澤蘭乙醇提取物對大鼠離體心肌缺氧損傷的影響及機(jī)制

金玉，張默函，洪蘭，崔昊震

(1延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉 133000；2延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3延邊大學(xué)中醫(yī)學(xué)院)

澤蘭乙醇提取物對大鼠離體心肌缺氧損傷的影響及機(jī)制

金玉1，張默函2，洪蘭2，崔昊震3

(1延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉 133000；2延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院；3延邊大學(xué)中醫(yī)學(xué)院)

目的觀察澤蘭乙醇提取物對大鼠離體心肌缺氧損傷的影響，并探討其機(jī)制。方法將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、HI模型組、澤蘭組和LY294002組，各10只。取各組大鼠左心房建立心房灌流模型，正常對照組用氧飽和的HEPES緩沖液進(jìn)行離體灌流，其他三組制備急性心肌缺氧損傷模型，澤蘭組灌流時加入澤蘭乙醇提取物(0.1 mg/mL)，LY294002組加入PI3K/Akt信號通路阻斷劑LY294002(1.0 mol/L)、澤蘭乙醇提取物(0.1 mg/mL)。采用生理記錄系統(tǒng)觀察第1循環(huán)末、第7循環(huán)末、第13循環(huán)末時各組大鼠的心房搏動壓，并采用Western blotting法檢測各組大鼠心臟組織中磷酸化Akt(p-Akt)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)、血紅素氧合酶-1(HO-1)蛋白表達(dá)。結(jié)果心房搏動壓在第7循環(huán)末時HI模型組、澤蘭組、LY294002組均較正常對照組低(P均<0.05)，在第13循環(huán)末時澤蘭組、LY294002組較HI模型組高(P均<0.05)。HI模型組心肌組織中p-Akt蛋白表達(dá)較正常對照組低，澤蘭組較HI模型組、LY294002組高(P均<0.05)；HI模型組HIF-1α、HO-1蛋白表達(dá)均較正常對照組高，澤蘭組均較HI模型組及LY294002組高(P均<0.05)。結(jié)論澤蘭乙醇提取物對大鼠離體缺氧損傷心肌具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)PI3K/Akt/HIF-1α信號通路，從而增強(qiáng)其下游的HO-1蛋白表達(dá)有關(guān)。

澤蘭；心肌缺氧損傷；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；磷脂酰肌醇3激酶；血紅素氧合酶-1

心肌缺氧是指各種原因引起冠狀動脈血流量降低，致使心肌氧等物質(zhì)供應(yīng)不足和代謝產(chǎn)物清除減少為主的病理過程。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)作為細(xì)胞氧穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的調(diào)控因子，在缺氧適應(yīng)性反應(yīng)中起核心作用[1]。近期研究[2]表明，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路在心肌缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮重要作用，激活PI3K/Akt信號通路可誘導(dǎo)HIF-1α蛋白的合成，并參與對HIF-1α的調(diào)節(jié)。此外，血紅素氧合酶-1(HO-1)作為HIF-1α的下游基因，通過其降解產(chǎn)物在心肌缺血/缺氧病理過程中發(fā)揮重要的保護(hù)功能[3]。澤蘭作為常見中草藥，具有活血化瘀、行水消腫等功效，可發(fā)揮抗血管炎癥、抗血小板凝聚、降低血糖和增強(qiáng)心肌收縮力等多種藥理作用[4～6]。但有關(guān)澤蘭抗心肌缺氧損傷方面的研究尚未見報道。2016年6～11月，本研究觀察了澤蘭乙醇提取物對大鼠離體心肌缺氧損傷的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 成年雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(250±30)g，由延邊大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(吉)2011-0007。澤蘭購自北京同仁堂藥店。兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗體(Abcam公司)、兔抗大鼠HO-1多克隆抗體(Abcam公司)、兔抗大鼠p-Akt多克隆抗體(p-Akt Ser473，Santa Cruz公司)、兔抗大鼠β-actin多克隆抗體(Santa Cruz公司)、PI3K/Akt信號通路阻斷劑LY294002(Cell Signaling公司)。

1.2 澤蘭乙醇提取物的制備[6]取澤蘭全草500 g干燥后切碎，用8倍藥物體積的95%乙醇浸泡24 h，6倍和4倍95%乙醇回流提取，回旋式減壓濃縮機(jī)進(jìn)行濃縮，經(jīng)冷凍干燥機(jī)凍干后取得黑褐色粉末狀藥物(4.75 g)，置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動物分組及處理 將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組、HI模型組、澤蘭組和LY294002組，各10只。將所有大鼠用20%烏拉坦麻醉，迅速開胸取心，剝離左心房，固定在Choi等[7]研制的離體心臟灌流裝置上。給藥前，對離體心房灌注60 min以使心搏出量、心房搏動壓趨于穩(wěn)定。心房搏動頻率固定在1.5 Hz，每2 min間隔記錄左心房搏動壓。在心房灌流模型建立后，正常對照組用氧飽和的HEPES緩沖液進(jìn)行13個循環(huán)(156 min)的離體灌流實驗；而HI模型組、澤蘭組和LY294002組均經(jīng)過1個對照循環(huán)(12 min)灌流，繼以氮氣(5% CO2+95% N2)取代氧氣(5% CO2+95% O2)的方法制備急性缺氧損傷模型。以生理記錄儀上顯示心房搏動壓水平下降≥80%作為急性心肌缺氧損傷模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)。HI模型組進(jìn)行12個循環(huán)(144 min)的缺氧灌流。澤蘭組在進(jìn)行6個循環(huán)(72 min)缺氧灌流后，在持續(xù)缺氧狀態(tài)下再給予6個循環(huán)(72 min)的澤蘭乙醇提取物(0.1 mg/mL)灌流。LY294002組在進(jìn)行6個循環(huán)(72 min)缺氧狀態(tài)下，經(jīng)LY294002(1 mol/L)預(yù)處理后，持續(xù)在缺氧和LY294002共同存在的條件下給予6個循環(huán)(72 min)的澤蘭乙醇提取物(0.1 mg/mL)灌流。

1.4 各組大鼠心房搏動壓檢測 心房灌流模型主體為透明聚乙烯套管(外徑為4 mm)，其下方固定被剝離的左心房。套管的兩側(cè)各埋藏1根細(xì)管和1條可用于電刺激的白金電極。左側(cè)細(xì)管主要用于灌流緩沖液，右側(cè)與壓力感受器及BL-420S生物信號采集與分析系統(tǒng)相連，并測定每2 min內(nèi)心房搏動壓平均值的變化。比較各組大鼠第1循環(huán)末(10～12 min)、第7循環(huán)末(82～84 min)、第13循環(huán)末(154～156 min)時心房搏動壓變化。心房灌流模型中心房搏動壓改變與每回心房搏出量變化呈正比，能夠間接反映心肌收縮力的變化[6,7]。

1.5 各組大鼠心肌組織p-Akt、HIF-1α和HO-1蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。灌流實驗結(jié)束后迅速將各組大鼠心房組織稱重，按照組織蛋白提取試劑盒要求提取總蛋白，并用全波長分光光度計測定蛋白樣品的濃度。取待測組織蛋白煮沸5 min。制備10% SDS-PAGE凝膠，電泳分離后用半干轉(zhuǎn)移法將分離膠內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉TBS-T緩沖液封閉PVDF膜上的非特異性位點，并分別加入兔抗大鼠p-Akt多克隆一抗(1∶400)、兔抗大鼠HIF-1α和HO-1多克隆一抗(1∶1 000)，在4 ℃孵育過夜，洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)，室溫下孵育1 h，洗膜。圖像分析系統(tǒng)曝光成像并分析圖像，以β-actin為內(nèi)參，計算p-Akt、HIF-1α和HO-1蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心房搏動壓比較 見表1。

表1 各組大鼠心房搏動壓比較

注：與正常對照組比較，#P<0.05；與HI模型組比較，△P<0.05；與同組第7循環(huán)末比較，*P<0.05。

2.2 各組大鼠心肌組織p-Akt、HIF-1α、HO-1蛋白表達(dá)比較 見表2、圖1。

表2 各組大鼠心肌組織p-Akt、HIF-1α、HO-1蛋白表達(dá)比較

注：與正常對照組比較，#P<0.05；與HI模型組比較，△P<0.05；與LY294002組比較，*P<0.05。

圖1 各組大鼠心肌組織p-Akt、HIF-1α、HO-1蛋白表達(dá)(Western blotting法)

3 討論

心肌缺氧損傷是缺血性心臟病最常見的癥狀之一，傳統(tǒng)中藥中活血化瘀類、補氣類及清熱類藥物已被用于干預(yù)心臟缺血再灌注損傷的研究中[8]。澤蘭屬于活血化瘀類藥物，臨床可用于治療痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、跌打損傷、浮腫等。心肌收縮力是衡量心臟功能的重要指標(biāo)之一，而缺氧能夠造成心肌細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷的含量與活性降低，致使細(xì)胞內(nèi)外離子分布異常引起心肌細(xì)胞功能下降，導(dǎo)致心肌收縮力明顯減弱。本研究發(fā)現(xiàn)，HI模型組第7、13循環(huán)末的心房搏動壓較正常對照組明顯降低，澤蘭組第13循環(huán)末的心房搏動壓較HI模型組明顯增高，表明澤蘭乙醇提取物可增強(qiáng)離體心肌缺氧損傷大鼠的心肌收縮力，并發(fā)揮對心肌缺氧損傷的保護(hù)作用。

PI3K/Akt信號通路是膜受體信號向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑，在細(xì)胞增殖、代謝、凋亡等過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。HIF-1α是細(xì)胞氧穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的調(diào)控因子，在缺氧的條件下可通過調(diào)節(jié)其下游的促紅細(xì)胞生成素、誘導(dǎo)型NO合成酶、血管內(nèi)皮生長因子、葡萄糖轉(zhuǎn)運體的表達(dá)，促進(jìn)紅細(xì)胞生成、血管形成及糖代謝，從而增強(qiáng)細(xì)胞對缺氧的耐受性，參與心肌缺血/缺氧損傷的保護(hù)作用[9]。文獻(xiàn)報道，在缺氧刺激下，心肌細(xì)胞可通過PI3K/Akt信號通路誘導(dǎo)HIF-1α蛋白的穩(wěn)定及其轉(zhuǎn)錄，從而增加其表達(dá)水平。梁俊清等[10]研究證實，在缺氧條件下，通心絡(luò)可以激活人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中的PI3K/Akt信號通路，從而上調(diào)HIF-1α蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2、Mcl-1等抗凋亡因子表達(dá)，抑制Bax等促凋亡因子表達(dá)，有效降低細(xì)胞凋亡率，提高缺氧細(xì)胞的增殖率。本研究結(jié)果顯示， HI模型組心肌組織中p-Akt蛋白表達(dá)較正常對照組低，澤蘭組較HI模型組高，LY294002組較澤蘭組低，可見澤蘭乙醇提取物可以使缺氧心肌中p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著提高，而此作用能被PI3K/Akt信號通路阻斷劑LY294002所抑制。此外，心肌組織中的HIF-1α蛋白表達(dá)HI模型組較正常對照組高，澤蘭組較HI模型組高，LY294002組較澤蘭組低。上述研究結(jié)果提示，澤蘭乙醇提取物對缺氧心肌的保護(hù)作用可能與激活PI3K/Akt信號通路，從而上調(diào)HIF-1α蛋白表達(dá)水平有關(guān)。

HO-1作為HIF-1α的下游基因，是血紅蛋白分解代謝的起始與限速酶，在缺氧刺激下大量產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體抗缺氧能力。謝娟等[11]研究表明，激活HIF-1α可以使血管平滑肌細(xì)胞HO-1、誘導(dǎo)型NO合成酶及內(nèi)皮素-1等基因表達(dá)增加，并催化產(chǎn)生CO，激活環(huán)磷酸鳥苷環(huán)化酶，提高環(huán)磷酸鳥苷水平，使血管平滑肌松弛，從而增加血管通透性和血流量，使缺氧組織得到充分的氧供。張國紅等[12]研究表明，在冠心病的發(fā)生、發(fā)展過程中HIF-1α/HO-1通路被激活，其對心肌缺血/缺氧損傷發(fā)揮重要的保護(hù)功能。何祥虎等[13]研究證實，缺血預(yù)處理可以減少大鼠心肌缺血再灌注損傷，原因可能為HIF-1α誘導(dǎo)HO-1表達(dá)上調(diào)，并通過其抗炎、抗凋亡和抗氧化作用來對缺血性心肌發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，HI模型組心肌組織中的HO-1蛋白表達(dá)較正常對照組高，這可能是缺氧刺激下誘導(dǎo)心肌細(xì)胞出現(xiàn)代償性保護(hù)作用引起的[14]。且澤蘭組心肌組織中的HO-1蛋白表達(dá)較HI模型組高，LY294002組較澤蘭組低，提示澤蘭乙醇提取物在大鼠心肌缺氧損傷過程中能夠顯著上調(diào)HO-1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而對心肌缺氧損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，澤蘭乙醇提取物對大鼠離體缺氧損傷心肌具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)PI3K/Akt/HIF-1α信號通路，從而增強(qiáng)其下游的HO-1蛋白表達(dá)有關(guān)。此研究結(jié)果為今后臨床治療缺血性心臟疾病提供了可靠的用藥依據(jù)，也為開發(fā)和研制創(chuàng)新藥物提供了新思路。

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EffectofethanolextractofLycopuslucidusTurczonmyocardialhypoxiainjuryofratsinvitro

JINYu1,ZHANGMohan,HONGLan,CUIHaozhen

(1AffiliatedHospitalofYanbianUniversity,Yanji133000,China)

ObjectiveTo observe the effect of ethanol extract of Lycopus lucidus Turcz (ELT) on myocardial hypoxia injury (HI) of rats in vitro and to investigate the mechanism.MethodsForty male SD rats were randomly divided into the normal control (NC) group , HI model group, ELT group, and ELT+ LY294002 group with 10 rats in each. The atrial perfusion models were established in the left atria of rats in each group.Rats in the NC group were perfused with oxygen-saturated HEPES buffer, while in the other three groups, we established the acute myocardial HI models. Rats in the ELT group were perfused with ethanol extract of ELT (0.1 mg mL), LY294002 group with LY294002 (1.0 mol/L) and ethanol extract of ELT (0.1 mg/mL). The atrial pulse pressure at the end of first cycle , 7th cycle, and 13th cycle of each group was measured by physiological system; the protein expression of phosphorylation of Akt (p-Akt), hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α and hemeoxygenase-1 (HO-1) was detected by Western blotting.ResultsThe atrial pulse pressure of the HI group, ELT group, and LY294002 group at the end of 7th cycle was significantly lower than that of the NC group (allP<0.05); the atrial pulse pressure of ELT group and LY294002 group at the end of 13th cycle was significantly higher than that of the HI group (allP<0.05). Furthermore, the protein level of p-Akt in the HI group was significantly lower than that of the NC group, while the protein level of the ELT group was higher than those of the HI group and LY294002 group (bothP<0.05); the protein levels of HIF-1α and HO-1 in the HI group were significantly higher than those of the NC group, and the ELT group was higher than the HI group and LY294002 group (allP<0.05).ConclusionThe ethanol extract of ELT has cardioprotective effect on myocardial HI of rats in vitro by up-regulating the PI3K/Akt/HIF-1α signaling pathway and thus promoting the HO-1 protein expression.

Lycopus lucidus Turcz; myocardial hypoxia injury; hypoxia-inducible factor-1α; phosphoinositide 3-kinase; hemeoxygenase-1

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.38.004

R542.2

A

1002-266X(2017)38-0011-04

國家自然科學(xué)基金資助項目(81460643)。

金玉(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向為心血管藥理學(xué)。E-mail: yujin322@163.com

崔昊震(1978-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要研究方向為中醫(yī)藥防治心血管系統(tǒng)疾病。E-mail: cuihaozhen@ybu.edu.cn

2017-02-10)