口腔鱗癌患者與健康人唾液差異蛋白組學(xué)的初步研究

孫昆俊 馬洪 康穎倩 鄒賢玉

口腔鱗癌患者與健康人唾液差異蛋白組學(xué)的初步研究

孫昆俊 馬洪 康穎倩 鄒賢玉

目的研究口腔鱗癌患者與健康人唾液蛋白差異表達(dá)情況。方法收集口腔鱗癌患者唾液17 例，健康人唾液17 例，通過以雙向凝膠電泳技術(shù)以及質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析，尋找在口腔鱗癌患者唾液中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。結(jié)果選取口腔鱗癌患者和正常人唾液中具有明顯差異表達(dá)的10 個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析，共鑒定出3 種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，其分別為 S100A8、S100A8/ S100A9及表皮角蛋白2(EK2)在口腔鱗癌患者唾液中均呈高表達(dá)。結(jié)論S100A8、S100A8/ S100A9及EK2可能與口腔鱗癌患者發(fā)生有關(guān)。

唾液； 口腔鱗癌； 蛋白質(zhì)組學(xué)； 雙向電泳(2-DE)； 腫瘤標(biāo)志物

長期以來，尋找早期診斷的惡性腫瘤標(biāo)志物(tumor marker，TM)已成為了人們關(guān)注的焦點(diǎn)[1]。惡性腫瘤是一種涉及多種分子事件的疾病，其生長過程中由于基因突變、異常轉(zhuǎn)錄、和翻譯，必然會(huì)導(dǎo)致不同程度的蛋白質(zhì)表達(dá)和修飾異常，而蛋白質(zhì)組學(xué)的興起則為了解腫瘤蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，從而揭示生物學(xué)行為以及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了一個(gè)新的研究領(lǐng)域，并且目前發(fā)掘腫瘤標(biāo)志物的強(qiáng)力工具正是蛋白組學(xué)方法和技術(shù)[2]。其還具備分析不同蛋白質(zhì)組之間蛋白質(zhì)在表達(dá)數(shù)量、表達(dá)水平和修飾狀態(tài)上的差異，研究差異蛋白質(zhì)及其功能[3]。

本研究采用雙向凝膠電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)技術(shù)分離口腔鱗癌患者和健康人的唾液蛋白，比較口腔鱗癌患者和健康人差異表達(dá)明顯的蛋白點(diǎn)，再應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry-time of flight,MALDI-TOF/MS)以及生物信息學(xué)分析，尋找在口腔鱗癌患者唾液中特異蛋白質(zhì)的變化，鑒定出這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)種類和性質(zhì)，以期發(fā)現(xiàn)在口腔鱗癌的早期診斷和治療上存在潛在的價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物，并為口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究標(biāo)本 標(biāo)本來源于貴陽醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院口腔頜面外科，未采用任何針對(duì)腫瘤的治療如手術(shù)、放療、化療等，且經(jīng)病理證實(shí)口腔鱗癌患者唾液17 例，健康人唾液17 例。口腔鱗癌唾液標(biāo)本來源情況：男性14 例，女性3 例，年齡范圍55～68 歲，平均年齡55.8 歲。 其中高分化鱗癌10 例，中分化鱗癌6 例，低分化鱗癌1 例。健康人唾液標(biāo)本來源情況：貴陽醫(yī)學(xué)院2010 級(jí)口腔頜面外科研究生及患者家屬，體檢均健康，既往無腫瘤史。

1.1.2 主要試劑 IPG Buffer和IPG膠條(13 cm，線性，pH 3～10)(GE Healthcare公司，美國)；廣譜蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail Set I 10VL,AppliChem公司，德國)和BCA定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit 500 assa,北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；2D-clean up試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech公司，美國)；考馬斯G-250染料(Sigma公司，德國)等。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 紫外-可見光分光光度計(jì)(UV-1700PC型，上海奧析科學(xué)儀器有限公司)，超低溫冷凍離心機(jī)(Fresco 21型，Thermo Scientific公司，美國)；Image Scanner掃描儀、Ettan IPGphorⅡ等電聚焦儀、EPS601垂直電泳儀、Image Master 2D Platinum 6.0圖像分析軟件(Amersham Biosciences公司，美國)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本處理 所有研究標(biāo)本采集均為清晨空腹漱口后15 min，并且口腔鱗癌患者唾液在術(shù)前采集，收集量一般為4～5 ml，經(jīng)4 000 r/min離心5 min后置于-80 ℃保存。

1.2.2 蛋白質(zhì)樣本制備 取-80 ℃保存的患者唾液和正常對(duì)照唾液，室溫溶解后按丙酮沉淀法提取離心管底部白色綿絮狀物質(zhì)，再按照2-D Clean up Kit試劑盒說明書操作進(jìn)行蛋白純化及去除高峰度蛋白。

按照Bradford[4]法測定蛋白濃度。

雙向凝膠電泳(2-DE)分離蛋白。雙向凝膠電泳(2-DE)所用儀器：Ettan IPGphorⅡ等電聚焦儀、Electrophoresis Power Supply-EPS601垂直電泳儀、Image Master 2D Platinum 6.0圖像分析軟件(Amersham Biosciences公司，美國)。

1.3 凝膠圖像分析

染色后凝膠由Image Scaner采集圖像，運(yùn)用Image Master 2D Platinum 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，按照Corbett[5]方法篩選差異蛋白斑點(diǎn)。

MALDI-TOF/MS(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院蛋白質(zhì)組研究分析中心)質(zhì)譜分析及數(shù)據(jù)檢索。

2 結(jié) 果

2.1 雙向電泳結(jié)果

選取在鱗癌患者和健康人唾液中差異表達(dá)明顯的10 個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果如圖 1所示(均為考馬斯亮藍(lán)R250染色)。

圖 1 唾液蛋白2-DE圖譜

2.2 候選蛋白的MALDI-TOF/MS質(zhì)譜分析聯(lián)合數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果

10 個(gè)蛋白標(biāo)本經(jīng)過質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫檢索后，得分均超過50 分。10 個(gè)差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果見表 1。

3號(hào)樣品經(jīng)過氨基酸覆蓋率及經(jīng)過二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)鑒定為鈣結(jié)合蛋白(Calprotectin)，綜合得分為332;6號(hào)樣品鑒定為鈣結(jié)合蛋白同型蛋白(Calprotectin)，綜合得分為410；8號(hào)樣品經(jīng)過氨基酸覆蓋率及經(jīng)過二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)鑒定為表皮角蛋白2( Epidermal cytokeratin 2)，綜合得分為153。

3 討 論

口腔腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究一方面建立口腔腫瘤的全蛋白表達(dá)譜，可以用于腫瘤的分離鑒定；另一方面研究腫瘤與正常細(xì)胞的差異表達(dá)，篩選出各種病損的特異蛋白，構(gòu)建腫瘤發(fā)生發(fā)展的蛋白組譜和分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)與評(píng)估組織、血清、唾液中的特異蛋白作為生物標(biāo)記，國外已有學(xué)者運(yùn)用于頭頸鱗癌臨床無創(chuàng)傷早期診斷、分級(jí)和預(yù)后的初步研究[6-7]。但由于口腔鱗癌患者的唾液蛋白研究缺乏理想的模式，近幾年來對(duì)于唾液蛋白在口腔鱗癌的發(fā)病機(jī)制的研究尚未獲得突破性的進(jìn)展，因此尋求更為前沿的技術(shù)，在客觀上利于對(duì)口腔鱗癌的病因?qū)W機(jī)理、診斷及預(yù)后評(píng)估等進(jìn)行研究。因此，通過蛋白組學(xué)鑒定口腔鱗癌患者與健康人唾液中蛋白的方法在篩選不同侵襲能力細(xì)胞系之間差異蛋白質(zhì)方面具有應(yīng)用價(jià)值[8-9]。

表 1 10 個(gè)差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫查詢結(jié)果

注： ↑: 與健康人相比蛋白表達(dá)量升高，↓: 表達(dá)降低

本實(shí)驗(yàn)初步鑒定出在口腔鱗癌患者唾液中呈高表達(dá)的3 個(gè)蛋白點(diǎn)(3、6、8號(hào))分別是S100A8/ S100A9、S100A8、表皮角蛋白2。類似工作國內(nèi)尚未見有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

S100A8/S100A9和S100A8在S100蛋白家族中又分別被稱為MRP8、MRP14，由于骨髓和上皮細(xì)胞中的S100A8和S100A9能通過腫瘤分泌的可溶性因子VEGF-A、腫瘤生長因子b(tumor growth factor b，TGFb)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)被誘導(dǎo)表達(dá)， 因此其被認(rèn)為是與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展最緊密相關(guān)的因子[10]。兩者均可作為中性粒細(xì)胞強(qiáng)有力的誘導(dǎo)劑起到化學(xué)趨化性和黏附性作用，并且除了在炎癥反應(yīng)過程中展現(xiàn)關(guān)鍵作用外，還具備抑制生長、促使細(xì)胞凋亡的功能，包括促使腫瘤細(xì)胞的凋亡[11]。因此，S100A8、S100A9蛋白在急、慢性炎癥反應(yīng)中存在差異表達(dá)，可作為中性粒細(xì)胞抗腫瘤的效應(yīng)器分子中的一員。并且S100A8及S100A8/A9在細(xì)胞外不僅參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)也作為機(jī)體內(nèi)多種生物學(xué)功能的調(diào)和劑之一，對(duì)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)變化產(chǎn)生影響[12]。本課題組[13]前期通過研究口腔鱗癌患者和健康人的組織蛋白差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)口腔鱗癌組織中S100A8和S100A9顯著表達(dá)，健康人組織中無表達(dá)。Hu等[14]也通過2-DE和LC-MS/MS技術(shù)，鑒定出口腔鱗癌患者唾液中S100A9蛋白過表達(dá)，而正常人唾液中未發(fā)現(xiàn)S100A9表達(dá)。

表皮角蛋白2(epidermal cytokeratin 2,EK2)是由一類后期表皮細(xì)胞骨架蛋白在后期分化過程中合成的II型細(xì)胞角蛋白，主要存在于鱗狀上皮、肌上皮、外分泌腺導(dǎo)管上皮等細(xì)胞中，而在腫瘤組織中呈特異表達(dá)，并隨分化程度、細(xì)胞生長環(huán)境或病理的改變而發(fā)生變化。然而表皮角蛋白除了具備相應(yīng)的生理功能外，還參與了細(xì)胞增殖調(diào)控、細(xì)胞特異性的細(xì)胞器運(yùn)輸、惡性轉(zhuǎn)化及各種應(yīng)激反應(yīng)，而且其參與惡性轉(zhuǎn)化的能力已有相關(guān)研究指出，惡變的鱗狀上皮具有大分子角蛋白(Ⅰ型)含量減少、小分子角蛋白(Ⅱ型)增多及小分子與大分子角蛋白共存2 大特征。后期國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[15]通過2-DE和MALDI-TOF/MS技術(shù)，比較頭頸部癌患者血清與正常人血清差異蛋白表達(dá)時(shí)，其中篩選出EK2在病理血清中呈上調(diào)表達(dá)。由此證明癌細(xì)胞的分化與功能都會(huì)影響到EK 的表達(dá)，以此來推測癌細(xì)胞的功能狀態(tài)是可能的。

本實(shí)驗(yàn)采用雙向凝膠電泳技術(shù)結(jié)合MALDI-TOF/MS質(zhì)譜鑒定技術(shù)先后對(duì)口腔鱗癌唾液凝膠差異表達(dá)明顯的10個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果提示S100A8/ S100A9、S100A8及EK2在口腔鱗癌患者唾液中均呈高表達(dá)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

(致謝: 本研究中MALDI-TOF/MS質(zhì)譜分析由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院蛋白質(zhì)組研究分析中心完成)

[1] 吳健民. 對(duì)腫瘤標(biāo)志物的再認(rèn)識(shí)[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 28(1): 11-13.

[2] 徐曉恩, 姜英華, 施前. 腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué):過去、現(xiàn)在和將來[J]. 癌癥, 2008, 27(10): 1009-1017.

[3] 鐘來平， 鄭家偉， 張志愿. 比較蛋白質(zhì)組學(xué)在口腔鱗癌中的研究進(jìn)展[J]. 上?？谇会t(yī)學(xué), 2008, 17(3): 317-321.

[4] 顏?zhàn)臃f, 汪海林(譯). 精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南[M]. 北京科學(xué)出版社, 1998： 332.

[5] Corbett JM, Dunn MJ, Posch A, et al. Positional reproducibility of protein spots in two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis using immobilised pH gradient isoelectric focusing in the first dimension: An interlaboratory comparison[J]. Electrophoresis, 1994, 15(8-9): 1205-1211.

[6] Al-Tarawneh SK, Border MB, Dibble CF, et al. Defining salivary biomarkers using mass spectrometry-based proteomics: A systematic review[J]． OMICS, 2011, 15(6): 353-361.

[7] Schaaij-Visser TB, Graveland AP, Gauci S, et al. Differential proteomics identifies protein biomarkers that predict local relapse of head and neck squamous cell carcinomas[J]. Clin Cancer Res, 2009, 15(24): 7666-7675.

[8] Cheng AJ, Chen LC, Chien KY, et al. Oral cancer plasma tumor marker identified with bead-based affinity-fractionated proteomic technology[J]. Clin Chem, 2005, 51(12): 2236-2244．

[9] Warnakulasuriya S, Soussi T, Maher R, et al. Expression of p53 in oral squamous cell carcinoma is associated with the presence of IgG and IgA p53 autoantibodies in sera and saliva of the patients[J]. J Pathol, 2000, 192(1): 52-57.

[10]Wu F, Chakravarti S. Differential expression of inflammatory and fibrogenic genes and their regulation by NF-{kappa}B inhibition in a mouse model of chronic colitis[J]. J Immunol, 2007, 179(10): 6988-7000.

[11]石琳, 喬曉娟, 李云霞. 鈣結(jié)合蛋白S100家族成員與腫瘤的關(guān)系[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2013, 21(11): 2625-2628.

[12]Gebhardt C, Breitenbach U, Tuckermann JP, et al. Calgranulins S100A8 and S100A9 are negatively regulated by glucocorticoids in a c-Fos-dependent manner and overexpressed throughout skin carcinogenesis[J]. Oncogene, 2002, 21(27): 4266-4276.

[13]邱樂宏, 馬洪. 口腔鱗癌組織蛋白差異表達(dá)的蛋白組學(xué)測定[J]. 口腔醫(yī)學(xué), 2011, 31(8): 453-455.

[14]馬洪, 王金生, 潘衛(wèi), 等. 比較蛋白組學(xué)在口腔鱗癌患者及健康人血清的初步研究[J]. 實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 28(1): 98-101.

[15]Hu S, Arellano M, Boontheung P, et al. Salivary proteomics for oral cancer biomarker discovery[J]. Clin Cancer Res, 2008, 14(19): 6246-6252.

[16]Gourin CG, Zhi W, Adam BL. Proteomic identification of serum biomarkers for head and neck cancer surveillance[J]. Laryngoscope, 2009, 119(7): 1291-1302.

Aprimarystudyofthedifferentialproteomicexpressioninsalivaofhealthpeopleandthepatientswithoralsquamouscellcarcinoma

SUNKunjun,MAHong,KANGYingqian,ZOUXianyu.

1. 550004Guiyang,DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,FacultyofStomatology,GuiyangMedicalUniversity,China; 2.KeyLaboratoryofProteomicsofGuiyangMedicalUniversity,Guiyang

Objective： To study the differentially expressed proteins in saliva of health people and the patients with oral squamous cell carcinoma(OSCC).MethodsSaliva of 17 cases with OSCC and paired health subjects was collected, the proteins in the saliva were examined by two-dimensional gel electrophoresis(2-DE) separation, the proteins were examined by 2-DE separation, the saliva proteome dimensional electrophoresis profiles were obtained by MALDI-TOF/MS mass spectrometric identification, the information of the differentially expressed protein in OSCC group was studied by NCBI database bioinformatics analysis.Results10 proteins differentially expressed between the 2 groups were observed by mass spectrometry. Bioinformatics analysis showed that S100A8,S100A8/S100A9 and Epidermal cytokeratin 2(EK2) were highly expressed in the saliva of OSCC cases.ConclusionS100A8,S100A8/S100A9 and EK2 may be related to the development of OSCC．

Saliva;OralSquamouscellcarcinoma(OSCC);Proteomics;Two-dimensionalgelelectrophoresis(2-DE);Tumormarker

2007年貴州省優(yōu)秀人才省長基金[編號(hào)： 黔省專合字(2006)116號(hào)]

550004， 貴州醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科學(xué)教研室(孫昆俊 馬洪 鄒賢玉)； 貴州醫(yī)科大學(xué)蛋白組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(康穎倩)

馬洪 0851-86773514 E-mail: mahong1966@126.com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.017

(收稿： 2017-01-28 修回： 2017-03-24)