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    超高壓輔助濁點(diǎn)萃取法提取富集蓮子心總生物堿

    2013-08-29 09:39:02朱榮華王曉劉建華張樹(shù)芹劉峰
    山東科學(xué) 2013年3期
    關(guān)鍵詞:濁點(diǎn)蓮子心蓮心

    朱榮華 ,王曉 ,劉建華 ,張樹(shù)芹,劉峰

    (1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院,山東 泰安 271018;2.山東省分析測(cè)試中心,山東 濟(jì)南 250014)

    植物中活性成分的提取、富集是分離與分析的第一步,也是最關(guān)鍵的一步。近年來(lái)一些新技術(shù),如超臨界流體萃?。?]、微波輔助提?。?-3]等已被廣泛應(yīng)用于中藥活性成分的提取過(guò)程中,但是這些方法存在耗時(shí)長(zhǎng),能耗高等缺點(diǎn)。超高壓提取(ultrahigh pressure extraction,UPE)是利用100 MPa 以上的流體靜壓力作用于溶劑和中藥的混合液,保壓一段時(shí)間(幾分鐘)后卸壓,從而達(dá)到提取的目的[4-5],已廣泛應(yīng)用于中藥有效成分的提取,如葡萄皮中提取花青素[6]、茶葉中提取茶多酚[7]、荔枝果皮中提取黃酮類(lèi)化合物[8]和人參中提取人參皂苷[9]等。該方法與傳統(tǒng)技術(shù)相比,可以大大縮短提取時(shí)間、降低能耗、減少雜質(zhì)成分的溶出,提高有效成分的收率,避免了因熱效應(yīng)引起的有效成分結(jié)構(gòu)變化、損失以及生理活性的降低[10-11]。濁點(diǎn)萃取(cloud point extraction,CPE)是以表面活性劑膠束水溶液的溶解性和濁點(diǎn)現(xiàn)象為基礎(chǔ),通過(guò)改變一定的萃取條件(如電解質(zhì)、溫度、時(shí)間等),達(dá)到將水溶性物質(zhì)與親油性物質(zhì)分離的目的[12]。該方法完全取代了有機(jī)溶劑,具有經(jīng)濟(jì)、高效的特點(diǎn)[13],有著廣闊的應(yīng)用前景。因此,超高壓提取與濁點(diǎn)萃取技術(shù)相結(jié)合,可在無(wú)有機(jī)溶劑條件下實(shí)現(xiàn)快速提取、富集天然產(chǎn)物中的有效成分。目前,超高壓-濁點(diǎn)萃取技術(shù)提取、富集天然產(chǎn)物有效成分的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

    蓮子心是蓮科植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn)成熟種子中的綠色胚芽,主要成分為生物堿,包括甲基蓮心堿、異蓮心堿、蓮心堿等[14]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,蓮子心具有抗多種實(shí)驗(yàn)性心律失常、抗血小板聚集及降壓等作用[15]。

    本文對(duì)超高壓-濁點(diǎn)萃取蓮子心中生物堿的影響因素進(jìn)行了系統(tǒng)研究。通過(guò)表面活性劑類(lèi)型、濃度、提取壓力、時(shí)間、料液比等單因素實(shí)驗(yàn)確定了液-固提取工藝條件;進(jìn)一步通過(guò)NaCl 濃度、平衡溫度、平衡時(shí)間等單因素實(shí)驗(yàn)確定了濁點(diǎn)萃取富集條件。結(jié)果表明,此方法可在極短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)蓮子心生物堿的提取、富集。

    1 儀器和試劑

    1.1 儀器與設(shè)備

    HPP.L3-600 型超高壓生物提取設(shè)備(天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司);UV-2550 型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司);AE240 分析天平(METTLER 公司)。

    1.2 原料與試劑

    蓮子心購(gòu)自山東中醫(yī)藥大學(xué)中魯藥店,甲基蓮心堿對(duì)照品購(gòu)自天然產(chǎn)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品參比實(shí)驗(yàn)室;烷基酚聚氧乙烯醚(OP-10)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)、十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、氯化鈉為分析純,均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇、無(wú)水乙醇為分析純,均購(gòu)自濟(jì)南巨業(yè)化學(xué)試劑有限公司。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 超高壓提取方法

    稱(chēng)取一定量的樣品,轉(zhuǎn)入聚乙烯塑料袋中,按照一定的料液比加入溶劑,密封。在一定壓力下,提取一定時(shí)間,卸壓后,過(guò)濾,得提取液,分析總生物堿含量。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次,取平均值。

    2.2 濁點(diǎn)萃取方法

    將上述過(guò)濾后的提取液中加入一定量的NaCl,混勻,放入設(shè)定溫度的恒溫水浴中加熱。平衡一段時(shí)間后,進(jìn)行離心分離,使表面活性劑相與水相分離。分別量取兩相體積并測(cè)定兩相中蓮子心生物堿的含量。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次,取平均值。

    2.3 總生物堿含量測(cè)定

    精確配制0.50 mg/mL 的甲基蓮心堿對(duì)照品溶液,用甲醇分別稀釋2、5、10、20、50 倍后,用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于280 nm 下分別測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),甲基蓮心堿濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)作圖,得線性回歸方程:Y=-0.04826+12.52484X,R2=0.9992。

    分別取提取液、表面活性劑相、水相溶液100 μL 用去離子水稀釋定容至10 mL,測(cè)定總生物堿含量,計(jì)算提取率及萃取回收率。

    2.4 萃取回收率及濃縮系數(shù)

    萃取回收率=表面活性劑相總生物堿的濃度/提取液總生物堿的濃度;

    濃縮系數(shù)(CF)=濃縮分層后水相體積/表面活性劑相體積。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 液-固提取

    3.1.1 表面活性劑的選擇

    稱(chēng)取0.25 g 蓮子心粉,分別采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的OP-10、Triton X-100、SDS、SDBS、甲醇、乙醇溶液為提取溶劑,固定料液比1:40 (g/mL),在壓力200 MPa 下提取2 min,不同提取溶劑對(duì)提取率影響如圖1(A)所示。

    從圖1(A)可知,OP-10、SDS 比其他溶液具有更高的提取效率,但是SDS 的Krafft 點(diǎn)在8℃左右,后續(xù)萃取階段較難控制,而OP-10 的濁點(diǎn)為65~80℃,易于進(jìn)行后續(xù)濁點(diǎn)萃取階段的操作,綜合以上因素最終選擇OP-10 水溶液作為溶劑。

    3.1.2 OP-10 水溶液濃度對(duì)提取率的影響

    稱(chēng)取0.25 g 蓮子心粉,分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、3%、5%、7%、9%的OP-10 水溶液作為提取溶劑,固定料液比1:40 (g/mL),在壓力200 MPa 下提取2 min,不同提取溶劑濃度對(duì)提取率影響如圖1(B)所示。

    表面活性劑具有親水基和疏水基,達(dá)到臨界膠束后,可以形成疏水基在里的膠束團(tuán),本實(shí)驗(yàn)對(duì)蓮心生物堿的提取作用依靠的就是表面活性劑溶液中所形成的膠束。從圖1(B)中可以看出OP-10 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1%~5%之間,提取率隨著溶劑濃度的增大呈上升趨勢(shì),原因是隨著表面活性劑溶液濃度的增大,形成的膠束越來(lái)越多,增溶作用越強(qiáng),越有利于總生物堿的提取。但在OP-10 質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于5%之后,隨著濃度的增大提取效率呈下降趨勢(shì),這是因?yàn)殡S著表面活性劑濃度的增大,溶液黏度增大,擴(kuò)散能力減弱,膠束難滲入到蓮子心樣品基質(zhì)的內(nèi)部,導(dǎo)致提取率降低。因此,質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的OP-10 水溶液為最佳提取溶劑。

    3.1.3 壓強(qiáng)對(duì)提取率的影響

    稱(chēng)取0.25 g 蓮子心粉,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的OP-10 水溶液為溶劑,固定料液比1:40 (g/mL),分別在100、200、300、400、500 MPa 高壓下提取2 min,結(jié)果見(jiàn)圖1(C)。

    超高壓提取的過(guò)程是先對(duì)物料加壓,保持一定時(shí)間后,突然卸壓。由于在增壓過(guò)程中,蓮子心細(xì)胞內(nèi)外出現(xiàn)超高壓差,溶劑在壓力作用下迅速滲透到細(xì)胞內(nèi);卸壓過(guò)程中壓力由幾百兆帕迅速降為常壓,同樣,在內(nèi)外壓差作用下,有效成分從細(xì)胞內(nèi)向周?chē)軇﹥?nèi)擴(kuò)散,從而大大加快了有效成分向外擴(kuò)散的速率[16]。

    從圖1(C)中可以看出,在100~500 MPa 之間,隨著超高壓壓力的升高,提取率略有下降。說(shuō)明壓力在達(dá)到100 MPa 時(shí),細(xì)胞的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜已被充分破壞,目標(biāo)化合物已充分溶出,當(dāng)壓力增大,溶劑粘度增加,擴(kuò)散能力減弱,提取率略有下降。因此,提取壓力選擇100 MPa。

    3.1.4 保壓時(shí)間對(duì)提取率的影響

    稱(chēng)取0.25 g 蓮子心粉,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的OP-10 水溶液為溶劑,固定料液比1:40 (g/mL),100 MPa 高壓下分別提取1、2、3、4、5 min,結(jié)果見(jiàn)圖1(D)。

    從圖1(D)中可以看出,在1~5 min 之間,隨著保壓時(shí)間的延長(zhǎng),提取率略有下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,提取溶劑在高壓作用下,進(jìn)入蓮子心細(xì)胞內(nèi),100 MPa 高壓下蓮子心的細(xì)胞破裂很快,在這1 min 內(nèi)已經(jīng)充分破裂,并且超高壓力引起體系的體積變化,推動(dòng)了化學(xué)平衡的移動(dòng),溶劑的滲透、溶質(zhì)的溶解快速達(dá)到平衡[16]。從效率和能耗等方面綜合考慮,1 min 為最佳時(shí)間。

    3.1.5 料液比對(duì)提取率的影響

    以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的OP-10 溶液為溶劑,分別按照料液比1:5,1:10,1:20,1:30,1:40 (g/mL),100 MPa 高壓下提取1 min,結(jié)果見(jiàn)圖1(E)。

    如圖1(E)所示,在一定范圍內(nèi),隨著料液比的增大,表面活性劑的量增加,膠束作用越強(qiáng),溶劑對(duì)總生物堿的提取效果越好,但是達(dá)到一定的濃度后,溶劑實(shí)現(xiàn)了對(duì)總生物堿的充分提取,再增大料液比提取率基本不變,因此本實(shí)驗(yàn)的最佳料液比為1:20。

    圖1 超高壓提取影響因素對(duì)提取率的影響Fig.1 Impact of ultrahigh pressure-assisted micellar extraction on the extraction yield of total alkaloids

    超高壓輔助表面活性劑提取蓮子心中生物堿的最佳工藝條件如表1 所示,按照上述條件進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn),蓮心生物堿的提取率可以達(dá)到103.6 mg/g。

    表1 最佳提取工藝條件Table 1 The optimal conditions of the extraction process

    3.2 液-液萃取

    3.2.1 NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取回收率的影響

    完成提取后過(guò)濾,向?yàn)V液中加入一定量的NaCl,使NaCl 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到5%、10%、12%、15%、17%、20%,恒溫65℃水浴加熱10 min 后,2 000 r/min 離心4 min,結(jié)果如圖2(A)所示。

    溶液中加入電解質(zhì)NaCl 可增大OP-10 膠團(tuán)的聚集數(shù),并降低表面活性劑濃縮相中自由水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和減少溶質(zhì)在水相的溶解度,從而提高其對(duì)蓮心生物堿的增溶能力并且減小表面活性劑相的體積,另外,無(wú)機(jī)鹽可以改變非離子表面活性劑的濁點(diǎn)溫度[17]。圖2(A)表明,隨著NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,濃縮系數(shù)一直呈上升趨勢(shì),萃取回收率值在NaCl 質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大到15%后達(dá)到平衡,再增加NaCl 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)萃取回收率值基本沒(méi)有影響,而且加入過(guò)多的NaCl 難以溶解,因此15%為最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

    圖2 濁點(diǎn)萃取各因素對(duì)萃取回收率和濃縮系數(shù)的影響Fig.2 Impacts of CPE factors on CPE extraction yield and CF

    3.2.2 平衡溫度對(duì)萃取回收率的影響

    完成提取后過(guò)濾,向?yàn)V液中加入NaCl,使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到15%,再分別以恒溫30、40、50、60、65、70℃水浴加熱10 min 后,2 000 r/min 離心4 min,結(jié)果如圖2(B)所示。

    隨著平衡溫度的上升,膠束中氫鍵斷裂脫水,使表面活性劑富集相體積減少,引發(fā)更好的相分離。圖2(B)表明,隨著溫度的上升,濃縮系數(shù)一直呈上升趨勢(shì),萃取回收率值在30~50℃間呈上升趨勢(shì),在50℃之后出現(xiàn)下降趨勢(shì),可能是溫度過(guò)高,蓮心生物堿穩(wěn)定性下降,部分生物堿被破壞。所以最佳的平衡溫度是50℃。

    3.2.3 平衡時(shí)間對(duì)萃取回收率的影響

    完成提取后過(guò)濾,向?yàn)V液中加入NaCl,使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到15%,分別在50℃恒溫水浴加熱5、10、15、20、25 min 后,2 000 r/min 離心4 min,結(jié)果如圖2(C)所示。

    在合適的電解質(zhì)和濁點(diǎn)溫度下,足夠的平衡時(shí)間可以使表面活性劑充分的提取富集目標(biāo)成分。從圖2(C)可知,在50℃恒溫水浴條件下,平衡時(shí)間對(duì)萃取回收率和濃縮系數(shù)影響不大,濃縮系數(shù)基本保持不變,萃取回收率值在平衡時(shí)間達(dá)到10 min 后也基本保持不變。所以平衡時(shí)間選擇為10 min。最佳富集工藝條件見(jiàn)表2。

    表2 最佳富集工藝條件Table 2 The optimal conditions of the enrichment process

    2.3 最優(yōu)化條件

    綜上所述,超高壓輔助膠束提取蓮子心生物堿的最佳提取工藝為提取壓力100 MPa,提取時(shí)間1 min,質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% OP-10 為溶劑,料液比1:20 (g/mL),蓮心生物堿的提取率達(dá)到103.6 ±2.6 mg/g。提取液中加入NaCl 使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到15%再在50℃條件下平衡10 min,兩相分離,離心后蓮子心生物堿的萃取回收率為70.73% ±1.34%,濃縮系數(shù)為8.6 ±0.2。

    4 結(jié)論

    本文利用超高壓輔助膠束提取結(jié)合濁點(diǎn)萃取技術(shù)從蓮子心中提取富集了蓮心生物堿,與傳統(tǒng)方法相比,超高壓提取時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、能耗低。同時(shí),超高壓處理后的提取液成分較簡(jiǎn)單,不渾濁,粘度低,易過(guò)濾,有利于后續(xù)操作。常溫提取又能使蓮子心生物堿避免因熱效應(yīng)損失和藥理活性降低。超高壓輔助膠束提取結(jié)合濁點(diǎn)技術(shù)是在密閉的環(huán)境下常溫進(jìn)行的,沒(méi)有溶劑揮發(fā),綠色環(huán)保,是一種提取和富集蓮子心中生物堿的新方法。

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