飼料中炔雌醚的液相色譜檢測方法研究

李祥明，李會榮

（山東省飼料質(zhì)量檢驗所，山東濟南 250022）

飼料中炔雌醚的液相色譜檢測方法研究

李祥明，李會榮

（山東省飼料質(zhì)量檢驗所，山東濟南 250022）

本研究建立了飼料中炔雌醚含量的液相色譜檢測方法。飼料樣品用乙腈提取，經(jīng)離心和C18SPE小柱凈化，以C18柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）為分離柱，紫外檢測器在230 nm波長下進行檢測，外標法定量。結果表明：在所選擇的色譜條件下，炔雌醚在0.50～100.00 μg/mL時線性關系良好，最低定量限為1 mg/kg；添加回收率為89.5%～99.5%，變異系數(shù)為0.5%～5.20%。本方法樣品前處理簡便、可靠，可用于各種飼料中炔雌醚的檢測。

飼料；炔雌醚；測定；液相色譜法

炔雌醚又名炔諾醚，炔雌醇環(huán)戊醚，3-環(huán)戊醚，17а-乙炔基雌烷二醇等，為白色的結晶或結晶性粉末。可在乙醇、丙酮、乙酸乙酯或三氯甲烷中溶解，在水中幾乎不溶（中華人民共和國國家藥典委員會，2005）。

炔雌醚在臨床上作為較強的口服長效雌激素，其活性為炔雌醇的4倍，口服后經(jīng)胃腸道吸收，貯存于脂肪組織內(nèi)，緩慢釋放出炔雌醇，起主要的抗生育作用。農(nóng)業(yè)部第176號公告明確規(guī)定，禁止在動物飼料和飲水中添加炔雌醚。目前鮮見飼料中炔雌醚檢測方法的研究報道。因此，本研究建立的炔雌醚檢測方法，可加強監(jiān)管部門對飼料中炔雌醚的監(jiān)督檢測和風險預警。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 分析純乙腈、甲醇，色譜純乙腈。

1.1.2 儀器和設備 分析天平（感量0.1 mg）；Agilent 1200液相色譜儀 （具有VWD檢測器）；離心機（Theremo G16）；氮吹儀；Agilent固相萃取裝置。

1.1.3 標準物質(zhì) 炔雌醚標準品純度大于98%。1.1.3.1 炔雌醚標準儲備溶液 精密稱取炔雌醚標準品100 mg，置于10 mL容量瓶中，用色譜純乙腈定容，配成濃度為10 mg/mL的標準貯備溶液。2～8℃冷藏保存，有效期為6個月。

1.1.3.2 炔雌醚標準中間溶液 準確移取炔雌醚標準儲備溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用色譜純乙腈定容至刻度。該溶液中炔雌醚的濃度為1 mg/mL。2～8℃冷藏保存，有效期為3個月。

1.1.3.3 炔雌醚標準工作溶液 準確移取炔雌醚標準中間溶液適量，用色譜純乙腈稀釋成濃度分別為 0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL 和100.00 μg/mL的標準工作溶液?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 方法

1.2.1 液相色譜條件的確定 目前國內(nèi)外有關炔雌醚的研究主要在醫(yī)藥和化妝品檢測領域，檢測方法包括紫外分光光度法 （中華人民共和國國家藥典委員會，2005）、液相色譜法（劉紅菊等，2010；Tao等，2010）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（黑龍江省質(zhì)量技術監(jiān)督局，2011）和氣相色譜質(zhì)譜法（林奕芝等，2009；林奕芝等，2006），本研究在參照液相色譜檢測方法的基礎上，對色譜條件進行了優(yōu)化和改進，最終確定的條件為：色譜柱：C18柱長250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm，或其他效果等同的C18柱。柱溫：40℃。波長：230 nm。流動相：色譜純乙腈+水=80+20。 流速：1.0 mL/min。 進樣量：50 μL。

實驗結果見圖1。結果表明，該色譜條件均能滿足色譜分析的需要。

圖1 炔雌醚標準工作溶液圖譜

1.2.2 試樣提取條件的確定 由于炔雌醚易在乙醇、丙酮、乙酸乙酯或三氯甲烷中溶解，在水中幾乎不溶的性質(zhì)，提取液只能在有機溶劑中選擇，考慮到實驗室常用的試劑和每類試劑毒性的大小，選擇了甲醇和乙腈作為提取試劑進行了比較。實驗結果表明，相同的飼料樣品，甲醇作為提取液時，試樣中提取出的雜質(zhì)種類多且含量高，其回收率和乙腈基本相似。因此，選擇乙腈為提取液。甲醇和乙腈提取相同飼料樣品的圖譜見圖2和圖3。

圖2 甲醇提取的飼料樣品圖譜

用乙腈為提取液，分別用振蕩和超聲提取10、15、20 min 和 30 min。 實驗結果表明，用振蕩器振蕩比超聲波提取的回收率略高。振蕩20 min和30 min回收率基本相同，為了節(jié)約時間，選用振蕩20 min。最終確定的提取步驟為：稱取試樣5 g（精確至0.001 g）于50 mL離心管中，加入15.0 mL乙腈，充分振蕩20 min，然后靜置沉淀5 min，取4.0 mL上清液于20 mL試管中，加入12 mL水混勻，備用。

圖3 乙腈提取的飼料樣品圖譜

1.2.3 SPE凈化條件的確定 根據(jù)炔雌醚的理化性質(zhì)和極性，首先選擇了C18小柱進行回收實驗，選用不同的上樣溶劑、淋洗溶液和洗脫溶液，結果見表1。

表1 不同凈化條件結果比較

實驗結果表明，只有上樣溶劑中乙腈的比例小于30%時，炔雌醚才能完全吸附于填料上；淋洗溶液中乙腈的比例小于30%時，炔雌醚不會被洗脫下來。因此，吸取4.0 mL乙腈提取液中需加入12 mL水，使乙腈的比例為25%，上樣溶液中的炔雌醚才能充分吸附于填料上。當溶液中乙腈的比例為10%時，回收率和乙腈比例為25%的基本相同，考慮到過SPE小柱更節(jié)約時間的情況下，選擇乙腈的比例為25%，即吸取4.0 mL乙腈提取液中加入12 mL水。淋洗溶液選用1+3的乙腈水溶液，保證了淋洗時目標物不會被洗脫。淋洗液中乙腈比例低于25%時，洗脫雜質(zhì)的效果降低。洗脫溶液中乙腈和甲醇的回收率相同，為了和流動相一致，故選用乙腈為洗脫液。最終確定的凈化條件為：固相萃取C18小柱用3 mL甲醇、3 mL水活化。將提取溶液過柱（流速＜1 mL/min），用3 mL乙腈溶液（1+3）淋洗，用3 mL乙腈洗脫，收集洗脫液，氮吹儀上（50℃）至干，用1.00 mL乙腈溶解，過0.22 μm濾膜后上機測定。

2 結果

2.1 標準工作溶液線性 將濃度分別為0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/mL 和 100.00 μg/mL的標準工作溶液，每個濃度連續(xù)進樣3次，按平均值計算標準曲線線性。線性范圍為0.50～100.00 μg/mL，獲得標準曲線y炔雌醚=62.7x+8.9648，線性相關系數(shù)R2=1.000。結果見圖4。

圖4 炔雌醚標準曲線線性

2.2 方法線性實驗 用蛋雞配合飼料分別做1、5、10、20 mg/kg和50 mg/kg的添加實驗，其添加濃度和峰面積的線性見圖5。線性相關系數(shù)R2=0.9992。

圖5 炔雌醚方法線性

2.3 方法檢出限和定量限實驗 在空白的蛋雞配合飼料、肉牛精料補充料、豬濃縮飼料和豬預混合飼料中添加不同濃度的炔雌醚。添加回收實驗表明，在添加濃度為0.50 mg/kg時，由于前處理過程要稀釋，即上機試液中炔雌醚的濃度大約為0.60 μg/mL，而配合飼料由于提取出的其他干擾物質(zhì)含量較高，致使信噪比 S/N（Peak to Peak）＜10，炔雌醚的回收率均低于70%。因此本方法的檢出限定為0.5 mk/kg，定量限定為1 mg/kg。0.5 μg/mL炔雌醚標樣的圖譜見圖6；蛋雞配合飼料空白和添加圖譜見圖7和圖8；肉牛精料補充料的空白和添加圖譜見圖9和圖10；豬濃縮飼料的空白和添加圖譜見圖11和圖12；豬預混合飼料空白和添加圖譜見圖13和圖14。

圖6 0.5 μg/mL炔雌醚標樣

圖7 空白蛋雞配合飼料圖譜

圖8 蛋雞配合飼料1mg/kg炔雌醚添加圖譜

圖9 空白肉牛精料補充料圖譜

圖10 肉牛精料補充料1 mg/kg炔雌醚添加圖譜

圖11 空白豬濃縮飼料圖譜

圖12 豬濃縮飼料1 mg/kg炔雌醚添加圖譜

表2 不同飼料中添加炔雌醚回收率%

圖13 空白豬預混合飼料圖譜

圖14 豬預混合飼料1 mg/kg炔雌醚添加圖譜

2.4 方法準確度和精密度實驗 選擇空白對蝦配合飼料、蛋雞配合飼料、肉牛精料補充料、豬濃縮飼料和育肥豬預混合飼料進行加標回收率實驗。在上述飼料中分別加入適宜體積的炔雌醚標準工作溶液，使其添加濃度均為1、5、10 mg/kg和50 mg/kg，進行加標回收實驗。結果見表2。實驗結果表明，該方法添加回收率為89.5%～99.5%，變異系數(shù)為0.5%～5.20%。方法適用的范圍為畜禽、水產(chǎn)配合飼料、精料補充料、濃縮飼料和預混合飼料。

3 結論

本研究建立的飼料中炔雌醚液相色譜檢測方法，樣品的提取和凈化步驟科學合理，易于掌握，測試數(shù)據(jù)重復性好，添加回收率均可滿足分析實驗要求，可很好的滿足飼料中炔雌醚的測定要求。

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The study established a liquid phase chromatographic method for determination of quinestrol in feed.Feed samples were firstly extracted by acetonitrile，then purification with C18SPE column，after being isolated by C18（250 mm×4.6 mm×5 μm）column，eventually detected by UV detector at 230 nm，and were quantified by external standard method.The results showed that under the selected chromatographic conditions，quinestrol was linear in the range of 0.50 ～ 100.00 μg/mL，and the lowest determination limit was 1 mg/kg.The relative standard deviation （RSD）was 0.5% ～5.20%when the recovery rate was 89.5% ～ 99.5%.The method was proved to be simple，rapid and resproducible for determination of quinestrol in feed.

feed；quinestrol；determination；liquid phase chromatographic method

S816.17

A

1004-3314（2017）20-0028-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20172007