重組免疫毒素GnRH-PTD-PE39KDEL 的構(gòu)建及表達(dá)

扈進(jìn)冬 ，魏艷麗 ，楊合同，2* ，李紀(jì)順，張廣志

(1.山東省科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014;2.山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255049)

免疫毒素是由具有催化作用的毒素和有適當(dāng)導(dǎo)向作用的細(xì)胞因子、短肽激素或者抗體構(gòu)建的具有藥理活性的生物制劑，既具有特異性的識(shí)別功能，又具有毒素的殺傷功能，主要應(yīng)用于腫瘤的導(dǎo)向治療。研究表明，免疫毒素在細(xì)胞培養(yǎng)水平有很好的選擇性結(jié)合與殺傷腫瘤細(xì)胞的作用［1］。但目前在應(yīng)用中，由于實(shí)體瘤的結(jié)構(gòu)問題，不存在對(duì)靶組織的特異性殺傷作用較弱，尤其對(duì)大型實(shí)體瘤的浸潤(rùn)性較差，在體內(nèi)的免疫反應(yīng)嚴(yán)重等問題，所以如何增強(qiáng)靶向毒性蛋白中PE 部分的細(xì)胞毒性，研制出只殺死病理相關(guān)細(xì)胞的免疫毒素就成為關(guān)鍵［2-3］。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)域(protein transduction domain，PTD)可以有效地將蛋白、多肽及核酸片段通過無(wú)受體介導(dǎo)、無(wú)耗能的方式，導(dǎo)入多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，且在一定濃度范圍內(nèi)不會(huì)造成細(xì)胞損傷。PTD 是蛋白靶向入胞有力的生物學(xué)手段，為親水性大分子藥物跨越細(xì)胞生物膜、血腦屏障［4-5］以及治療疾病提供了新的途徑，在細(xì)胞生物學(xué)、基因治療、藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、臨床藥效評(píng)價(jià)及細(xì)胞免疫學(xué)等研究領(lǐng)域均具有良好的應(yīng)用前景［6］。而通過在免疫毒素中引入PTD 可以增強(qiáng)免疫毒素對(duì)腫瘤細(xì)胞的穿透性，增強(qiáng)其對(duì)實(shí)體瘤的浸潤(rùn)性，從而提高對(duì)實(shí)體瘤的殺傷作用［7］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

大腸桿菌DH5α，BL21(DE3)plysS 為本實(shí)驗(yàn)室保存菌種，人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞為本室保存。質(zhì)粒pETTrx/GnRH-PE39KDEL，本室構(gòu)建，其中克隆有GnRH-PE39KDEL 基因，pET-His 表達(dá)載體購(gòu)自美國(guó)基因動(dòng)力實(shí)驗(yàn)室有限公司深圳代表處，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.1.2 試劑

Taq DNA 聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶及其配套緩沖溶液、DL2000 DNA Marker 均購(gòu)自Takara 公司。IPTG、DNA Marker、瓊脂糖、蛋白質(zhì)中等分子量marker、氨芐青霉素購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。凝膠電泳回收試劑盒購(gòu)自天根公司，凝血因子Xa 購(gòu)自德國(guó)Merck 公司，HiTrap Benzamidine FF購(gòu)自通用電氣醫(yī)療集團(tuán)，其他為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。MTT 和RPMI 1640 培養(yǎng)液購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 GnRH-PTD-PE39KDEL 基因的獲得

設(shè)計(jì)3 條引物:MiddlePTDF1 5＇TACAACGCTGGTCGTCGTGCTCGTCGTCGTCGTCG TCGTCACTTCCCGGA AGGTGG;MiddlePTDF2 5＇ CGGGATCCGTGGAAGGTCGCGAACACTGGTCTTACGGTCTGCGTCCGGGTTACAACG CTGGTCGTCG;GnRHR 5＇ CGGAATTCTCACAGTTCGTCTTTCGG。其中在MiddlePTDF1 中引入PTD 核酸序列，MiddlePTDF2 中引入Factor Xa 蛋白酶切割位點(diǎn)(斜體部分)，MiddlePTDF2 和GnRHR 中分別引入BamH I和EcoR I 酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)注)，然后采用兩輪PCR 從質(zhì)粒pET-Trx/GnRH-PE39KDEL 中擴(kuò)增獲得GnRHPTD-PE39KDEL。PCR 反應(yīng)體系為:10 ×Taq DNA buffer 5 μL，上下游引物20 μmol/L，dNTP 100 μmol/L，模板DNA 0.1 μg，Taq DNA 聚合酶3U，ddH2O 補(bǔ)足到50 μL。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，30 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。采用DNA 純化試劑盒進(jìn)行目的DNA片段的純化。

1.2.2 GnRH-PTD-PE39KDEL 基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

提取質(zhì)粒pET-His，用BamH I 和EcoR I 雙酶切，回收2.8 kb 的線性質(zhì)粒;PCR 擴(kuò)增過的GnRH-PTDPE39KDEL 基因片段同樣用BamH I 和EcoR I 雙酶切，回收酶切產(chǎn)物片段，使用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，于16℃連接過夜，連接產(chǎn)物為pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL 重組質(zhì)粒。直接轉(zhuǎn)化E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB+Amp 平板，37℃倒置過夜培養(yǎng)。使用MiddlePTDF2 和GnRHR 為引物進(jìn)行菌落PCR 初步鑒定轉(zhuǎn)化子，并進(jìn)行限制性內(nèi)酶酶切重組質(zhì)粒和測(cè)序鑒定(生工生物工程(上海)有限公司)。

1.2.3 GnRH-PTD-PE39KDEL 融合蛋白的表達(dá)篩選

取上述1.2.2 中構(gòu)建的pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL 質(zhì)粒1 μL，稀釋10 倍后直接轉(zhuǎn)化E.coli 表達(dá)菌株BL21(DE3)plysS 感受態(tài)細(xì)胞，在轉(zhuǎn)化平板上挑取轉(zhuǎn)化子若干，2 mL LB +Amp(胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，用NaOH 調(diào)節(jié)pH 值到7.0，含100 μg/mL Ampicillin)液體培養(yǎng)基37℃振蕩過夜培養(yǎng)。次日，取20 μL 過夜培養(yǎng)液加入到2 mL YTA +Amp(胰蛋白胨16 g/L，酵母提取物10 g/L，氯化鈉10 g/L，用NaOH 調(diào)節(jié)pH 值到7.0，含100 μg/mL Ampicillin)液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)培養(yǎng)，37℃振蕩培養(yǎng)3 h，至OD600 在0.5～0.7 之間，然后加入IPTG 至終濃度為0.3 mmol/L，30℃振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá)3～8 h。誘導(dǎo)前，隨機(jī)從一個(gè)樣品中取出0.5 mL 菌液，電泳檢測(cè)時(shí)作為誘導(dǎo)對(duì)照。誘導(dǎo)表達(dá)完后，各取0.5 mL 菌液(視表達(dá)細(xì)菌的量多少而變化，一般在0.2～0.5 mL 之間)，5 000 r/min 離心5 min 收集細(xì)胞，包括未誘導(dǎo)的樣品，重懸于100 μL 去離子水中，以此為電泳樣品作質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5%的SDS-PGAE。根據(jù)電泳結(jié)果，得到有表達(dá)的菌株。

1.2.4 GnRH-PTD-PE39KDEL 融合蛋白的大規(guī)模表達(dá)

挑取篩選獲得的表達(dá)菌株單克隆在LB +Amp 液體培養(yǎng)基中37℃過夜振蕩培養(yǎng)，次日，按照體積比1:100加入到100 mL YTA+Amp 培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)培養(yǎng)，37℃振蕩培養(yǎng)3 h 后，加入IPTG 至終濃度為0.3 mmol/L，再30℃振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h。誘導(dǎo)培養(yǎng)完后，菌液5 000 r/min 離心10 min 收集細(xì)胞，細(xì)胞重懸于5 mL 預(yù)冷的1 ×PBS，加入50 μL 體積分?jǐn)?shù)20%的Triton X-100，充分混勻后冰浴30 min，進(jìn)行超聲波破碎細(xì)胞。超聲循環(huán)為:超聲1 s;間隔1 s;全程40 s。重復(fù)4 次，每次間隙時(shí)將菌液在冰浴中混勻，避免局部溫度太高，使蛋白質(zhì)變性。最后，將破碎后的菌液10 000 r/min 離心15 min，收集上清液和沉淀，上清液和沉淀分別留樣、備用。

1.2.5 GnRH-PTD-PE39KDEL 融合蛋白初純品的制備

將破碎上清液加到Ni-NTA 層析柱中，流速控制在0.3 mL/min 左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE 分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。然后用5 倍Ni-NTA 體積的NTA-0 Buffer 洗，流速控制在0.5 mL/min，用NTA-10 Buffer (20 mmol Tris-HCl pH=7.9，0.5 mol NaCl，10% Glycerol，20 mmol Imidazole)洗5 倍Ni-NTA 體積，流速控制在0.5 mL/min 左右，去除未結(jié)合雜蛋白。最后用NTA-500 Buffer (20 mmol Tris-HCl pH=7.9，0.5 mol NaCl，10% Glycerol，500 mmol Imidazole)洗脫，直到檢測(cè)不到蛋白為止，流速控制在0.3 mL/min左右。取上述經(jīng)過Ni-NTA 樹脂純化的融合蛋白溶液，使用Factor Xa 切割緩沖液(20 mmol Tris-HCl，100 mmol NaCl，2 mmol CaCl2，(pH=8.0))調(diào)整至10 mL，用Minipore Ultra-4 超濾離心管濃縮至0.5 mL，加入10 μg的Factor Xa，23℃溫育16 h，裂解液SDS-PAGE 電泳檢測(cè)。然后使用HisTrap FF 和HiTrap Benzamidine FF分別去除未切割的重組蛋白和Factor Xa，得到純度達(dá)到90%以上的藥物原液，并使用HPLC 對(duì)純化樣品進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 GnRH-PTD-PE39KDEL 的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

取人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞進(jìn)行消化和收集，將細(xì)胞用RPMI 1640 培養(yǎng)液稀釋成5 ×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，接種于96 孔板，100 μL/孔，37℃培養(yǎng)4 h。對(duì)照加入100 μL 培養(yǎng)液。樣品先用RPMI 1640 培養(yǎng)液稀釋成100 μL/mL，作為起始孔，然后按每孔與上孔2 倍的關(guān)系稀釋樣品，各加入稀釋的樣品每孔100 μL，每個(gè)梯度設(shè)8 個(gè)平行孔，實(shí)驗(yàn)設(shè)陰性對(duì)照(加等體積的細(xì)胞懸液)和空白對(duì)照(只含培養(yǎng)基)。體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)24 h，取出，用MTT 法染色，用酶標(biāo)儀570 nm 進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 GnRH-PTD-PE39KDEL 重組質(zhì)粒的鑒定

使用MiddlePTDF2 和GnRHR 為引物進(jìn)行菌落PCR 擴(kuò)增初步鑒定，瓊脂糖電泳結(jié)果顯示有約1.2 kb 的特異目的條帶(見圖1)，提取重組GnRH-PTD-PE39KDEL 重組質(zhì)粒。使用BamHI、EcoRI 進(jìn)行雙酶切，獲得2個(gè)片段，2.8 Kb 和1.2 Kb，與預(yù)期長(zhǎng)度相符(見圖2)，經(jīng)測(cè)序后確認(rèn)序列完全正確。

2.2 pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

總蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳顯示在約45 kD 處有一條目的產(chǎn)物條帶，與預(yù)期基本一致，采用圖像分析軟件Bandscan 5.0 分析，表明表達(dá)量占總蛋白的20%左右，誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)產(chǎn)物經(jīng)超聲波破碎，分離上清液和沉淀，用SDS-PAGE 電泳。結(jié)果表明，GnRH-PTD-PE39KDEL 以可溶性形式表達(dá)(圖3)。

2.3 免疫毒素蛋白純化品的制備

破碎上清液Ni-NTA 鎳親和層析柱純化后得到純化免疫毒素蛋白，Minipore Ultra-4 超濾離心管濃縮至0.5 mL(濃度約1 mg/mL)，加入10 μg 的Factor Xa，23℃溫育16 h，并使用HiTrap Benzamidine FF(high sub)去除Factor Xa，最終獲得免疫毒素蛋白初純品，SDS-PAGE 電泳顯示明顯的單一條帶(圖4)。經(jīng)HPLC 對(duì)純化樣品進(jìn)行測(cè)定，主要吸收峰面積超過90%。

2.4 免疫毒素蛋白對(duì)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的毒性

檢測(cè)結(jié)果(見表1)表明，GnRH-PTD-PE39KDEL 和對(duì)照GnRH -PE39KDEL 對(duì)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞均有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，隨著劑量的增加，其對(duì)細(xì)胞活性的抑制率也有所增強(qiáng)，至5.0 μg/mL 后，其抑制率增幅變緩。GnRH-PTD-PE39KDEL 和對(duì)照GnRH-PE39KDEL 對(duì)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的IC50分別為0.860 μg/mL 和1.018 μg/mL，靶向融合蛋白引入PTD 后對(duì)人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的毒性表明較GnRH-PE39KDEL 增強(qiáng)。

表1 不同濃度GnRH-PTD-PE39KDEL 和GnRH -PE39KDEL對(duì)MCF-7 細(xì)胞的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of GnRH-PTD-PE39KDEL and GnRH -PE39KDEL of different concentrations on cell MCF-7

3 結(jié)論

PE 是銅綠假單胞桿菌分泌的一種毒性非常強(qiáng)烈的外毒素，是免疫毒素構(gòu)建中常用的毒素分子，PE 由3個(gè)功能區(qū)構(gòu)成，各區(qū)功能明確［8］。PE39KDEL 是綠膿桿菌外毒素A(PE)的截短形式(在去除I 區(qū)的PE 毒素的基礎(chǔ)上再缺失359～365 位氨基酸后，PE 毒素的活性會(huì)大幅度提高［9］;同時(shí)，將PE 末端5 個(gè)氨基酸REDLK 突變?yōu)镵DEL 后，PE 的活性也會(huì)大幅度提高即為PE39KDEL)。免疫毒素的導(dǎo)向部分具有識(shí)別靶細(xì)胞特異性受體的功能，常見的導(dǎo)向部分有c-Met，即原癌基因met 編碼的酪氨酸激酶受體［10］;F3 肽，即來(lái)自高遷移組蛋白(high mobility group protein，HMG)N2 的31 個(gè)氨基酸片段［11］;EGF(表皮生長(zhǎng)因子)［12］;GnRH(又稱作LHRH 促黃體激素釋放激素)或其衍生物等。其中GnRH 或其衍生物為導(dǎo)向部分，PE 為毒素部分的靶向治療劑已經(jīng)有廣泛的報(bào)道［13-14］，這些融合蛋白的靶向性已得到廣泛驗(yàn)證［15］，能特異性地識(shí)別目的細(xì)胞并將其殺死［16-17］，但在實(shí)際應(yīng)用中對(duì)于動(dòng)物模型中生長(zhǎng)旺盛的實(shí)體瘤起效不大，本文我們選用一種PTD，其氨基酸為YNAGRRARRRRRR，能夠有效地介導(dǎo)外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的胞質(zhì)當(dāng)中，有介導(dǎo)能力強(qiáng)、速度快、溫度適應(yīng)性廣、濃度依賴性小、能夠摻入所有細(xì)胞等特點(diǎn)。PTD 與其他蛋白的融合表達(dá)產(chǎn)物能高效地進(jìn)入體外培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)，并且表現(xiàn)出生物學(xué)活性。胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽融合分子可以穿越細(xì)胞膜而不損傷細(xì)胞［18］，被胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)肽帶入細(xì)胞的分子仍保留其原有的性質(zhì)［19］。PTD 介導(dǎo)無(wú)活性的分子進(jìn)入細(xì)胞后仍能重新折疊，自我復(fù)性，是基因工程藥物經(jīng)濟(jì)、高效利用的一種有效途徑。將PTD 定位于融合蛋白GnRH 的C 端和PE39KDEL的N 端之間，預(yù)期將可以大大提高免疫毒素穿透細(xì)胞生物膜的能力，增強(qiáng)對(duì)實(shí)體瘤的浸潤(rùn)性，從而減少免疫毒素融合蛋白的使用量，降低副作用，其效果是其它方法所無(wú)法比擬的。

此外，我們?cè)诖巳诤系鞍椎腘 端引入了6 個(gè)His 標(biāo)簽和Factor Xa 蛋白酶切位點(diǎn)，表達(dá)后的產(chǎn)物是含有6個(gè)His 標(biāo)簽和GnRH-PTD-PE39KDEL 的前體融合蛋白，F(xiàn)actor Xa 蛋白酶切割純化的重組蛋白N 端無(wú)任何來(lái)自載體的氨基酸，直接得到GnRH-PTD-PE39KDEL，從而使生產(chǎn)、純化工藝簡(jiǎn)化，為融合蛋白GnRH-PTDPE39KDEL 的大規(guī)模純化和功能研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］YOSHIOKA Y，TSUTSUMI Y，NAKAGAWA S，et al.Recent progress on tumor missile therapy and tumor vascular targeting therapy as a new approach［J］.Curr Vasc Pharmacol，2004，2(3):259 -270.

［2］FONSATTI E，ALTOMONTE M，ARSLAN P，et al.Endoglin (CD105):A Target for Anti-angiogenetic Cancer Therapy［J］.Current Drug Targets，2003，4(4):291 -296.

［3］BEATTY J D.Immunotherapy of colorectal cancer［J］.Cancer，1992，70(5):1425 -1433.

［4］吳昊，吳江，楊宇，等.攜帶信號(hào)肽NT4-GFP-穿膜肽Ant 融合基因的重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及意義［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，33(5):798 -802.

［5］BAKER R D，HOWL J，NICHOLL I D.A sychnological cell penetrating peptide mimic of p21WAF1/CIP1 is pro-apoptogenic［J］.Peptides，2007，28(4):731 -740.

［6］曲恒燕，孫曼霽.蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域內(nèi)在化機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.生命科學(xué)，2007，19(2):220 -223.

［7］CHAUHAN A，TIKOO A，KAPUR A K，et al .The Taming of the Cell Penetrating Domain of the HIV Tat:Myths and Realities［J］.J Control Release，2007，117(2):148 -162.

［8］祁志榮.PE 類重組免疫毒素的研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2006，34(1):50 -53.

［9］WOLF P，ELSASSER-BEILE U.Pseudomonas exotoxin A:From virulence factor to anti-cancer agent［J］.Int J Medical microbial，2009，299(3):161 -176.

［10］朱曉娟，馮振卿，朱進(jìn)，等.重組免疫毒素抗c-Met/ PE38KDEL 免疫毒素的構(gòu)建、表達(dá)及純化［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，29(7):920 -924.

［11］PORKKA K，LAAKKONEN P，HOFFMAN J A，et al.A fragment of the HMGN2 protein homes to the nuclei of tumor cells and tumor endothelial cells in vivo［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99(11):7444 -7449.

［12］劉新，魏洪濤，王國(guó)珍，等.EGF-PE40 重組毒素的構(gòu)建［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2006，10(7):736 -737.

［13］TAUPIAC M P，BEBIEN M，ALAMI M，et al.A deletion within the translocation domain of Pseudomonas exotoxin A enhances translocation efficiency and cytotoxicity concomitantly［J］.MOL Microbiol，1999，31(5):1385 -1393.

［14］鄧欣，KLUSSMANN S，李亙松，等.Spiegelmer NOX 1255 對(duì)LHRH-PE40 與HeLa 細(xì)胞上LHRH 受體結(jié)合的抑制作用［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2011，24(6):657 -664.

［15］張國(guó)利，何暢，吳廣謀，等.凍干重組人促黃體激素釋放激素-綠膿桿菌外毒素A 融合蛋白與不同細(xì)胞受體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2007，11(5):583 -587.

［16］張鴻，鄧欣，張國(guó)利.LHRH-PE40 對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 的作用［J］.解剖科學(xué)進(jìn)展，2010，16(3):261 -263.

［17］鄧欣，劉瑩，張國(guó)利，等.LHRH-PE40 對(duì)黑色素瘤A375 細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用［J］.中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2011，24(1):37 -40.

［18］KHAFAGY E S，MORISHITA M，ISOWA K，et al.Effect of cell penetrating peptides on the nasal absorption of insulin［J］.J Control Release，2009，133(2):103 -108.

［19］KIM D，JEON C，KIM J H，et al.Cytoplasmic transduction peptide (CTP):New approach for the delivery of biomolecules into cytoplasm in vitro and in vivo［J］.Exp Cell Res，2006，312(8):1277 -1288.