補(bǔ)中益氣湯灌胃對右下肺癌肺葉切除術(shù)后大鼠外周血T細(xì)胞水平的影響

李小海，黎建軍，郭亞雄，王百林，張雪燕，張貴平

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州 510405；2深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院；3中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院；4廣州醫(yī)科大學(xué))

補(bǔ)中益氣湯灌胃對右下肺癌肺葉切除術(shù)后大鼠外周血T細(xì)胞水平的影響

李小海1，2，黎建軍3，郭亞雄1，王百林1，張雪燕4，張貴平4

(1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州 510405；2深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院；3中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院；4廣州醫(yī)科大學(xué))

目的觀察補(bǔ)中益氣湯灌胃對右下肺癌肺葉切除術(shù)后大鼠外周血T細(xì)胞水平的影響。方法Wistar大鼠80只，制備大鼠右下肺鱗癌模型。取模型制備成功大鼠60只，將其隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對照組各30只，均行右下肺葉切除。自術(shù)后次日實(shí)驗(yàn)組經(jīng)口給予補(bǔ)中益氣湯灌胃，100 mL/(kg·d)；對照組等量生理鹽水灌胃。右下肺葉切除術(shù)中取各組右下肺血管內(nèi)不凝血50 μL作為術(shù)前血；術(shù)后第3、7、14天分別處死實(shí)驗(yàn)組、對照組10只大鼠，取大鼠眼眶靜脈不凝血50 μL。用流式細(xì)胞儀檢測各組大鼠術(shù)前及術(shù)后第3、7、14天外周血CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞水平，并計算CD4+/CD8+。結(jié)果與本組術(shù)前相比，術(shù)后實(shí)驗(yàn)組、對照組術(shù)后第3天外周血CD3+、CD4+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+均低，CD8+T細(xì)胞水平高(P均<0.05)。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第7天較術(shù)前及對照組術(shù)后第7天外周血CD3+、CD4+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+高，CD8+T細(xì)胞水平低(P均<0.05)。與本組術(shù)前相比，實(shí)驗(yàn)組和對照組術(shù)后第14天外周血CD3+、CD4+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+均高，CD8+T細(xì)胞水平均低(P均<0.05)，而術(shù)后兩組相比P均>0.05。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第3、7、14天外周血CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+兩兩相比P均<0.05。結(jié)論補(bǔ)中益氣湯灌胃可提高右下肺癌肺葉切除術(shù)后大鼠外周血CD3+、CD4+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+，并降低CD8+T細(xì)胞水平。

補(bǔ)中益氣湯；肺腫瘤；肺葉切除術(shù)；T淋巴細(xì)胞；大鼠

近年來肺癌發(fā)病率明顯上升，病死率較高，在早中期采用以手術(shù)切除為主的綜合治療療效較好。但肺癌根治術(shù)后患者身體受打擊較大，免疫功能顯著下降，不利于患者的康復(fù)，且不利于術(shù)后的放化療等輔助治療，故提高患者術(shù)后免疫功能顯得極其重要[1,2]。目前有臨床研究將補(bǔ)中益氣湯應(yīng)用于肺癌肺葉切除術(shù)后，療效良好[2,3]，但其免疫調(diào)節(jié)水平及其應(yīng)用療程尚未明確，且對肺癌切除患者T細(xì)胞水平影響的相關(guān)報道極少。2015年1月～2017年1月，本研究觀察了補(bǔ)中益氣湯灌胃對右下肺癌肺葉切除術(shù)后大鼠T細(xì)胞水平的影響，為補(bǔ)中益氣湯的臨床應(yīng)用提供有力的基礎(chǔ)研究證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑及儀器 Wistar大鼠80只，均為雄性，鼠齡4～6個月。主要試劑：T細(xì)胞亞群免疫組化試劑盒(北京賽馳生物科技有限公司)，三甲基膽蒽(MCA)，二乙基亞硝胺(DEN)，乙醚，鹽酸氯胺酮注射液，超液化碘油等。實(shí)驗(yàn)儀器：BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，LDZ5-2型低速自動平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，3D數(shù)字化三維成像全景X光機(jī)(美國GE公司)。

1.2 補(bǔ)中益氣湯配置 補(bǔ)中益氣湯處方組成及配置按廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑中心標(biāo)準(zhǔn)。成分有黃芪60 g，白術(shù)15 g，人參10 g，柴胡10 g，當(dāng)歸10 g，炙甘草10 g，廣升麻10 g，陳皮10 g。劑型：每1劑水煎至200 mL，分裝成每袋100 mL備用。

1.3 右下肺鱗癌模型建立及動物分組、處理 首先制備致癌劑：將10 mL碘油、1 mL DEN、750 mg MCA混和后，置于70 ℃水浴箱過夜(整個過程密封)。成功判斷標(biāo)準(zhǔn)：在碘油里看不到固體粉末，為混懸液。按文獻(xiàn)[4]方法制備大鼠右下肺鱗癌模型，在內(nèi)鏡下向大鼠右下支氣管內(nèi)灌注致癌劑。灌藥后即刻、3個月、6個月接受X線體層攝影檢查，并在造模6～8個月后查X線體層攝影篩選。成功造模者可見右下肺野塊狀或結(jié)節(jié)狀陰影；并對隨后的右下肺葉切除術(shù)標(biāo)本進(jìn)一步病理確診。成功建立大鼠右下肺癌模型66只，取60只進(jìn)行本研究，將其隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對照組各30只。腹腔注射0.5%異戊巴比妥鈉(0.3 mL/20 g)麻醉各組大鼠，行右下肺葉切除；術(shù)后右胸腔閉式引流，胸水<10 mL/24 h時拔除胸管。自術(shù)后次日實(shí)驗(yàn)組每日晨9:00經(jīng)口給予補(bǔ)中益氣湯灌胃，100 mL/(kg·d)；對照組等量生理鹽水灌胃。

1.4 外周血T細(xì)胞水平檢測 采用流式細(xì)胞儀檢測。右下肺葉切除術(shù)中取各組右下肺血管內(nèi)不凝血50 μL作為術(shù)前血。術(shù)后第3、7、14天分別處死實(shí)驗(yàn)組、對照組10只大鼠，處死時取大鼠眼眶靜脈不凝血50 μL。取抗凝全血50 μL，室溫放置15 min后加入適量紅細(xì)胞溶解液，溶血后去除紅細(xì)胞；加入5 μL CD3+、5 μL CD4+和5 μL CD8+單克隆抗體于離心管中混勻；室溫避光15 min；1 000 r/min離心1.5 min；倒去上清液，加入500 μL PBS液，輕輕搖蕩10 min。用流式細(xì)胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞水平，并計算CD4+/CD8+。

2 結(jié)果

各組外周血T細(xì)胞水平比較見表1。

表1 各組外周血T細(xì)胞水平比較

注：與本組術(shù)前相比，*P<0.05；與本組術(shù)后第3天相比，#P<0.05；與本組術(shù)后同時點(diǎn)相比，△P<0.05；與對照組術(shù)后第7天相比，▲P<0.05。

3 討論

一般情況下手術(shù)后免疫功能將減弱，許多學(xué)者認(rèn)為CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞水平和CD4+/CD8+可以作為衡量圍手術(shù)期細(xì)胞免疫功能的主要指標(biāo)。CD3+、CD4+T細(xì)胞的作用是促進(jìn)免疫應(yīng)答,而CD8+T細(xì)胞可抑制免疫應(yīng)答[5～7]。

補(bǔ)中益氣湯方是李東垣根據(jù)《素問·至真要大論》“損者益之,勞者溫之”的宗旨而制定，為補(bǔ)中益氣、升陽舉陷、甘溫除大熱的代表方,由黃芪、炙甘草、人參、白術(shù)、當(dāng)歸、陳皮、柴胡、升麻等組成。黃芪味甘微溫，入脾、肺經(jīng)，補(bǔ)中益氣,升陽固表為君藥；輔以炙甘草、人參、白術(shù)益氣健脾,助黃芪增強(qiáng)補(bǔ)中益氣之功而為臣藥；血為氣之母，氣虛時久，營血亦虧，故用當(dāng)歸養(yǎng)血和營,助參芪以補(bǔ)氣生血；配陳皮理氣和胃,使諸藥補(bǔ)而不滯；用少量升麻、柴胡,助主藥以升提中氣、升陽舉陷；炙甘草調(diào)和諸藥，共為佐使。用于治療中氣下陷、脾胃虛弱、氣虛發(fā)熱、氣粗而喘等癥[8,9]?，F(xiàn)代藥理研究[10,11]表明,補(bǔ)中益氣湯可以綜合性地提高機(jī)體免疫力,促進(jìn)抗體產(chǎn)生,延長抗體作用時間。黃芪具有促血管生成作用,并有一定的造血功能[12]。黃芪多糖、人參皂苷、白術(shù)等通過抑制抑制性T細(xì)胞，使其他T細(xì)胞亞群如輔助性T細(xì)胞的功能得以增強(qiáng)，使T細(xì)胞分化成熟，并顯著提高其活性并促進(jìn)新陳代謝[8,11]。

肺癌患者接受肺葉切除術(shù)后由于手術(shù)創(chuàng)傷、失血、食欲下降、肺部炎癥、肺容量減少和麻醉反應(yīng)等，在術(shù)后初期免疫功能大都進(jìn)一步明顯下降，反映免疫功能的T細(xì)胞水平將出現(xiàn)波動，表現(xiàn)為CD3+、CD4+T細(xì)胞水平和CD4+/CD8+下降、CD8+T細(xì)胞水平升高；隨著術(shù)后康復(fù)，CD3+、CD4+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+逐漸回升至術(shù)前水平或超過術(shù)前水平[5,6,13]。董經(jīng)光等[6]指出肺癌患者術(shù)前CD3+、CD4+T細(xì)胞水平和CD4+/CD8+低于肺良性腫瘤患者和對照者,而CD8+T細(xì)胞水平高于肺良性腫瘤患者和對照者；肺癌患者術(shù)后第1天的CD3+、CD4+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+較術(shù)前降低,而CD8+T細(xì)胞水平升高；術(shù)后第7～14天,上述各項指標(biāo)基本恢復(fù)到術(shù)前水平；術(shù)后第21天,CD3+、CD4+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+均較術(shù)前升高，而CD8+T細(xì)胞水平顯著降低。本研究各組術(shù)前T細(xì)胞水平比較無明顯差異，說明兩組實(shí)驗(yàn)前免疫狀況基本一致。本研究結(jié)果表明，與術(shù)前T細(xì)胞水平比較，實(shí)驗(yàn)組和對照組術(shù)后第3天CD3+、CD4+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+均低，CD8+T細(xì)胞水平高，且兩組術(shù)后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明術(shù)后第3天兩組的免疫功能因?yàn)槭中g(shù)打擊都未能恢復(fù)至術(shù)前水平，且補(bǔ)中益氣湯尚未能充分發(fā)揮出免疫調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果表明，與術(shù)前T細(xì)胞水平比較，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第7天CD3+、CD4+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+高，CD8+T細(xì)胞水平低，對照組無明顯差異，且實(shí)驗(yàn)組波動幅度大于對照組，說明術(shù)后第7天兩組的免疫功能逐步康復(fù)，且補(bǔ)中益氣湯充分發(fā)揮了細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組、對照組術(shù)后第14天的T細(xì)胞水平與術(shù)前比較均有改善，但兩組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，說明術(shù)后第14天大鼠發(fā)揮了自主免疫調(diào)節(jié)功能，與是否應(yīng)用補(bǔ)中益氣湯已經(jīng)無明顯關(guān)系。本研究結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第3、7、14天CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+兩兩相比均有統(tǒng)計學(xué)差異，對照組術(shù)后第3、7、14天CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+兩兩相比均有統(tǒng)計學(xué)差異，說明兩組術(shù)后14 d內(nèi)T細(xì)胞免疫功能逐步改善?？梢姡a(bǔ)中益氣湯灌胃可提高右下肺癌肺葉切除術(shù)后大鼠CD3+、CD4+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+，并降低CD8+T細(xì)胞水平。

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2017-04-04)