不同工藝蒙脫石對應激性腹瀉大鼠胃腸道的影響

徐 軍， 于長江， 孫運剛， 姜 軒， 張 傲， 李 巖

（1.天津農(nóng)學院動物科學與醫(yī)學學院，天津 300384；2.北京金海偉業(yè)有限責任公司，北京大興 102699；3.內(nèi)蒙古潤隆化工有限責任公司，內(nèi)蒙古赤峰024000）

不同工藝蒙脫石對應激性腹瀉大鼠胃腸道的影響

徐 軍1， 于長江2， 孫運剛3， 姜 軒1， 張 傲1， 李 巖1

（1.天津農(nóng)學院動物科學與醫(yī)學學院，天津 300384；2.北京金海偉業(yè)有限責任公司，北京大興 102699；3.內(nèi)蒙古潤隆化工有限責任公司，內(nèi)蒙古赤峰024000）

為研究不同工藝蒙脫石對應激性腹瀉大鼠胃腸道的影響，本試驗選擇體重200 g左右雄性SD大鼠54只，隨機分為2組，應激模型組32只，空白對照組22只。應激模型組每天灌胃番瀉葉液3 mL/只·次。連續(xù)處理4 d，制作應激模型。試驗第5天從應激模型組中隨機取2只大鼠，對照組取2只解剖，確認應激模型。然后將應激模型組大鼠隨機分為3組，分別為RT、RZ蒙脫石組和模型對照組。RT和RZ蒙脫石組每天灌胃3 mL/只·次RT型蒙脫石（鈣基800目）和RZ型蒙脫石（800目鈉化改性），每天2次，連續(xù)作用4 d。模型對照組灌胃相同劑量的無菌生理鹽水。空白對照組1、2試驗期間灌胃分別同RT和RZ型蒙脫石組。試驗第5天，測定胃內(nèi)pH，血清二氨氧化酶（DAO）、胃蛋白酶原Ⅰ（PGⅠ）、血清D-木糖（D-Xl）含量。結(jié)果表明：RT和RZ蒙脫石組血清D-木糖含量分別高于模型對照組13.9%和15.19%（P＜0.05），分別低于空白對照組16.67%和15.35%（P＜0.05）；RT和RZ蒙脫石組血清DAO含量分別低于模型對照組6.28%和5.00%（P＞0.05），分別高于空白對照組4.8%和4.15%（P＞0.05）；RT和RZ蒙脫石組小腸推進率分別低于模型對照組7.8%和8.77%（P＜0.05），分別高于其空白對照組0.67%和0.73%（P＞0.05）。RZ蒙脫石組血清D-木糖含量、血清DAO活性較RT蒙脫石組高1.11%和1.38%（P＞0.05），RT蒙脫石組小腸推進率高于RZ蒙脫石組1.05%（P＞0.05）。提示蒙脫石有修復損傷小腸黏膜細胞、調(diào)節(jié)小腸運動、提高小腸吸收的作用，而且RZ型蒙脫石效果略優(yōu)于RT型蒙脫石。與模型對照組相比，RT和RZ蒙脫石組血清PG I含量分別降低9.60%和6.51%（P＜0.05），胃內(nèi)pH分別升高4.00%和8.00%（P＜0.05）。RT和RZ蒙脫石組PG I含量分別高于各自空白對照組4.93%（P＞0.05）和10.96%（P＜0.05），RZ蒙脫石組PGⅠ含量高于RT蒙脫石組3.42%（P＞0.05）；胃內(nèi)pH，RT蒙脫石組與其空白對照組無顯著差異 （P＞0.05），RZ蒙脫石組高于其空白對照組3.85%（P＜0.05），RZ蒙脫石組高于RT蒙脫石組3.85%（P＜0.05）。提示蒙脫石有加快修復應激損傷胃黏膜，控制胃內(nèi)pH的作用，并且RZ蒙脫石效果優(yōu)于RT蒙脫石。

應激性腹瀉；蒙脫石；胃蛋白酶原；二氨氧化酶；小腸推進率

仔豬腹瀉是養(yǎng)豬生產(chǎn)的一類常見疾病，由多種原因引起，其中斷奶應激是一個很重要的誘發(fā)因素。病豬每日排便次數(shù)、糞便水分增加，或排便伴有未消化食物、膿血、黏液等現(xiàn)象。其結(jié)果嚴重影響?zhàn)B豬的經(jīng)濟效益，增加養(yǎng)殖成本 （吳猛鋼，2013；周學軍，2010；顏友榮，2008）。蒙脫石又名微晶高嶺石或膠嶺石，是一種硅鋁酸鹽。研究表明，蒙脫石的特殊結(jié)構(gòu)和不均勻帶電性使其可以吸附各種消化道致病因子，并連同致病因子隨消化道自身蠕動排出體外，而其本身卻不進入血液循環(huán)系統(tǒng)。目前蒙脫石作為一種飼料添加劑，廣泛應用在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中 （楊榮芳等，2010；王桂芳等，2009；劉美容，2008；馬玉龍和許梓榮，2006）。本試驗旨在研究不同工藝蒙脫石對應激性腹瀉模型大鼠胃腸道環(huán)境的影響以及蒙脫石的止瀉機理，為將蒙脫石更好的應用在斷奶仔豬抗腹瀉上提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 番瀉葉購于當?shù)厮幍?；D-木糖購于源葉生物科技有限公司；D-木糖試劑盒購于南京建成生物工程研究所；RT型蒙脫石 （鈣基剝片800目），RZ型蒙脫石 （800目剝片鈉化改性），由內(nèi)蒙古潤隆化工責任有限公司提供；精密pH試紙；二胺氧化酶測定試劑盒購于北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司；胃蛋白酶原I定量測定試劑盒購于天津瑞愛金生物科技有限公司。

1.2 主要儀器 酶聯(lián)免疫分析儀，型號Bio-RADiMark；離心機，型號L550；臺式低速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 試驗設計 雄性SD大鼠54只，體重200 g左右，隨機分為2組，應激模型組32只，空白對照組22只。模型制備期為4 d，第5天確定應激腹瀉模型。應激模型組剩余30只大鼠隨機分為3組，分別為RT型蒙脫石組、RZ型蒙脫石組和模型對照組，RT組和RZ組，按日采食量千分之五，分別灌胃RT型和RZ型蒙脫石，3 mL/只·次，每天兩次；模型對照組灌胃無菌生理鹽水3mL/只·次，每天2次?？瞻讓φ战M隨機分為2組，空白對照組1試驗期間灌胃同RT型蒙脫石組，空白對照組2試驗期間灌胃同RZ型蒙脫石組。繼續(xù)處理4 d后，于第5天采集試驗測定樣品。

1.4 應激性腹瀉大鼠模型制備 模型制備方法參考邱賽紅等（2012）和曹玲芝等（2008）方法。雄性大鼠44只，每天灌胃番瀉葉液3 mL/只·次（200 g番瀉葉，放入1000 mL沸水中煮沸15 min，攪拌20 min后，收集600 mL液體，約0.3 g番瀉葉每毫升），給藥后立即用醫(yī)用膠帶捆綁大鼠前肢，固定肩胛骨。連續(xù)作用4 d。大鼠精神沉郁，不喜動，排軟便、稀便，色淺，排便次數(shù)增多；第5天，分別隨機解剖2只模型組、2只空白對照組大鼠，肉眼觀察，模型組大鼠，腸道組織黏膜有出血點，盲腸體積增大，充滿稀薄內(nèi)容物，判定為應激性腹瀉模型制備成功。

1.5 試驗飼養(yǎng)管理 飼喂標準鼠糧，自由采食和飲水。室溫20℃左右。

1.6 樣品的采集與指標測定 試驗結(jié)束前1 d晚上10點后禁食不禁水，第2天，每組10只大鼠分為兩組，5只進行小腸墨汁推進試驗（史正剛和趙敏，2008；官福蘭等，2002；李娟等，2000），灌胃墨汁2 mL/只·次，15 min后處死大鼠測定小腸推進率 （小腸推進率=幽門至墨汁前沿/小腸全長）；剩余5只進行D-木糖測定試驗，先眼眶采血，制備血清，測定血清二胺氧化酶活性和胃蛋白酶原含量 （曹華等，2016；趙永華等，2014；楊勝茹，2009；張愔等，2007；黎君友等，2000）。 后灌胃 D-木糖，0.5 g每千克體重，3 mL/只·次。2 h后眼眶采血制備血清，測定血清D-木糖含量 （邱洪等，2013）。隨后處死大鼠，切開腹部游離胃，用止血鉗夾住賁門和幽門，在胃前區(qū)開口，測定胃內(nèi)pH。

1.7 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，組間多重比較采用Duncan’s法，結(jié)果用“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同工藝蒙脫石對應激性腹瀉模型大鼠血清D-木糖含量、DAO活性及小腸推進率的影響由表1可以看出，與模型對照組相比，RT和RZ蒙脫石組的血清D-木糖含量分別升高13.9%和15.19%（P＜0.05），血清DAO分別下降6.28%和5.00%（P＞0.05），小腸推進率分別下降7.8%和8.77%（P＜0.05）；RZ蒙脫石組血清D-木糖含量、血清DAO活性分別高于RT蒙脫石組1.11%和1.38%（P＞0.05），RT蒙脫石組小腸推進率高于RZ蒙脫石組1.05%（P＞0.05）；RT和RZ蒙脫石組血清D-木糖含量分別低于各自空白對照組16.67%和 15.35%（P ＜0.05），RT和 RZ蒙脫石組血清DAO分別高于各自空白對照組4.8%和4.15%（P＞0.05），RT和RZ組蒙脫石組小腸推進率分別高于其空白對照組0.67%和0.73%（P＞0.05）。

2.2 不同工藝蒙脫石對應激性腹瀉模型大鼠血清PG I含量和胃內(nèi)pH的影響 由表2可以看出，與模型對照組相比，RT和RZ蒙脫石組血清PGⅠ含量分別降低9.60%和6.51%（P＜0.05），胃內(nèi)pH分別升高4.00%和8.00%（P＜0.05）。RT和RZ蒙脫石組血清PGⅠ分別高于各自空白對照組4.93%（P＞ 0.05）和 10.96%（P＜ 0.05），RZ蒙脫石組的血清PGⅠ高于RT蒙脫石組3.42%（P＞0.05）；胃內(nèi)pH，RT蒙脫石組與其空白對照組無顯著差異 （P＞0.05），RZ蒙脫石組高于其空白對照組3.85%（P＜0.05），RZ蒙脫石組高于RT蒙脫石組 3.85%（P＜ 0.05）。

表1 不同工藝蒙脫石對應激性腹瀉模型大鼠血清D-木糖含量、DAO活性及小腸推進率的影響

表2 不同工藝蒙脫石對應激性腹瀉模型大鼠血清PG I含量和胃內(nèi)pH的影響

3 討論

3.1 不同工藝蒙脫石對應激性腹瀉大鼠小腸黏膜損傷修復及吸收功能的影響 D-木糖是一種五碳糖，與葡萄糖的化學性質(zhì)相似，內(nèi)服后不需消化，在小腸通過異化擴散的方式被吸收，不為肝臟所利用，大部分經(jīng)腎臟排出。所以血清中的D-木糖含量，在一定程度上可反映小腸的吸收功能。

二氨氧化酶（DAO）是動物黏膜上層絨毛細胞胞漿中具有高度活性的細胞內(nèi)酶。腸黏膜細胞受損或壞死后其釋放入血，二氨氧化酶在外周血中活性穩(wěn)定，一定程度上可反映腸黏膜狀態(tài)，即血漿二氨氧化酶增高提示腸黏膜屏障損傷（趙永華等，2014；黎君友，2000）。

本試驗結(jié)果表明，RT和RZ蒙脫石均可以提高應激腹瀉模型大鼠小腸的吸收功能，這可能是因為蒙脫石作為一種天然硅鋁酸鹽，本身不被胃腸道吸收，進入消化道后，附著于胃腸道黏膜上形成一層保護膜，阻止有害病毒、病原菌通過腸道進入血液。韓秀山等（2007）研究表明，蒙脫石隨粒度減小，吸附量增大，本試驗中RT和RZ蒙脫石均經(jīng)過納米剝片處理，粒度均為800目，所以推測可以更好的在胃腸道黏膜形成保護膜，提高損傷小腸黏膜修復的能力，從而提高小腸吸收功能。

本試驗中RT和RZ蒙脫石組的血清二氨氧化酶含量均低于模型對照組，高于各自的空白對照組。提示RT和RZ型蒙脫石可以提高小腸黏膜細胞完整性，但在本試驗期內(nèi)并不能完全修復應激造成的腸道黏膜損傷。RZ型蒙脫石組效果優(yōu)于RT型蒙脫石組，提示鈉化剝片蒙脫石對小腸黏膜修復效果好于鈣化剝片蒙脫石。

3.2 不同工藝蒙脫石對應激性腹瀉模型大鼠胃酸分泌及小腸運動的影響 試驗研究表明，蒙脫石在動物腹瀉的防治與治療中效果顯著，同時許多試驗也對蒙脫石的主要作用機理做了大量研究（楊榮芳，2010；王桂芳等，2009；劉美容，2008）。本試驗結(jié)果表明，RT和RZ型蒙脫石均可以降低應激性腹瀉模型大鼠的小腸推進率，提示二者均有幫助應激性腹瀉大鼠恢復正常腸道蠕動力的效果，并且RT型蒙脫石效果略好。

胃蛋白酶原是一種消化酶前體，主要由胃底泌酸腺主細胞和黏液頸細胞分泌?？煞譃閮蓚€亞群，即胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ。胃蛋白酶原Ⅱ約為總量的25%。血清胃蛋白酶原的水平可反映胃蛋白酶的分泌及胃黏膜狀態(tài)和功能情況，當胃黏膜發(fā)生病變時，血清中胃蛋白酶原的含量也隨之發(fā)生改變。血清胃蛋白酶原Ⅰ與胃泌酸腺細胞功能相關(guān)性較大，胃蛋白酶原可作為胃酸分泌的檢測指標（張愔等，2007）。血清胃蛋白酶原反映胃總體分泌胃蛋白酶原水平約有1%的胃蛋白酶原透過胃黏膜毛細血管進入血液循環(huán)，進入血液的胃蛋白酶原可以穩(wěn)定存在，血清中胃蛋白酶原的濃度在一定程度上可以反映胃腸黏膜的狀態(tài)和其分泌功能。

本試驗結(jié)果表明，RT和RZ蒙脫石組的血清胃蛋白酶原Ⅰ濃度均低于模型組，而高于空白對照組，提示胃腸泌酸腺主細胞泌酸的潛在能力有所提高，此外，應激腹瀉大鼠的損傷胃黏膜狀態(tài)，在本試驗期內(nèi)，經(jīng)飼喂蒙脫石后，有所好轉(zhuǎn)，但仍然沒有恢復到正常胃黏膜分泌狀態(tài)。在這個指標上，結(jié)果顯示RT型蒙脫石效果優(yōu)于RZ型蒙脫石；RZ蒙脫石組和RT蒙脫石組均提高了應激模型大鼠胃內(nèi)pH，基本恢復到各自空白對照組的水平，提示蒙脫石可以降低應激大鼠胃內(nèi)酸度，降低胃酸對胃黏膜的損傷程度，而且RZ型蒙脫石效果優(yōu)于RT型蒙脫石；這可能是蒙脫石自身特殊的層狀結(jié)構(gòu)形成的層間域與表面電荷以及層間可交換陽離子影響了胃黏膜細胞的泌酸功能。

4 小結(jié)

本試驗結(jié)果提示，蒙脫石具有防治和治療應激腹瀉的作用，其可能的作用機制是：蒙脫石可通過提高胃腸道黏膜損傷修復能力，恢復腸道正常蠕動，降低胃酸分泌、控制胃內(nèi)pH而發(fā)揮作用。同時提示RZ鈉化剝片800目蒙脫石效果略好。但鈉化蒙脫石與鈣化蒙脫石的效果比較還需進一步試驗。

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To observe the therapeutic effect of different processing way of montmorillonite on the model rats of stressinduced diarrhea，a total of 54 rats were divided into 2 groups including the model group with 32 rats and the control group with 22 rats.The model was structured by biding forelimbs with medical proof fabric all day after being given a gavage of 3 mL of senna infusion（1 mL was equivalent to senna 0.3 g） once everyday for 3 days.There were 4 rats being chosed to asure the success of rats modle of restraint stress.Then all the model rats were divided into 3 groups as the following：RT and RZ montmorillonite group that were respectively given a gavage of RT and RZ type montmorillonite at a dose of 0.5%of average daily feed intak twice one day.The volum of perfusion was 3 mL per rat every time.Another group was the model control group being administrated with equivalent amount of normal saline.The control group divided into 2 groups，which were RT and RZ control group.Each control group was intragastric administration just like RT or RZ montmorillonite group had being done.After 4 days，the intragaric pH，content of diamine oxidase （DAO），pepsinogen （PG） and D-xylose （D-XI） of serum were detected.The intestinal propulsion rate also was measured.The results showed as follows：Compared with the model control group，the serum content of D-XI of the two montmorillonite groups increased respectively 13.9%and 15.19% （P ＜0.05），and the nomal control group declined respectively 16.67%and 15.35%（P ＜ 0.05）.Compared with the modelcontrol group，the serum content of DAO of the two montmorillonite groups droped respectively 6.28%and 5.00%（P ＞0.05），and the nomal control group rised respectively 4.8%and 4.15%（P ＞ 0.05）.Compared with the model control group，intestinal propulsion rate of RT and RZ montmorillonite groups deceased respectively 7.8%and 8.77%（P ＜ 0.05），the nomal control group increased respectively 0.67%and 0.73%（P ＞ 0.05）.The serum content of D-XI and DAO of RT montmorillonite group increased respectively 1.11%and 1.38%compared with RZ montmorillonite group （P ＞ 0.05），while intestinal propulsion rate of RT montmorillonite group was higher（1.05%）than that of RZ montmorillonite group（P ＞ 0.05）.The results indicated that the montmorillonite could repair the intestinal morphology，small intestine peristalsis and increase the level of small ingtestine absorption.Meanwhile，compared with the model control group，the serum PG I of RT and RZ montmorillonite groups deceased respectively 9.60%and 6.51%（P ＜ 0.05），and the intragaric pH increased respectively 4.00%and 8.00%（P ＜ 0.05）.The serum PG I of RT and RZ montmorillonite groups rised 4.93%（P ＞ 0.05） and 10.96%（P ＜ 0.05）compared with their own normal control groups，and the serum PG I of RZ montmorillonite group was higher（3.42%） than that of RT montmorillonite group（P ＞ 0.05）.The intragaric pH was same between of the two montmorillonite groups（P ＞ 0.05），and the intragaric pH of RZ montmorillonite group was higher（3.85%）than that of the normal control group and RT montmorillonite group （P ＜ 0.05）.In conclusion that RZ montmorillonite was better than RZ montmorillonite on the effect of gastrointestinal tract of rats with stress-induced diarrhea.

stress-induced diarrhea；montmorillonite；pepsinogen；diamine oxidase；intestinal propulsion rate

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172005

S816.7

A

1004-3314（2017）20-0019-04

天津農(nóng)學院科學研究發(fā)展基金計劃（2013N10）