人臍帶Wharton’s Jelly來源間充質(zhì)干細胞與人牙周膜干細胞成骨分化能力的對比研究

黃銀莉 周洪 蘇曉霞 鐘天宇

人臍帶Wharton’s Jelly來源間充質(zhì)干細胞與人牙周膜干細胞成骨分化能力的對比研究

黃銀莉 周洪 蘇曉霞 鐘天宇

目的比較人臍帶Wharton’s Jelly來源間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord Wharton’s Jelly-derived mesechymal stem cells, hUCWJMSCs)與人牙周膜干細胞(periodontal mesenchymal stem cells,hPDLSCs)成骨分化能力。方法體外培養(yǎng)hUCWJMSCs和hPDLSCs。MTT法檢測細胞增殖情況；成骨誘導后測定細胞的ALP活性，茜素紅染色檢測細胞礦化能力，Real-time PCR分析OPN和Runx2基因的表達。結果hUCWJMSCs增殖能力高于hPDLSCs； 經(jīng)礦化誘導后hPDLSCs ALP表達、礦化結節(jié)形成高于hUCWJMSCs(P<0.05)；Runx2在hPDLSCs中表達高于hUCWJMSCs(P<0.05)；而hUCWJMSCs中OPN表達高于hPDLSCs(P<0.05)。結論hUCWJMSCs、hPDLSCs均具有成骨分化能力，hPDLSCs成骨分化能力較強。

人臍帶Wharton’s Jelly間充質(zhì)干細胞(hUCWJMSCs)； 人牙周膜干細胞(hPDLSCs)； 成骨分化

口腔頜面部骨組織工程技術中種子細胞的選擇一直是研究的重點[1-2]。牙周膜干細胞多用于牙周骨組織缺損的研究，但因其來源受限、細胞產(chǎn)量較低、存在混雜細胞等缺點，故尋找新的替代種子細胞成為研究重點。人臍帶Wharton’s Jelly來源間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord Wharton’s Jelly-derived mesechymal stem cells,hUCWJMSCs)在細胞增殖、多向分化、免疫特性以及旁分泌等方面更具優(yōu)勢，引起廣泛關注[3]；其成骨能力已被證實并應用于骨組織工程，被認為是一種新的骨組織種子細胞[4-5]。本實驗通過體外研究，比較hUCWJMSCs與人牙周膜干細胞(periodontal mesenchymal stem cells,hPDLSCs)成骨分化能力，探討hUCWJMSCs應用于牙周骨組織工程的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶(Gibco公司,美國)，地塞米松、茜素紅、β-甘油磷酸鈉、L-抗壞血酸2-磷酸鹽(Sigma公司，美國)，總RNA提取試劑盒(Invitrogen公司，美國)，引物合成、PCR試劑盒、cDNA合成試劑盒(Takara公司，日本)，ALP半定量試劑盒(南京建成生物技術公司)，倒置相差顯微鏡(Nikon,日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 MTT法檢測 hUCWJMSCs、hPDLSCs增殖能力

臍帶來源：健康足月產(chǎn)婦中獲得新鮮臍帶，實驗獲得西安交通大學口腔醫(yī)院倫理委員會批準，患者對其用途均知情同意。

取生長狀態(tài)良好的P3代細胞，調(diào)整細胞濃度至5×104/ml，接種到96 孔板，每孔100 μl，MTT法連續(xù)8 d檢測2 種細胞增殖情況，每個時間點做3 個復孔，繪制增殖曲線。

1.2.2 hUCWJMSCs和hPDLSCs體外成骨分化能力比較

1.2.2.1 成骨誘導后ALP表達的比較 取P3代hUCWJMSCs、hPDLSCs干細胞，以2×104/孔接種于24 孔板中，待細胞生長達到 70%～80%融合時進行成骨誘導，成骨誘導液為：DMDM/F12培養(yǎng)基，100 U/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素，0.25 μg/ml兩性霉素B、終濃度10%FBS，10 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油及50 μmol/L的L-抗壞血酸-2-磷酸。3 d換1 次培養(yǎng)液；用普通培養(yǎng)基同時培養(yǎng)細胞，其它培養(yǎng)條件與成骨分化組相同，做為陰性對照。

分別在誘導0、1、3、5、7、14、21 d收集實驗組和對照組上清液進行堿性磷酸酶半定量檢測。檢測步驟按堿性磷酸酶半定量試劑盒進行。

1.2.2.2 成骨誘導后茜素紅染色及礦化結節(jié)半定量比較 取P3代hUCWJMSCs、hPDLSCs干細胞，以5×104細胞/孔的細胞密度接種于6 孔中，在37 ℃，5%CO2恒定濕度培養(yǎng)，待細胞密度達60%以上融合時進行成骨誘導。成骨誘導14、21 d后進行茜素紅染色、拍照。每孔加入1 ml 10%氯化十六烷基置室溫下30 min，吹打是鈣化結節(jié)完全溶解，吸取上清液300 μl，562 nm紫外分光光度計測量A值。分別在14、21 d以普通培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞作為陰性對照，每個時間點做3 個復孔。收集數(shù)據(jù)并做統(tǒng)計學分析。

1.2.2.3 Real-time PCR比較成骨基因表達 取P3代hUCWJMSCs、hPDLSCs干細胞，以5×104細胞/孔的密度接種于6 孔中，成骨誘導0、3、7、14、21 d，以普通培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞作為陰性對照，每個時間點做3 次。Trizol提取總RNA,按反轉錄試劑盒說明書合成cDNA(表 1)。

表 1 PCR引物

1.3 兩步法進行進行Real-time PCR反應

預變性95 ℃ 30 s，PCR反應95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40 個循環(huán)。反應結束后對結果曲線進行確認并繪制標準曲線。

2 結 果

2.1 hUCWJMSCs、hPDLSCs增殖能力

MTT法繪制hUCWJMSCs和hPDLSCs的增殖曲線，顯示:前兩天細胞處于潛伏期，3～6 d處于對數(shù)生長期，7 d細胞數(shù)達到最高值進入平臺期。hUCWJMSCs進入對數(shù)期時間早于hPDLSCs且增殖速度較快(圖 1)。

2.2 hUCWJMSCs和hPDLSCs體外成骨分化能力比較

2.2.1 ALP半定量檢測 通過對hUCWJMSCs、hPDLSCs成骨誘導前、誘導1 、3、5 、7 、14、21 d進行ALP半定量檢測。結果表明hUCWJMSCs、hPDLSCs成骨誘導組相對于對照組均高表達；同時hPDLSCs成骨誘導后ALP分泌明顯高于hUCWJMSCs且具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖 2)。

2.2.2 茜素紅染色及礦化結節(jié)半定量檢測 分別對hUCWJMSCs和hPDLSCs成骨誘導14、21 d后進行茜素紅染色，結果顯示，2 種細胞成骨誘導14 d后有紅色被染礦化基質(zhì)形成，21 d后陽性被染顆粒明顯增多，而對照組則無明顯紅色被染顆粒形成。同時可見hPDLSCs組21 d后茜素紅染色礦化結節(jié)形成明顯多于hUCWJMSCs(圖 3)。礦化結節(jié)半定量比較也得出相似的結論(圖 4)。

圖 1 hUCWJMSCs和hPDLSCs的增殖曲線 圖 2 各組細胞ALP表達水平

Fig 1 Growth curves of hUCWJMSC and hPDLSCs Fig 2 ALP expression of the cells

圖 3 茜素紅染色結果(-129 μm)

Fig 3 Alizarin red staining results(-129 μm)

圖 4 各組細胞礦化水平比較 圖 5 Runx2和OPN mRNA在細胞中的表達

Fig 4 Comparison of the minerialization level of the cells Fig 5 mRNA expression of Runx2 and OPN in the cells

2.2.3 成骨誘導后Real-time PCR比較成骨基因表達

提取RNA后進行純度及含量測定，結果顯示各組A260/A280比值均1.8,提示無蛋白質(zhì)污染，RNA純度可滿足實驗要求。hUCWJMSCs和hPDLSCs進行成骨誘導后分別于3、7、14、21 d后采用Real-time PCR檢測相關成骨基因OPN和Runx2的表達，結果表明成骨誘導后，此2 種基因均有表達。其中Runx2在hPDLSCs中表達高于hUCWJMSCs(P<0.05)；而OPN在hUCWJMSCs成骨誘導組高于hPDLSCs(P<0.05，圖 5)。

3 討 論

近幾年，關于hUCWJMSCs應用于牙周組織修復的研究引起了口腔醫(yī)生的高度關注。付云等[6]利用跨室培養(yǎng)裝置研究hUCWJMSCs定向分化為hPDLSCs的可能性，研究表明，在一定條件下可定向分化為hPDLSCs；將hUCWJMSCs用于自體牙移植后牙周修復的研究，結果顯示在牙本質(zhì)表面形成被纖維樣組織包繞的牙骨質(zhì)樣結構，提示hUCWJMSCs可用于自體牙移植后牙周組織的愈合[7]。大量的實驗結果提示hUCWJMSCs可作為牙周再生的種子細胞進行更深入的研究。

hUCWJMSCs和hPDLSCs的成骨分化能力分別被諸多實驗證明[8-9]，同時也分別比較與其他成體干細胞成骨分化能力。Wen等[10]比較了hUCWJMSCs與骨髓干細胞(hBMSCs)、脂肪干細胞(hAD-MSCs)成骨分化能力，hBMSCs較hUCWJMSCs、hAD-MSCs表達更多的ALP陽性被染顆粒，hUCWJMSCs、hAD-MSCs較hBMSCs表達更多的COL-1和Runx2，hUCWJMSCs高表達OPN且有骨結構形成，說明hUCWJMSCs可作為骨組織缺損修復的種子細胞。研究表明，在炎癥狀況下hBMSCs骨形成能力明顯高于hPDLSCs，說明hPDLSCs免疫調(diào)節(jié)能力較弱[11]。但是關于hUCWJMSCs和hPDLSCs兩種干細胞成骨分化能力的研究尚缺乏。

本實驗結果顯示hUCWJMSCs較hPDLSCs增殖能力更強，擴增用時更短，結果與其他學者研究相似[12]，hUCWJMSCs細胞倍增的時間為22.23 h，hPDLSCs為27.51 h；其與牙髓干細胞增殖能力較hBMSCs與hAD-MSCs高[13]。本實驗通過體外對2 種干細胞進行成骨誘導，檢測成骨分化過程中與成骨相關的特異性蛋白和胞外基質(zhì)，比較2 種干細胞成骨分化能力。hPDLSCs表達ALP明顯高于hUCWJMSC，且較hUCWJMSCs形成的礦化結節(jié)量更多，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Runx2是轉錄因子家族Runx中重要的一員，成骨細胞的增殖和分化有密切的聯(lián)系，是成骨分化過程的早期基因[14]。本實驗Runx2表達誘導隨時間的增加，表達呈現(xiàn)遞增趨勢，最高峰為7 d，后呈現(xiàn)遞減趨勢。Hsieh等[15]通過對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導，檢測Runx2表達變化，得出了相似的結果。同時，hPDLSCs較hUCWJMSCs組Runx2要高表達，說明在相同的條件下hPDLSCs早期表達更多的Runx2以參與干細胞成骨分化過程。Ciavarella等[16]研究表明Runx2可通過促進成骨特異性基因如骨鈣蛋白(Osteocalcin,OCN)、骨橋蛋白( Osteopontin，OPN)以及其他骨涎蛋白(bone Sialoproteins)的表達，同時也表達于牙周韌帶纖維細胞中，故其除參與細胞成骨分化過程外也存在于牙周組織中，故進一步解釋了hPDLSCs表達高于hUCWJMSCs的原因。OPN是一種成骨細胞在鈣三醇的刺激下表達的成骨相關基因，對骨的重塑、細胞遷移、腫瘤轉移以及免疫調(diào)節(jié)都具有多方面的作用[17]。本實驗中hUCWJMSCs較hPDLSCs高表達，說明在相同的條件下hUCWJMSCs表達更多的OPN以參與干細胞生理作用。OPN對干細胞的影響是多方面的，在干細胞成骨分化過程中發(fā)揮著重要的作用，關于其調(diào)節(jié)成骨分化的機制尚不是很清楚，需要進一步研究[18]。

關于兩者成骨分化能力差異的原因，可能是hUCWJMSCs來源為胚胎干細胞，其表達更多較為原始的基因。相關研究顯示hPDLSCs較hUCWJMSCs擁有更多的促進成骨細胞分化和骨形成且可抑制破骨細胞形成的基因如SATB1、SATB2和TNFRSF11B[19-20]，hUCWJMSCs則擁有更多與胚胎發(fā)育相關基因和促進細胞增殖的基因，如HOXC8其在促進細胞增殖的同時可抑制細胞的沉骨分化[21]，故hUCWJMSCs較hPDLSCs有更強的增殖能力，而成骨能力卻沒有明顯優(yōu)勢。

綜上，本實驗通過化學誘導方法對hUCWJMSCs和hPDLSCs 2 種干細胞進行誘導，并通過ALP、茜素紅染色和半定量以及成骨相關表達基因OPN和Runx2的檢測，比較2 種細胞成骨分化能力。研究結果顯示hUCWJMSCs和hPDLSCs都具有明顯的成骨分化能力，但未修飾的hUCWJMSCs不能直接用于牙周骨組織修復，需進行相關成骨基因的修飾后方可應用。

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TheosteogenesisabilityofhumanumbilicalcordWharton’sJelly-derivedmesenchymalstemcellsandperiodontalmesenchymalstemcells

HUANGYinli,ZHOUHong,SUXiaoxia,ZHONGTianyu.

710004,DepartmentofOrthodontics,StomatologicalHospitalofXi'anJiaotongUniversity,China

Objective： To compare the osteogenesis ability between human umbilical cord Wharton’s Jelly-derived mesenchymal stem cells(hUCWJMSCs) and human periodontal ligament mesenchymal stem cells(hPDLSCs)invitro.MethodshUCWJMSCs and hPDLSCs wereinvitrocultured. The cell proliferation capacity was examined by MTT assay. After osteogenesis induction culture, ALP activity of the cells was determined, minerialization was observed by alizarin red staining, OPN and Runx2 mRNA expression was analyzed by Real-time PCR.ResultshUCWJMSCs grew faster than hPDLSCs. After osteogenic differentiation induction, hPDLSCs group showed higher ALP level, more mineralized nodule formation and higher Runx2 expression compared with hUCWJMSCs group(P<0.05); while the OPN expressed higher in hUCWJMSCs than in hPDLSCs(P<0.05).ConclusionhUCWJMSCs and hPDLSCs have osteogenesis differentiation potential, hPDLSCs are more osteogenetic.

HumanumbilicalcordWharton’sJelly-derivedmesenchymalstemcells(hUCWJMSCs);Humanperiodontalligamentmesenchymalstemcells(hPDLSCs);Osteogenicdifferentiation

陜西省“13115”科技創(chuàng)新工程重大科技專項計劃項目(編號： 2008ZDKG-65)

710004， 西安交通大學口腔醫(yī)學院正畸科

周洪 029-87281409 E-mail： zhouhong@mail.xjtu.edu.cn

R329.2

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.021

(收稿： 2017-03-30 修回： 2017-04-26)