ADAM10抑制劑GI254023X對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響及機(jī)制

徐杰，劉佳，錢(qián)龍娣，杜秀平，韓正祥

(1泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東泰安 271000；2泰安市中心醫(yī)院；3徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

ADAM10抑制劑GI254023X對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外生物學(xué)行為的影響及機(jī)制

徐杰1，劉佳2，錢(qián)龍娣3，杜秀平3，韓正祥3

(1泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東泰安 271000；2泰安市中心醫(yī)院；3徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

目的觀察高選擇性去整合素金屬蛋白酶10(ADAM10)抑制劑GI254023X對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231增殖、凋亡、侵襲、遷移等生物學(xué)行為的影響，并初步探討其可能作用機(jī)制。方法取乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231，用不同濃度(0、10、20、30、40、50 μmol/L)的GI254023X分別處理兩種細(xì)胞48、72 h，采用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。取MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞，將其分為對(duì)照組、低濃度組與高濃度組，低濃度組加入10 μmol/L的GI254023X，高濃度組加入20 μmol/L的GI254023X，對(duì)照組加入和實(shí)驗(yàn)組等量的DMSO溶劑，采用流式細(xì)胞儀測(cè)算細(xì)胞凋亡率，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲能力，Western boltting法檢測(cè)切割后的Notch1(Cleaved-Notch1)、Hes-1蛋白表達(dá)，qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞Hes-1 mRNA表達(dá)。結(jié)果隨著GI254023X藥物濃度增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率不斷升高(P均<0.05)。與對(duì)照組相比，低濃度組、高濃度組MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率高，遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)少，Cleaved-Notch1、Hes-1蛋白表達(dá)少，Hes-1 mRNA表達(dá)少，且高濃度組較低濃度組更明顯(P均<0.05)。結(jié)論ADAM10抑制劑GI254023X可抑制乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231增殖，誘導(dǎo)其凋亡，減弱其遷移和侵襲運(yùn)動(dòng)能力，該作用可能是通過(guò)下調(diào)ADAM10的表達(dá)來(lái)抑制Notch1信號(hào)通路的活化實(shí)現(xiàn)的。

去整合素金屬蛋白酶10；乳腺腫瘤；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞遷移；細(xì)胞侵襲；Notch1信號(hào)通路

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤，是全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，占女性新發(fā)惡性腫瘤的29%，其病死率僅次于肺癌而位居第二[1]，給女性患者的生活及生命帶來(lái)了極為嚴(yán)重的影響。去整合素金屬蛋白酶(ADAMs)因分子結(jié)構(gòu)上有解聚素域和金屬蛋白酶域兩個(gè)重要功能的結(jié)構(gòu)域而命名，是一個(gè)新的基因家族。ADAMs家族成員在細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、白細(xì)胞募集、炎癥、蛋白水解等方面發(fā)揮各自的作用[2]。ADAM10是ADAMs家族重要成員之一，干擾后可抑制膀胱癌、舌鱗癌等腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力[3～5]。Pruessmeyer等[6]發(fā)現(xiàn)，ADAM10在乳腺癌組織中過(guò)表達(dá)。抑制ADAM10表達(dá)是否也會(huì)抑制體外乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲并促進(jìn)其凋亡，尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，2015年1～6月，我們觀察了ADAM10抑制劑GI254023X對(duì)人乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；GI254023X購(gòu)自北京歐凱納斯科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；Annexin V-APC/7-AAD試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和總RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Western blotting一抗購(gòu)自Cell Signalling Technology公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將MCF-7常規(guī)培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，MDA-MB-231細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，均置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)算 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞懸液至細(xì)胞密度為1.0×105/mL，按每孔100 μL接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。24 h后實(shí)驗(yàn)組分別加入10、20、30、40、50 μmol/L的GI254023X處理細(xì)胞，對(duì)照組加入和實(shí)驗(yàn)組等量的DMSO溶劑，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。接種后細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48、72 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育4 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處的OD值。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，增殖抑制率為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)]×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡率測(cè)算 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板上，分為對(duì)照組、低濃度組、高濃度組。低濃度組加入10 μmol/L的GI254023X，高濃度組加入20 μmol/L的GI254023X，對(duì)照組加入等量的DMSO溶劑。孵育48 h后，2 000 r/min離心5 min收集細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞2次，每(1～5)×105個(gè)細(xì)胞加入500 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞。加入5 μL AnnexinV-APC，混勻，室溫避光孵育15 min，加入5 μL 7-AAD混勻后冰浴避光上流式細(xì)胞儀分析，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.5 細(xì)胞遷移能力觀察 采用Transwell侵襲小室試驗(yàn)。細(xì)胞處理及分組同1.4，常規(guī)洗滌、消化、離心，收集細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用無(wú)血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×106/mL，接種于Transwell小室的上室150 μL，下室為10%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μL。培養(yǎng)24 h后，將Transwell小室取出，用棉簽輕輕擦去上室表面黏附的細(xì)胞，95%甲醇固定20 min，PBS洗3遍，結(jié)晶紫染色30 min。使用倒置顯微鏡，觀測(cè)上室遷移至微孔膜下層的細(xì)胞，拍攝5個(gè)隨機(jī)視野，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.6 細(xì)胞侵襲能力觀察 Transwell侵襲小室外膜涂50 μL纖維黏連蛋白，用槍頭攤平，風(fēng)干后內(nèi)膜平鋪Matrigel稀釋液30 μL，37 ℃過(guò)夜凝膠。細(xì)胞處理及分組同1.4，常規(guī)洗滌、消化、離心，收集細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用無(wú)血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，其他步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.7 切割后的Notch1(Cleaved-Notch1)、Hes-1蛋白檢測(cè) 細(xì)胞處理及分組同1.4。收集處理48 h的細(xì)胞，提取各組蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，明膠室溫封閉1 h。加入一抗抗體(Cleaved-Notch1 1∶1 000, Hes-1 1∶1 000, β-actin 1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，1×PBST液洗膜3次，10 min/次。后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，PBST洗膜3次后，加入顯色液(BIO-RAD)，采用生物分子成像儀LAS4000(GE Healthcare公司)成像。內(nèi)參照選用β-actin，結(jié)果以Image J分析處理，計(jì)算得出相對(duì)灰度值來(lái)代表Cleaved-Notch1、Hes-1蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 Hes-1 mRNA檢測(cè) 采用RT-qPCR法。細(xì)胞處理及分組同1.4。收集細(xì)胞，按TRIzol總RNA分離試劑盒說(shuō)明書(shū)(Invitrogen公司)進(jìn)行總RNA提取，cDNA的合成按照M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)(Invitrogen 公司)推薦的條件。采用LightCycler 480 SYBR Green Ⅰ Master熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明加入相應(yīng)組分，反應(yīng)體系為20 μL。Hes-1上、下游引物分別為5′-AACACTGATTTTGGATGCTCTGA-3′、5′-GGTACTTCCCCAGCACACTTG-3′，GAPDH上、下游引物分別為5′-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′、5′-CAAAGGTGGAGGAGTGGGTG-3′。實(shí)時(shí)定量PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃變性10 s，60 ℃退火，延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算Hes-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度GI254023X處理MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率比較 見(jiàn)表1、2。

表1 不同濃度GI254023X處理MCF-7細(xì)胞增殖抑制率比較

注：與同濃度48 h相比，aP<0.05；與10 μmol/L相比，bP<0.05；與20 μmol/L相比，cP<0.05；與30 μmol/L相比，dP<0.05；與40 μmol/L相比，eP<0.05。

表2 不同濃度GI254023X處理MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率比較

注：與同濃度48 h相比，aP<0.05；與10 μmol/L相比，bP<0.05；與20 μmol/L相比，cP<0.05；與30 μmol/L相比，dP<0.05；與40 μmol/L相比，eP<0.05。

2.2 各組細(xì)胞凋亡率比較 見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與低濃度組相比，#P<0.05。

2.3 各組細(xì)胞遷移能力比較 見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞遷移能力比較(個(gè)

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與低濃度組相比，#P<0.05。

2.4 各組細(xì)胞侵襲能力比較 見(jiàn)表5。

表5 各組細(xì)胞侵襲能力比較(個(gè)

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與低濃度組相比，#P<0.05。

2.5 各組細(xì)胞Cleaved-Notch1、Hes-1表達(dá)比較 見(jiàn)表6。

表6 各組細(xì)胞Cleaved-Notch1、Hes-1表達(dá)比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與低濃度組相比，#P<0.05。

3 討論

ADAMs家族是一個(gè)新的基因家族，屬Ⅰ型跨膜蛋白，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)的相互作用中至關(guān)重要。ADAM10為該家族重要成員之一，其可引起多種細(xì)胞表面分子脫落，包括鈣黏素和淀粉樣前體蛋白。ADAM10能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境和腫瘤進(jìn)展的重要過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、遷移和血管生成等。研究[7,8]已經(jīng)證實(shí)，過(guò)表達(dá)的ADAM10是腫瘤高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的一項(xiàng)潛在預(yù)測(cè)指標(biāo)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10、20、30、40、50 μmol/L的ADAM10抑制劑GI254023X處理乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率不斷升高，兩兩相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且同濃度時(shí)72 h較48 h細(xì)胞增殖抑制率高，表明GI254023X可抑制MCF-7、MDA-MB-231的增殖，具有明顯的誘導(dǎo)凋亡作用，并且隨濃度的增高或時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。侵襲性是腫瘤細(xì)胞的重要惡性表型，研究腫瘤細(xì)胞的侵襲能力對(duì)于臨床腫瘤疾病轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的治療具有重要價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，與對(duì)照組比較，低濃度組、高濃度組MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率高，遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)少，且高濃度組較低濃度組更明顯?？梢?jiàn)，GI254023X對(duì)于MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)起到抑制作用，且能拮抗腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲轉(zhuǎn)移。

Notch信號(hào)通路是決定細(xì)胞命運(yùn)的重要通路[9]，而ADAM10在Notch1蛋白的切割中起重要作用，參與Notch1靶基因Hes-1及v-Myc的轉(zhuǎn)錄激活[10～12]。有研究[13]發(fā)現(xiàn),下調(diào)Notch1和Jagged1的表達(dá)可抑制子宮頸癌和絨毛膜癌細(xì)胞的侵襲。在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞及急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞中沉默ADAM10的表達(dá)，可觀察到細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力均受到抑制，Notch1的活化受到明顯抑制，提示該作用可能與抑制Notch1信號(hào)通路的活化有關(guān)[14,15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，低濃度組、高濃度組MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞Cleaved-Notch1、Hes-1蛋白表達(dá)少，且高濃度組較低濃度組更明顯。說(shuō)明G1254023X抑制ADAM10后，MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞中Notchl的切割活化受到抑制。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，低濃度組、高濃度組MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞Hes-1 mRNA表達(dá)少，且高濃度組較低濃度組更明顯，進(jìn)一步證實(shí)G1254023X可抑制MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞Notchl信號(hào)通路的活化。

綜上所述，ADAM10抑制劑GI254023X具有明顯影響乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231生物學(xué)行為的作用，具體表現(xiàn)為增殖抑制、誘導(dǎo)凋亡，并且減弱遷移和侵襲運(yùn)動(dòng)能力。GI254023X可能通過(guò)下調(diào)ADAM10的表達(dá)，抑制Notch1信號(hào)通路的活化，從而對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。

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韓正祥(E-mail: cnhzxyq@163.com)

2017-06-24)