RNA干擾腎癌Survivin基因表達降低786-O細胞增殖能力

徐芝立，張麗紅，張 翼，梁長春，馬志強

(河北省石家莊市第三醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050011)

·論著·

RNA干擾腎癌Survivin基因表達降低786-O細胞增殖能力

徐芝立，張麗紅，張 翼，梁長春，馬志強

(河北省石家莊市第三醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050011)

目的探討腎癌786-O細胞Survivin基因對腎癌增殖能力的影響。方法采用RNA干擾技術轉染腎癌786-O細胞，靶向沉默Survivin基因表達，通過RT-PCR和Western blot實驗檢測沉默效率，并測定增殖細胞核抗原PCNA蛋白表達變化，通過MTS實驗測定細胞增殖活性。結果干擾組Survivin mRNA、Survivin蛋白及PCNA蛋白表達水平明顯低于對照組和空白組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組與空白組Survivin mRNA、Survivin蛋白及PCNA蛋白相對表達量差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。3組786-O細胞增殖活力均呈升高趨勢，干擾組786-O細胞增殖活力明顯低于對照組和空白組，其組間、時點間、組間·時點間交互作用差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論RNA干擾Survivin基因能顯著下調腎癌786-O細胞的Survivin基因表達，并降低細胞增殖活力，揭示出Survivin基因影響腎癌細胞惡性增殖的潛在分子機制。

腎腫瘤；RNA干擾；細胞增殖

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.11.010

腎癌發(fā)病率逐年提高，是最常見的腎實質惡性腫瘤，占腎臟惡性腫瘤的80%～90%，約占成年人全身惡性腫瘤的3%，透明細胞癌是其主要的病理類型。 Survivin是凋亡抑制蛋白家族的重要成員，除了胸腺、睪丸、血管內皮細胞等組織之外幾乎所有成熟分化組織中均不表達，而在胃癌、結腸癌等大多數(shù)惡性腫瘤中呈高表達[1-3]。Survivin是排名第五位的腫瘤特異性基因，具有抑制細胞凋亡、調控細胞增殖和促進腫瘤血管生成等作用，并與腫瘤不良預后、惡性增殖、高復發(fā)率以及治療抵抗密切相關[4]。由于Survivin基因在人體癌組織與正常組織中的表達存在顯著差異，使其成為腫瘤基因靶向治療的理想靶點。本研究采用RNA干擾技術靶向沉默腎癌786-O細胞的Survivin基因表達，通過Western blot實驗測定增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的表達，并通過MTS實驗測定786-O細胞增殖變化情況，旨在進一步探討Survivin基因表達對腎癌786-O細胞腎癌增殖能力的分子機制?，F(xiàn)報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1 一般資料 人腎癌786-O細胞株由河北省腫瘤研究所凍存惠贈。以HuSH pGFP-V-RS為載體構建發(fā)夾結構Survivin沉默質粒，簡稱Survivin siRNA，空載體質粒中沒有Survivin shRNA基因序列的嵌入，又稱control siRNA，購自ORIGENE公司。美國Invitrogen公司設計合成cDNA引物：Survivin上游引物序列5′-CACCGCATCTCT-ACATTCAA-3′；下游引物序列5′-CACTTTCTTCGCAGTTTCCT-3′；擴增產(chǎn)物片段為345 bp。內參β-actin：上游引物5′-CCAAGGCC-AACCGCGAGAAGATGAC-3′；下游引物5′-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3′；擴增片段為 587 bp。Survivin抗體、PCNA分子抗體均購自美國Abcam公司。第一鏈cDNA反轉錄合成試劑盒購自Thermo公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與轉染 人腎癌細胞株786-O接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640混合培養(yǎng)基中，收集對數(shù)生長期的細胞，分成Survivin siRNA/786-O組(干擾組)、control siRNA/786-O組(對照組)和non-siRNA/786-O組(空白組)，按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒的要求進行轉染實驗，成功轉染干擾或對照質粒的細胞均可以表達綠色熒光。

1.2.2 RT-PCR實驗 分別取轉染后48 h對數(shù)生長期的干擾組、對照組和空白組細胞裂解后，按照TriQuick總RNA提取試劑說明書提取總RNA，進行濃度、純度及完整性檢測。兩步法進行RT-PCR反應。第一步：用Thermo公司的第一鏈cDNA反轉錄合成試劑盒進行從RNA到DNA的制備，細胞總RNA于42 ℃ 65 min、70 ℃ 5 min合成cDNA。第二步：將反應產(chǎn)物cDNA適度稀釋后用于PCR擴增，反應條件為Survivin 95 ℃ 5 min、95 ℃ 1 min、58 ℃ 1 min、72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min、4 ℃終止。β-actin：94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，40個循環(huán)；72 ℃ 5 min、4 ℃終止。分別取各目的基因的PCR擴增產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠中電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)進行掃描，采用Gel-Pro Analyzer 3.1分析軟件檢測條帶灰度值，mRNA表達相對值=目的片段灰度值/GAPDH灰度值。

1.2.3 Western Blot實驗 取轉染后48 h對數(shù)生長期的干擾組、對照組和空白組細胞裂解，提取總蛋白，定量。適量蛋白樣品加入SDA-PAGE凝膠中電泳分離蛋白分子，轉膜，滴加一抗，4 ℃過夜，滴加二抗，孵育，洗滌，Odyssey雙色紅外熒光掃描系統(tǒng)分析結果。

1.2.4 MTS實驗 將各組對數(shù)生長期細胞分別接種在96孔板中。每個樣本組按0、24、48、72 h 4個檢測時點分別設置4個復孔，每孔接種1.0×104個細胞。每組單獨另設3個無細胞對照復孔，檢測背景吸光度光密度(optical density,OD)值。在預設檢測時點加入MTS溶液(5 g/L) 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止。在酶聯(lián)免疫檢測儀上490 nm波長測定各孔OD值，并減去無細胞對照復孔所代表的背景OD值作為A值，取相同檢測時點及轉染相同重組慢病毒的A值均值作為該組細胞某天的A值，繪制增殖曲線進行比較。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較分別采用F檢驗、q檢驗和重復測量的方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 細胞轉染效果 熒光顯微鏡下可以觀察到成功轉染干擾質粒載體的Survivin siRNA/786-O細胞、control siRNA/786-O細胞均表達綠色熒光。

2.2 3組腎癌786-O細胞Survivin mRNA、Survivin蛋白及PCNA蛋白表達水平比較 干擾組Survivin mRNA、Survivin蛋白及PCNA蛋白表達水平明顯低于對照組和空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組與空白組Survivin mRNA、Survivin蛋白及PCNA蛋白相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

組別SurvivinmRNASurvivin蛋白PCNA蛋白干擾組0．225±0．0422．842±1．3581．384±0．297對照組0．626±0．102?15．631±3．793?9．861±1．909?空白組0．659±0．082?16．986±3．050?9．747±0．910?F46．37035．77177．728P0．0000．0000．000

*P<0.05與干擾組比較(q檢驗)

2.3 3組腎癌786-O細胞增殖水平比較 3組786-O細胞增殖活力均呈升高趨勢，但干擾組786-O細胞增殖活力均明顯低于對照組和空白組，其組間、時點間、組間·時點間交互作用差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 3組腎癌786-O細胞增殖活力水平比較Table 2 Proliferation activity of renal cancer cell line 786-O 值)

圖1不同分組786-O細胞增殖曲線
Figue1Proliferationcurveofdifferent786-Ocellgroups

3 討 論

許多原癌基因的激活和抑癌基因的失活參與了眾多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。腎癌是嚴重危害人類健康的腎臟最常見惡性腫瘤，約占成年人全身惡性腫瘤的3%，多屬天然耐藥，放化療均不敏感，基因靶向治療為中晚期腎癌的治療提供了新途徑。

Survivin基因位于人類染色體17q25，片段長14.7 kb，是編碼142個氨基酸組成的蛋白，相對分子質量約16 500，含有IAP序列，可直接抑制凋亡酶的活性，由效應細胞蛋白酶受體1在人類基因組庫中雜交篩選而分離出來，是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子[5-6]。基礎研究發(fā)現(xiàn)，Survivin基因在胚胎組織及大多數(shù)腫瘤細胞中廣泛表達，而在成熟分化的終末組織中不表達，不僅可以抑制細胞凋亡，而且在調控細胞增殖機制中發(fā)揮重要作用[4]。在腫瘤細胞中，Survivin通過與紡錘體微管蛋白特異性結合形成染色體乘客絡合體，穩(wěn)定微管結構，避免紡錘體被水解，保護有絲分裂細胞器的完整型，有利于有絲分裂持續(xù)進行，促進腫瘤細胞不斷增殖[6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，Survivin顯著表達于前列腺癌[5]、膀胱癌[7]、胰腺癌[8]、卵巢癌[9]、肺小細胞癌[10]等多種惡性腫瘤中，與患者的腫瘤惡性進展、不良預后密切相關。

RNA干擾技術是通過小干擾RNA特異性降解靶基因mRNA，引起基因轉錄后沉默的現(xiàn)象，具有高效性和序列特異性的優(yōu)點，是新的基因阻斷研究方法。國內學者牛朝霞等[11]利用RNA干擾技術成功靶向沉默Survivin基因表達，并檢測到基質金屬蛋白酶表達下調，進而抑制了食管癌Eca-109細胞的侵襲與遷移，在食管癌模型上驗證了RNA干擾技術靶向沉默Survivin基因的有效性。本研究嘗試通過攜帶干擾RNA的質粒轉染腎癌786-O細胞，結果顯示干擾組Survivin mRNA及蛋白表達水平明顯降低，表明Survivin基因表達成功被沉默；繪制了786-O細胞增殖曲線，3組786-O細胞增殖活力均呈升高趨勢，干擾組786-O細胞的增殖活力均明顯低于對照組和空白組，其組間、時點間、組間·時點間交互作用差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示干擾Survivin基因可以抑制腫瘤細胞的惡性增殖。

PCNA分子是由261個氨基酸組成的核內蛋白質分子，參與DNA多聚酶的活性作用，近年來被廣泛用于惡性腫瘤及某些良性增生性疾病的研究中[12]。在細胞分裂靜止期(G0)表達量較低，在S期表達為高峰，在G2/M期明顯降低，參與調控細胞周期與凋亡等細胞功能，與腫瘤細胞的惡性增殖、進展密切相關，增殖細胞核抗原PCNA僅在增殖狀態(tài)的細胞內出現(xiàn)，提示DNA復制程度增加，是存在于細胞核內的反映細胞增殖狀態(tài)的核蛋白之一。在腫瘤細胞中，Survivin基因高表達可以促進細胞由G1期向S期轉換，在G2/M期可見Survivin表達明顯升高[13]。據(jù)此推測Survivin基因可能通過調控PCNA蛋白表達或與PCNA蛋白協(xié)同參與了腎癌細胞的增殖過程。國內學者李書燕等[12]發(fā)現(xiàn)，Survivin和PCNA在子宮內膜異位癥患者的組織中表達明顯增高。推測在子宮內膜異位生長過程中Survivin保護內膜細胞不會凋亡，而PCNA保持內膜細胞的增殖能力，在一定程度上顯示了Survivin和PCNA對細胞增殖的協(xié)同促進作用。本研究結果顯示干擾組786-O細胞中PCNA蛋白表達水平明顯降低，表明干擾Survivin基因表達可以引起PCNA蛋白表達量下降；這與MTS實驗結果相印證，也顯示了Survivin基因影響腎癌細胞增殖的潛在分子機制。

Survivin基因在人體正常分化的組織中不表達或低表達，在腫瘤細胞中高表達的顯著差異，提示Survivin既有助于判斷腫瘤預后，還可作為腫瘤靶向治療的理想靶點。靶向Survivin的基因治療或免疫治療能夠準確定位于腫瘤組織，有效破壞腫瘤細胞的某些功能活動，而不會對人體正常細胞造成損傷[6]。因此，針對Survivin基因的分子機制研究和靶向治療策略已經(jīng)成為腫瘤防治的焦點領域。Seo等[14]將Survivin啟動子基因與AD5/AD35嵌合型病毒基因相融合，通過病毒不斷復制，可以特異性破壞高表達Survivin基因的膀胱癌細胞，并在小鼠模型上進行了驗證，該方法不良反應小，對膀胱癌有高效殺傷作用。Xia等[15]在對人類肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，應用Survivin的小分子抑制劑YM155可以下調Survivin基因轉錄水平，造成DNA損傷，激活Caspase-3，表現(xiàn)出抑制細胞增殖與凋亡等抗腫瘤作用。還有學者發(fā)現(xiàn)Survivin分子是子宮內膜癌患者獨立的預后預測因子，并確認了YM155對子宮內膜癌細胞系的抗增殖和促凋亡作用[16]。此外，在胃癌移植瘤模型中，應用Survivin顯性負性突變體C84A，可以抑制胃癌瘤體生長，并可增強5氟尿嘧啶對胃癌細胞的化療效果[17]。表明下調Survivin表達能阻抑腫瘤的發(fā)生、惡性發(fā)展，Survivin作為腫瘤抗原基因具有應用于腫瘤基因治療的巨大潛力。

目前，在針對Survivin分子的免疫治療中，Survivin蛋白作為腫瘤相關抗原，可以在動物體內利用其免疫原性誘導產(chǎn)生抗Survivin的免疫應答。國外學者已經(jīng)嘗試在臨床Ⅰ/Ⅱ試驗中應用Survivin多肽分子進行免疫接種，增加腫瘤患者體內CD8+T細胞對癌細胞的特異性免疫反應，但機體不良反應很?。欢鳶urvivin多肽疫苗也已經(jīng)處于Ⅱ期臨床試驗中，該疫苗可以在難治性黑色素瘤患者中誘導抗Survivin的T細胞數(shù)量增加，顯著降低了復發(fā)率，提高了腫瘤患者的總生存率[18]。提示了Survivin分子作為腫瘤相關抗原應用于腫瘤基因免疫治療中的巨大潛力。

本研究通過RNA干擾技術構建Survivin基因沉默表達的腎癌786-O細胞，檢測到增殖細胞核抗原PCNA蛋白表達出現(xiàn)下調，而且細胞增殖活力明顯降低，為將Survivin開發(fā)為基因治療靶分子的應用研究提供了初步的實驗依據(jù)。后續(xù)工作尚需要深入研究Survivin基因影響腎癌細胞惡性增殖的分子通路并通過動物模型加以驗證，為將Survivin開發(fā)成國內臨床可用的基因治療標靶提供實驗依據(jù)。

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Proliferationofhumanrenalcancer786-Ocellswasdown-regulatedbyRNAinteferenceagainstsurvivingeneexpression

XU Zhi-li，ZHANG Li-hong，ZHANG Yi，LIANG Chang-chun，MA Zhi-qiang

(DepartmentofUrology,theThirdHospitalofShijiazhuangCity,HebeiProvince，Shijiazhuang050011,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Survivin gene expression on human renal carcinoma cell 786-O proliferation.MethodsRNA inteference was used to transfect human renal cancer cell line 786-O and silence Survivin gene expression. Expression of Survivin mRNA and protein were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) and Western blot assay, respectively. Change of PCNA protein expression was measured meanwhile. The proliferation of 786-O cells was evaluated by MTS assay.ResultsCompared to control siRNA/786-O and non-siRNA/786-O, Survivin siRNA/786-O displayed reduced Survivin expression of mRNA and protein(P<0.05). Expression level of PCNA protein was also down-regulated significantly in Survivin siRNA/786-O cells(P<0.05). No significant differences of Survivin mRNA, Survivin protein and PCNA protein were found between control siRNA/786-O and non-siRNA/786-O(P>0.05). Proliferation activity of all three groups of 786-O cells showed increasing trend obviously. The level of siRNA/786-O cells proliferation was significantly lower than other groups. There were statistically significant differences between groups, at different time point, also analysis of interaction between groups with time point revealed statistical significance(P<0.05).ConclusionRNA interference of Survivin gene can down-regulate expression of Survivin mRNA, Survivin protein and PCNA protein expression with decreasing the proliferation activity of cells. The present study revealed underlying influence of Survivin gene expression on malignant proliferation of renal cancer.

kidney neoplasms； RNA interference； cell proliferation

2017-08-08；

2017-09-11

石家莊市科學技術研究與發(fā)展指導計劃(131462333)

徐芝立(1980-)，男，河北深州人，河北省石家莊市第三醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事泌尿外科疾病診治研究。

R737.11

A

1007-3205(2017)11-1283-05

(本文編輯：趙麗潔)