LIAA；（6）MS＋1 mg/L6-BA＋0.5 mg/LKT＋0.2 mg/LIAA；（7）MS＋2 mg/L6-BA＋0.2 mg/LKT＋0.2 mg/LIAA；（8）MS＋2 mg/L6-BA＋0.5 mg/LKT＋0.2 mg/LIAA。

1.2.4 叢芽分化增殖培養(yǎng) 將2 cm左右萌發(fā)的腋芽插入不同激素組合的叢芽分化培養(yǎng)基上，置于溫度（25±2）℃，每天光照 12 h，光照強(qiáng)度 1 500 lx。30 d后觀察統(tǒng)計(jì)叢芽增殖情況，計(jì)算其增殖系數(shù)（叢芽增殖系數(shù)=增殖培養(yǎng)后的芽數(shù)/接種芽數(shù)）。叢芽分化培養(yǎng)基激素組合設(shè)置為：（1）MS＋0.1 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L KT＋0.05 mg/L NAA；（2）MS＋0.5 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L KT＋0.05 mg/L NAA；（3）MS＋1 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L KT＋0.05 mg/L NAA；（4）MS＋3 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L KT＋0.05 mg/L NAA；（5）MS＋0.1mg/L6-BA＋0.2mg/LKT＋0.2mg/L NAA；（6）MS＋0.5mg/L6-BA＋0.2mg/LKT＋0.2mg/L NAA；（7）MS＋1 mg/L6-BA＋0.2 mg/LKT＋0.2 mg/L NAA；（8）MS＋3 mg/L6-BA＋0.2 mg/LKT＋0.2 mg/L NAA。

1.2.5 生根培養(yǎng) 將叢芽分離移入不同配方的生根培養(yǎng)基上，置于溫度（25±2）℃，每天光照12 h，光照強(qiáng)度1 500 lx。30 d后統(tǒng)計(jì)生根數(shù)。生根培養(yǎng)基配方設(shè)置為：（1）MS＋0.1 mg/L NAA；（2）1/2 MS＋0.1 mg/L NAA；（3）1/3 MS＋0.1 mg/L NAA；（4）1/4 MS＋0.1 mg/LNAA；（5）MS（母液硝酸銨 800 mg/L）；（6）1/2 MS（母液硝酸銨 800 mg/L）；（7）1/3 MS（母液硝酸銨 800 mg/L）；（8）1/4 MS（母液硝酸銨800 mg/L）。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒

月季幼嫩枝條莖段的消毒試驗(yàn)表明，HgCl2消毒時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)外植體材料污染率和褐死率有顯著的影響，其具體表現(xiàn)為：污染率隨HgCl2消毒時(shí)間的延長(zhǎng)而變小，褐死率隨消毒時(shí)間的延長(zhǎng)而增大；其中，HgCl2消毒時(shí)間為10～15 min時(shí)，外植體存活率最高，達(dá)到75%（表1）。

表1 不同HgCl2處理時(shí)間對(duì)微型月季莖段消毒的影響

2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)

不同激素組合對(duì)微型月季愈傷組織誘導(dǎo)的試驗(yàn)結(jié)果表明，不同激素組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基均能夠使外植體在莖段底部接觸培養(yǎng)基的部分產(chǎn)生少量淡黃色的愈傷組織，其中，（2）號(hào)組合（MS＋2 mg/L 6-BA＋0.1 mg/LNAA）誘導(dǎo)率最高，達(dá)到了95%（表2）；隨著繼代次數(shù)的增加，愈傷組織有所增大，但增殖速度非常緩慢，因此，有必要進(jìn)行愈傷組織增殖培養(yǎng)的條件優(yōu)化。莖段底部愈傷組織緩慢增殖的同時(shí)，腋芽萌發(fā)，并在莖段上形成1～2 cm的嫩芽，嫩芽在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中稍出現(xiàn)玻璃化的現(xiàn)象，生長(zhǎng)就會(huì)變緩。

表2 不同的激素組合對(duì)微型月季愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3 愈傷組織增殖培養(yǎng)

不同激素組合對(duì)微型月季愈傷組織的增殖試驗(yàn)結(jié)果表明，不同激素組合均能夠誘導(dǎo)其增殖生長(zhǎng)，產(chǎn)生淺黃色的愈傷組織。從所試組合總體上看，較高濃度的6-BA和KT有利于微型月季愈傷組織的增殖生長(zhǎng)，并且相同條件下，NAA優(yōu)于IAA；（2）號(hào)組合（MS＋1 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L KT＋0.2 mg/L NAA）的愈傷組織平均增殖系數(shù)最高，達(dá)到2.6，但最優(yōu)組合并不是較高濃度6-BA的組合（表3）。因此認(rèn)為，細(xì)胞分裂素在微型月季愈傷組織增殖作用上可能存在交互作用。

表3 不同的激素組合對(duì)微型月季愈傷組織增殖的影響

2.4 叢芽分化增殖培養(yǎng)

不同激素組合對(duì)微型月季叢芽分化增殖的試驗(yàn)結(jié)果表明，6-BA濃度在0.1～0.5 mg/L時(shí)，植株生長(zhǎng)緩慢，叢芽分化很少；當(dāng)6-BA濃度達(dá)到1 mg/L時(shí)，植株生長(zhǎng)明顯變得旺盛起來，并且產(chǎn)生比較多的叢生芽；隨著細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素之比例的增大，微型月季叢芽增殖量有比較明顯的增加，但過大的比例容易誘發(fā)叢生芽的玻璃化現(xiàn)象出現(xiàn)。其中，（4）號(hào)組合（MS＋3 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L KT＋0.05 mg/L NAA）的叢芽平均增殖系數(shù)最高，達(dá)到5.60，但新生叢芽存在玻璃化現(xiàn)象（表4）。綜合考慮，認(rèn)為（8）號(hào)組合（MS＋3 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L KT＋0.2 mg/LNAA）為最適叢芽分化增殖培養(yǎng)基。

表4 不同的激素組合對(duì)微型月季叢芽分化增殖的影響

2.5 生根培養(yǎng)

不同培養(yǎng)基對(duì)微型月季生根的試驗(yàn)結(jié)果表明，減小培養(yǎng)基中硝酸銨含量、添加低濃度的生長(zhǎng)素均有利于微型月季根系的分化。隨著硝酸銨含量的降低，微型月季根的分化進(jìn)程提前，其中，（5）號(hào)處理于繼代后12 d最早出現(xiàn)不定根，當(dāng)硝酸銨含量繼續(xù)降低，根系分化所需時(shí)間不再縮短，并且根系出現(xiàn)發(fā)褐發(fā)黑現(xiàn)象；添加了NAA的處理根系較細(xì)長(zhǎng)，呈白色（表5）。綜合比較，認(rèn)為（2）號(hào)培養(yǎng)基（1/2 MS＋0.1 mg/LNAA）為最適微型月季生根培養(yǎng)基（圖1）。

表5 不同的培養(yǎng)基對(duì)微型月季生根的影響

3 討論

叢芽增殖培養(yǎng)中，細(xì)胞分裂素濃度過高會(huì)導(dǎo)致叢芽出現(xiàn)玻璃化，這與雷穎等[16]的報(bào)道一致，但是如果降低細(xì)胞分裂素6-BA的濃度，叢芽增殖速率就會(huì)受到明顯的抑制。本試驗(yàn)中，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度上升至3 mg/L時(shí)，新生叢芽開始出現(xiàn)明顯的玻璃化現(xiàn)象，玻璃化的細(xì)小叢芽剝離后，經(jīng)過2～3次繼代成長(zhǎng)雖能夠自行脫離玻璃化，但在恢復(fù)期間增殖速度會(huì)明顯受到影響。在不改變6-BA濃度的情況下適當(dāng)提高NAA的濃度，希望通過調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素之比的方法解決高增殖系數(shù)下玻璃化的影響。本試驗(yàn)證明，適當(dāng)提高NAA濃度，能夠較好地控制細(xì)胞分裂素濃度過高導(dǎo)致的叢芽玻璃化現(xiàn)象，抑制玻璃化現(xiàn)象的同時(shí)保持了比較高的增殖效率。

在繼代過程中發(fā)現(xiàn)，底部較老的莖容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。本試驗(yàn)中，只是在繼代時(shí)將底部的褐化莖做了切除處理，莖底褐化現(xiàn)象對(duì)微型月季增殖快繁的影響還有待探究。利用添加活性炭、水解乳蛋白[17-18]等方法探究莖底部褐化現(xiàn)象對(duì)于微型月季組培快繁的影響，或許能夠進(jìn)一步提高微型月季的工廠化育苗水平。

叢芽分化培養(yǎng)過程中偶見花芽分化，說明微型月季在一定條件下能夠在瓶?jī)?nèi)開花，這也表明，在組培條件下存在研究微型月季整個(gè)生活史的可能。關(guān)于微型月季試管開花的研究可見少量報(bào)道[19-20]，微型月季在組培條件下完成生活史的適宜條件尚有待研究。

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Study on Key Techniques of Tissue Culture and Rapid Propagation ofRosa hybrida

LIANGZheng1，JIAMinlong1，LI Yongping1，DUANJiuju1，WANGYunshan1，CAODongmei1，ZHENGMeimei2
（1.Institute ofHorticulture，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；
2.Shanxi Meizhi GardeningCo.，Ltd.，Taiyuan 030000，China）

Young stem segments with axillary buds from miniature rose（Rosa hybrida）were employed for studies of tissue culture,which included explant sterilization,callus induction,shoots regeneration and plant rooting.The results showed that the survival rate of explants was the highest when sterilized with 75%alcohol for 2 min and HgCl2for 10-15 min.The callus induction rate reached 95%when the mediumMS＋2 mg/L6-BA＋0.1 mg/LNAAwas used.The optimummediumfor callus proliferation was MS＋1 mg/L6-BA＋0.5 mg/L KT＋0.2 mg/L NAA.The optimal medium for shoots increased was MS＋3 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L KT＋0.2 mg/L NAA.The optimummediumfor rootingwas 1/2 MS＋0.1 mg/LNAA.

tissue culture;Rose hybrida;rapid propagation

S685.12

A

1002-2481（2017）11-1751-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.11.05

2017-07-14

山西省科技成果轉(zhuǎn)化引導(dǎo)專項(xiàng)二批（201604D132045）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院攻關(guān)項(xiàng)目（YGG1604）

梁 崢（1987-），女，河北邢臺(tái)人，助理研究員，碩士，主要從事觀賞植物生物技術(shù)研究工作。曹冬梅為通信作者。