堿液浸提龍膽多糖及化學(xué)組成分析

郭增旺，遲治平，杜憶華，張麗萍，2

堿液浸提龍膽多糖及化學(xué)組成分析

郭增旺1，遲治平1，杜憶華1，*張麗萍1，2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319）

以龍膽為原料，研究龍膽多糖的浸提參數(shù)并進(jìn)行多糖組成分析。以料液比、浸提溫度、堿液濃度、浸提時(shí)間為因素，以多糖得率為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，研究堿液浸提龍膽多糖的最佳工藝參數(shù)。結(jié)果表明，各因素對龍膽多糖得率影響的主次順序?yàn)榻釡囟龋緣A液濃度＞浸提時(shí)間＞料液比，最佳參數(shù)為料液比1∶25，浸提溫度80℃，浸提時(shí)間3 h，堿液濃度0.6 moL/L，龍膽多糖得率為14.3%。通過龍膽多糖的化學(xué)組成分析可知總糖含量為85.2%，蛋白質(zhì)含量為11.6%。

多糖；堿液提?。徽辉囼?yàn)；化學(xué)成分分析

龍膽始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性寒味苦，具有清肝膽、瀉下焦郁火、濕熱的功效[1]，能護(hù)肝、健胃、降血脂、抗炎、抗甲亢、升血糖、抗氧化、抗真菌和降血壓[2-5]，可用于治療高血壓病、肝膽疾病、上呼吸道感染、結(jié)膜炎等疾病[6]。龍膽被稱為天然藥物，國際上將其收載為苦味健胃劑[7]。龍膽中化學(xué)功效成分的研究主要集中在黃酮類、生物堿類等方面，而對于龍膽多糖的研究報(bào)道很少。

研究龍膽多糖，有利于挖掘多糖的生理功能，能夠提高龍膽的藥用價(jià)值和食用價(jià)值。堿液浸提是眾多龍膽多糖提取方法中的一種，但是堿液浸提龍膽中多糖的工藝參數(shù)還尚未有人研究。因此，試驗(yàn)研究堿液提取多糖的最佳參數(shù)，并進(jìn)行成分分析，為研究龍膽多糖生物學(xué)功能和醫(yī)藥作用等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

龍膽殘?jiān)瑢?shí)驗(yàn)室用水浸提龍膽后的殘?jiān)?；NaOH顆粒，分析純，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠提供；無水乙醇，分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司提供。

RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；DR-524型電熱恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；T1000Y型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠產(chǎn)品；LD4-40型低速大容量離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司產(chǎn)品；CoolSafe 110-4型冷凍干燥機(jī)，丹麥Scanvac公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

龍膽殘?jiān)尤雺A液→恒溫?cái)嚢琛x心→清液→真空濃縮→加入酒精沉淀多糖→攪拌→靜置→酒精清洗→殘?jiān)栏伞肝觥鷥龈伞Q質(zhì)量→成分分析。

1.2.2 操作要點(diǎn)

（1）預(yù)處理。龍膽殘?jiān)糜谕斜P中，烘箱60℃下烘干，之后研磨過40或60目篩，研磨后的樣品短時(shí)間保存在-4℃或者干燥通風(fēng)處，長時(shí)間保存在-20℃下。

（2） 提取。稱取10 g原料按照一定料液比加入NaOH溶液，加熱回流攪拌一定時(shí)間。離心后收集上清液，殘?jiān)凑障嗤绦蛟偬崛?次，離心后合并2次提取得到的上清液，于40～60℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后濃縮。

（3）醇沉。加入乙醇使最終乙醇的體積分?jǐn)?shù)為80%，用玻璃棒攪拌2 min后放入4℃冰箱中靜置8～12 h。以轉(zhuǎn)速 3 200 r/min 離心 10～20 min，棄去上清液，之后沉淀加入無水乙醇充分混合攪拌10 min，離心后棄去上清液，沉淀再加入無水乙醇洗滌2次，離心后沉淀放置在鋁箔紙或者玻璃器皿上，在通風(fēng)櫥中室溫下干燥。

（4） 透析凍干。使用3 500 Da透析袋，將所得的多糖粗品進(jìn)行2 d自來水、1 d蒸餾水透析。透析后放入凍干，稱質(zhì)量計(jì)算多糖粗品得率。

1.2.3 浸提龍膽多糖的單因素試驗(yàn)

（1） 料液比對多糖得率的影響。選取料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，浸提溫度50℃，堿液濃度0.4 moL/L，浸提時(shí)間2 h，進(jìn)行多糖提取，研究料液比對多糖得率的影響。

（2）浸提溫度對多糖得率的影響。選取料液比1∶15，浸提溫度分別為40，50，60，70，80℃，堿液濃度0.4 moL/L，浸提時(shí)間2 h，進(jìn)行多糖的提取，研究浸提溫度對多糖得率的影響。

（3）堿液濃度對多糖得率的影響。選取料液比1∶15，浸提溫度50℃，堿液濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 moL/L，浸提時(shí)間2 h，進(jìn)行多糖的提取，研究堿液濃度對多糖得率的影響。

（4）浸提時(shí)間對多糖得率的影響。選取料液比1∶15，浸提溫度50℃，堿液濃度0.4 moL/L，浸提時(shí)間分別為1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h，進(jìn)行多糖的提取，研究浸提時(shí)間對多糖得率的影響。

1.2.4 浸提龍膽多糖的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇浸提溫度、浸提時(shí)間、堿液濃度和料液比進(jìn)行正交試驗(yàn)。采用四因素三水平L9（34）的正交試驗(yàn)，進(jìn)行優(yōu)化選擇。

1.2.5 多糖得率的計(jì)算

根據(jù)以下公式計(jì)算龍膽多糖得率：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對龍膽多糖得率的影響

料液比對龍膽多糖得率的影響見圖1。

圖1 料液比對龍膽多糖得率的影響

料液比為1∶10～1∶15時(shí)，龍膽多糖得率上升較快；當(dāng)料液比達(dá)到1∶20時(shí)，龍膽多糖得率上升趨緩；料液比在1∶20之后，龍膽多糖得率的增量呈下降趨勢。同時(shí)，根據(jù)對試驗(yàn)獲得的多糖粗品的觀察，料液比不能過大也不能過小。料液比過小對龍膽多糖的浸提不充分，龍膽多糖得率較低；料液比到達(dá)一定比例時(shí)，堿液對龍膽多糖的浸提已經(jīng)完全，多糖得率增加已經(jīng)不明顯。所以選取料液比為1∶15，1∶20，1∶25進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.2 浸提溫度對龍膽多糖得率的影響

浸提溫度對龍膽多糖得率的影響見圖2。

圖2 浸提溫度對龍膽多糖得率的影響

龍膽多糖得率隨著溫度的升高而升高。溫度在40～50℃時(shí)，龍膽多糖得率上升較快，此時(shí)溫度對龍膽多糖溶解和提取起主要作用；溫度上升到50～70℃時(shí)，溫度對龍膽多糖提取的影響效果變得有些遲緩，龍膽多糖得率上升速度趨緩；溫度上升到70～80℃時(shí)，溫度對龍膽多糖的浸提效果的影響變得更加遲鈍，但是仍然有提高，龍膽多糖得率上升速度最慢。龍膽多糖得率隨著溫度的上升呈現(xiàn)出增加趨勢，浸提溫度應(yīng)該盡可能高，所以取60，70，80℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.3 浸提時(shí)間對龍膽多糖得率的影響

浸提時(shí)間對龍膽多糖得率的影響見圖3。

圖3 浸提時(shí)間對龍膽多糖得率的影響

龍膽多糖得率隨著浸提時(shí)間的增加而增加。浸提時(shí)間在1.0～1.5 h時(shí)，龍膽多糖得率增加比較緩慢；浸提時(shí)間在1.5～2 h時(shí)，龍膽多糖得率增加速度變大；而浸提溫度在2～3 h時(shí)，龍膽多糖得率增加速度最為緩慢。根據(jù)對試驗(yàn)獲得的龍膽粗品觀察，浸提時(shí)間越長，顏色越淺，這說明所獲得的龍膽多糖粗品越純。浸提時(shí)間越長，龍膽多糖得率越高，因此，浸提時(shí)間應(yīng)該盡量長，所以選擇2.0，2.5，3.0 h進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.1.4 堿液濃度對龍膽多糖得率的影響

堿液濃度對龍膽多糖得率的影響見圖4。

圖4 堿液濃度對龍膽多糖得率的影響

龍膽多糖得率隨堿液濃度增加而降低，當(dāng)堿液濃度在0.2～0.4 moL/L時(shí)，龍膽多糖得率降低趨勢比較緩慢；當(dāng)堿液濃度在0.4～0.6 moL/L時(shí)，龍膽多糖得率降低趨勢較為明顯；而龍膽多糖得率在堿液濃度0.6～1.0 moL/L時(shí)降低趨勢最不明顯。根據(jù)試驗(yàn)獲得的龍膽多糖粗品，觀察可知，堿液濃度越大，對龍膽成分的破壞越大，使龍膽多糖損失也越大。如圖所示，多糖得率隨著堿液濃度整體呈下降趨勢，所以選擇的堿液濃度應(yīng)該盡可能小，分別選擇0.2，0.4，0.6 moL/L進(jìn)行正交試驗(yàn)。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，按照表1的正交試驗(yàn)因素水平表，采用L9（34）的正交試驗(yàn)，進(jìn)行優(yōu)化選擇，正交試驗(yàn)結(jié)果如表2。

試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

根據(jù)正交試驗(yàn)分析和極差分析，可以判斷出各因素對指標(biāo)影響的主次順序?yàn)榻釡囟龋緣A液濃度＞浸提時(shí)間＞料液比。故該最佳配方為A3B3C3D3，即料液比1∶25，浸提溫度80℃，浸提時(shí)間3 h，堿液濃度0.6 moL/L。之后按照此條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，進(jìn)行多糖的提取，平均得率14.3%。

表1 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

根據(jù)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定堿液浸提龍膽多糖的影響因素的主次順序?yàn)榻釡囟龋緣A液濃度＞浸提時(shí)間＞料液比，最佳工藝參數(shù)為料液比1∶25，浸提溫度80℃，浸提時(shí)間3 h，堿液濃度0.6 moL/L，所得到的龍膽多糖平均得率為14.3%。

[1]劉占文，陳長勛，金若敏，等.龍膽苦苷的保肝作用研究 [J].中草藥，2002，33（1）：47-50.

[2]D D Orhan，M Aslan，G Aktay，et al.Evaluation of hepatoprotective effect of Gentiana olivieri herbs on subacute administration and isolation of active principle[J].Life Sciences，2003 （20）：2 273-2 283.

[3]江蔚新，何文順，趙璽.龍膽多糖的降血脂作用的研究 [J].黑龍江醫(yī)藥，2008，21（4）：31-33.

[4]薛惠娟，趙偉康.龍膽草對甲亢大鼠肝勻漿類固醇△4-還原酶活性的影響 [J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1992，12 （4）：230-231.

[5]劉濤，才謙，付玉芹，等.中藥龍膽的研究進(jìn)展 [J].遼寧中醫(yī)雜志，2004，31（1）：85-86.

[6]謝觀.中國醫(yī)學(xué)大辭典第四冊 [M].北京：中國書店出版杜，1988：153-170.

[7]R Kakuda，T Iijima，Y Yaoita，et al.Triterpenoids from Gentiana scabra[J].Phytochemistry， 2002， 59 （8）：791-794.◇

Analysis of the Polysaccharide and Chemical Composition of Lye

GUO Zengwang1，CHI Zhiping1，DU Yihua1，*ZHANG Liping1，2
（1.Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319，China；2.National Engineering Research Center for Coarse Cereals，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang 163319，China）

Gentian of Gentianaceae was the dried root and rhizome of the Gentiana manshurica，Gentian，Gentiana Triflora pall or Gentiana rigescens，which was commonly used in traditional Chinese medicine because of its bitter，cold，clearing damp heat in the liver and gallbladder，purgative coke stagnated fire.In this experiment,the water extracts of Gentiana residue as the raw material，the extraction parameters and chemical composition were investigated Firstly，the solid-liquid ratio，extraction temperature，alkali concentration，leaching extraction time were studied as the factors of single factor and orthogonal test of alkali leaching optimum parameters for gentian polysaccharide.The results showed that the various factors of Gentian polysaccharide yield effect of primary and secondary order was temperature＞alkali concentration＞time＞solid-liquid ratio.The optimal parameters were solid-liquid ratio 1∶25，leaching temperature 80 ℃，extraction time 3 h，alkali concentration 0.6 moL/L.The yield of gentian polysaccharide was 14.3%.The chemical compositions of polysaccharide were 85.2%total sugar and 11.6%protein.

polysaccharide；alkali extraction；orthogonal test；chemical composition analysis

R285

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.10.043

1671-9646（2017） 10b-0050-03

2017-08-15

郭增旺（1992— ），男，碩士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。

*通訊作者：張麗萍（1957— ），女，博士，教授，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。