HIF-1α對口腔癌裸鼠移植瘤生長及其CEACAM1及VEGF-C表達的影響

戴銀花 戴群 鄒文英 楊瓊 劉子燕 董耀玉

HIF-1α對口腔癌裸鼠移植瘤生長及其CEACAM1及VEGF-C表達的影響

戴銀花 戴群 鄒文英 楊瓊 劉子燕 董耀玉

目的建立口腔癌裸鼠移植瘤模型，探究HIF-1α對CEACAM1及VEGF-C表達的影響機制。方法分別將Tca8113細胞、siRNA陰性對照Tca8113細胞、HIF-1α 干擾的Tca8113細胞接種到裸鼠的右腋部皮下，建立口腔癌裸鼠移植瘤模型。觀察各組裸鼠腫瘤生存情況和HIF-1α沉默對腫瘤的重量、體積抑制率的影響；采用ELISA方法檢測移植瘤組織中HIF-1α干擾后其蛋白表達量的變化；分別利用實時熒光定量PCR、蛋白印跡法檢測各組裸鼠移植瘤組織中HIF-1α、CEACAM1及VEGF-C mRNA和蛋白的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α干擾組中裸鼠移植瘤的體積及重量均顯著小于空白對照組，表明HIF-1α表達沉默顯著抑制移植瘤的生長，同時明顯下調(diào)CEACAM1及VEGF-C的表達。結(jié)論口腔癌中HIF-1α可能通過調(diào)節(jié)CEACAM1及VEGF-C的表達來影響腫瘤的生長。

口腔癌； 缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)； CEACAM1； VEGF-C

口腔癌是常發(fā)于頭頸部的一種惡性腫瘤，分化程度較高，更傾向于近位淋巴轉(zhuǎn)移，鮮有遠位轉(zhuǎn)移，同時其對放療和化療的敏感性較差，因此常伴有較高的死亡風險[1]。和所有實質(zhì)性惡性腫瘤一樣，腫瘤組織內(nèi)局部多處于缺氧狀態(tài)，缺氧是誘導腫瘤血管內(nèi)皮生長因子表達的重要因素，惡性腫瘤導致患者死亡的主要原因是腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，在此過程中，血管的新生至關(guān)重要，只有新生血管為腫瘤提供足夠能量，才有可能發(fā)生腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移[2]。缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)， 是一種廣泛存在于高等動物體內(nèi)的缺氧環(huán)境核轉(zhuǎn)錄因子，它調(diào)控一系列基因的表達。研究表明，HIF-1α在人體許多惡性腫瘤如口腔癌、胃癌、肺癌、胰腺癌等組織中均較正常組織呈現(xiàn)過度表達的狀態(tài)，缺氧環(huán)境下HIF-1α水平上調(diào)促使腫瘤細胞能耐受缺氧的微環(huán)境，這與惡性腫瘤的不良預(yù)后存在密切關(guān)聯(lián)[3]。

癌胚抗原相關(guān)黏附因子(CEACAM1)在腫瘤血管生成過程中具有重要作用，研究發(fā)現(xiàn)在慢性缺氧小鼠的微血管中，CEACAM1的表達明顯上調(diào)，同時伴有HIF-1α與多種促血管生成因子表達的上調(diào)[4]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)， 是一種在腫瘤血管新生的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的細胞因子，能有效、特異地誘導血管的新生，它不僅具有促進內(nèi)皮細胞分裂增殖和血管構(gòu)建的功能，還能促進微血管通透性增加，加速腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[5]。VEGF-C是新發(fā)現(xiàn)的VEGF家族成員，是內(nèi)皮細胞功能調(diào)節(jié)及腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)因子之一[6]。形成腫瘤的同時會造成缺氧的微環(huán)境，缺氧的情況下會誘導腫瘤細胞形成新的血管并發(fā)生糖酵解[7]，從而導致與之相關(guān)的某些生長因子及腫瘤侵襲相關(guān)的蛋白表達上調(diào)。而HIF-1α已被證實是VEGF基因上游的一種關(guān)鍵性的表達調(diào)控因子，它正相關(guān)地調(diào)控VEGF的轉(zhuǎn)錄，并且增加VEGF mRNA的穩(wěn)定性，CEACAM1則在腫瘤發(fā)生的不同時期表達情況有所不同[8]。因此VEGF-C和CEACAM1成為新的潛在指標。本研究利用口腔癌細胞成功建立裸鼠移植瘤模型，以探究 HIF-1α對口腔癌生長的及其對CEACAM1及VEGF-C表達的影響。

1 材料與方法

1.1 舌癌Tca8113細胞系的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人舌鱗狀細胞癌細胞系Tca8113購自美國ATCC細胞庫，培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)液(內(nèi)含10%胎牛血清)，放置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱。細胞均勻地鋪滿瓶底時，使用0.25%胰蛋白酶消化，而后接種于6 孔板中，接種的細胞濃度為2×105個/孔，37 ℃、5%CO2條件下，孵育過夜。具有互補序列的能編碼短發(fā)夾(shRNA)雙鏈寡核苷酸由深圳華大基因研究所設(shè)計并合成。HIF-1α-siRNA靶序列：5'-AACCCACACATATCCACCTCT-3'，陰性對照siRNA的靶序列：5'-AAGCTTCATAAGGCGCATAGC-3'。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000和siRNA 按2.5 μl∶1 μg的比例配置成混懸液，分別加入待轉(zhuǎn)染細胞的6孔板中，輕晃搖勻后，置于孵箱中孵育，轉(zhuǎn)染后換含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 建立口腔癌裸鼠移植瘤模型

BALB/C(nu/nu)裸鼠，6～8 周齡，體重約為15～20 g，雌雄對半，共30 只，由中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供，在SPF環(huán)境下的層流室中飼養(yǎng)。隨機分為3 組，每組10 只。分別為空白對照組、siRNA陰性對照組以及HIF-1α干擾組即實驗組。待細胞生長至對數(shù)期，用0.25%胰蛋白酶消化，制成細胞懸液，用PBS調(diào)整各組細胞密度至5×107/ml。之后分別將Tca8113細胞、陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染的Tca8113細胞、HIF-1α-siRNA轉(zhuǎn)染的Tca8113細胞接種到各組裸鼠的右腋部皮下，接種的細胞濃度為 1×107個。給予飲用水和常規(guī)飼喂，在接種后3 周處死各組裸鼠。

1.3 觀察移植瘤的生存狀態(tài)

觀察各組裸鼠移植口腔癌細胞后腫瘤每天的生存狀態(tài)，在接種后的3 周處死各組裸鼠，利用游標卡尺測定分離出的移植瘤的長徑和短徑，用于計算腫瘤的體積，同時對腫瘤進行稱重。用于計算腫瘤的體積公式為：體積(V)=1/2(長徑×短徑2)；用于計算HIF-1α-siRNA對移植瘤重量抑制率的公式：重量抑制率=(對照組腫瘤重量-實驗組腫瘤重量)/對照組腫瘤重量×100%；用于計算HIF-1α-siRNA對移植瘤對體積抑制率的公式，體積抑制率=(對照組腫瘤體積-實驗組腫瘤體積)/對照組腫瘤體積×100%。

1.4 ELISA方法檢測各組移植瘤中HIF-1α的含量

分離各組裸鼠的移植瘤，切碎分割成小塊，取50 mg組織加入1 ml生理鹽水于提前預(yù)冷的研缽中研磨至勻漿液，1 000 g下離心10 min收集上清液(放置于冰上)。HIF-1α含量的測定參照上海凱博生化試劑有限公司試劑說明書。最后使用酶標儀測定波長為450 nm處96孔板中各孔的A值，以計算各組移植瘤中HIF-1α的含量。

1.5 HIF-1α、CEACAM1及VEGF-C mRNA在各組裸鼠移植瘤中的表達

分離切割各組腫瘤組織，取其中的50 mg， Trizol法提取組織中的總mRNA。QPCR的方法檢測各組移植瘤中HIF-1α、CEACAM1及VEGF-C mRNA的表達情況，以GAPDH為內(nèi)參，HIF-1α、CEACAM1及VEGF-C的引物序列如表 1所示。反應(yīng)體系中總體積為20 μl，其中包含有cDNA模板(終濃度：500 ng)，正反向引物(終濃度為250 nmol/L)以及1 μl的10×SYBR Green染料(購自Takara，大連)。HIF-1α反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min，94 ℃ 45 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40 個循環(huán)，72 ℃ 5 min。CEACAM1的反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，34 個循環(huán)，72 ℃ 5 min；VEGF-C的反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，28 個循環(huán)，72 ℃ 5 min。熒光定量儀器為美國BIO-RAD公司CFX-96實時熒光定量PCR儀。

1.6 HIF-1α、CEACAM1及VEGF-C蛋白在各組裸鼠移植瘤中的表達

表 1 QPCR檢測HIF-1α、CEACAM1及VEGF-C mRNA引物序列

Tab 1 The primers of HIF-1α, CEACAM1 and VEGF-C mRNA for QPCR

基因名稱引物序列(5'-3')HIF-1α正向:GGAAGTGGCAACTGACAAGCTCATAA反向:ACACACTGTGTCCAGTTAGT-TCAAACTGAGCEACAM1正向:CAGTCACCTTGAATGTCACCTATG反向:GTTCCATTGATAAGCCAGGAGTACVEGF-C正向:CAGTTACGGTCTGTGTCCAGTGTAG反向:GGACACATGGAGGTTTAAAGAAGGAPDH正向:ACAGTCCATGCCATCACTGCC反向:GCCTGCTTCACCACCTTCTTG

Western blot法分析HIF-1α、CEACAM1及VEGF-C蛋白表達。分離切割各組裸鼠中獲取的移植瘤組織，各取50 mg腫瘤組織加入勻漿器，加入1 ml的細胞裂解液，在冰上進行勻漿。勻漿后的液體在室溫環(huán)境下靜置1 h，而后離心(4 ℃、12 000 g，15 min)，取上清液用于蛋白電泳。在SDS-PAGE中分離蛋白后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用5%脫脂奶粉PBS-T封閉1 h，一抗稀釋HIF-1α(1∶100)，CEACAM1及VEGF-C(1∶50)，在4 ℃環(huán)境下反應(yīng)過夜。洗膜時采用PBS-T 10 min，重復(fù)操作3 次，二抗采用HRP標記的兔抗山羊二抗(1∶1 000稀釋)、山羊抗鼠二抗(1∶1 000稀釋)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，之后進行DAB染色。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 各組裸鼠移植瘤生存狀態(tài)及HIF-1α干擾對腫瘤體積、重量的抑制率

整個實驗過程中裸鼠的生長、飲食及活動情況均良好，無實驗動物死亡?？谇话┞闶笠浦擦瞿Ｐ徒⒑?周處死各組裸鼠。實驗結(jié)束時，空白對照組腫瘤的體積為(280±37) mm3，陰性對照組為(285±40) mm3，HIF-1α干擾組為(180±30) mm3，陰性對照組與干擾組相比無顯著差異，HIF-1α干擾組與對照組相比腫瘤體積抑制率為35.7%；空白對照組腫瘤的重量為(0.80±0.17) g，陰性對照組為(0.79±0.08) g，HIF-1α干擾組為(0.48±0.07) g，HIF-1α干擾組與對照組相比腫瘤重量抑制率為40.0%；HIF-1α干擾組的體積及重量均顯著小于空白對照組(P<0.05)(表 2，圖 1)。

表 2 各組裸鼠移植瘤的體積(mm3)、重量(g)及HIF-1α siRNA對移植瘤體積和重量的抑制率(%)

注： ①與空白對照組比較，P<0.05

圖 1 各組裸鼠剝離的移植瘤比對

2.2 ELISA方法測定HIF-1α含量

ELISA方法檢測各組裸鼠移植瘤組織中HIF-1α蛋白含量，結(jié)果顯示，HIF-1α蛋白在空白對照組和陰性對照組中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)； HIF-1α干擾組與對照組相比，HIF-1α表達量顯著下降(P<0.05)，空白對照組與HIF-1α干擾組的差異具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，說明HIF-1α siRNA顯著抑制HIF-1α 蛋白表達(圖 2)。

圖 2 各組移植瘤組織中HIF-1α含量

Fig 2 The protein expression level of HIF-1α in the transplantated tumor

2.3 實時熒光定量PCR結(jié)果分析

采用實時熒光定量PCR的方法檢測各組裸鼠移植瘤組織中HIF-1α、CEACAM1及VEGF-C mRNA表達，結(jié)果顯示，HIF-1α、CEACAM1及VEGF-C mRNA在空白對照組和陰性對照組中的表達，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)； HIF-1α siRNA顯著下調(diào)HIF-1α mRNA表達，空白對照組與HIF-1α干擾組的組間差異比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，說明HIF-1α siRNA顯著抑制HIF-1α mRNA的表達；同時，HIF-1α干擾組中CEACAM1及VEGF-C mRNA的表達與對照組相比，均顯著下降，說明HIF-1α調(diào)控CEACAM1及VEGF-C表達，并與之呈正相關(guān)(圖 3)。

圖 3 HIF-1α、CEACAM1及VEGF-C mRNA在各組移植瘤中的表達

Fig 3 The mRNA expression level of HIF-1α, CEACAM1 and VEGF-C in the ransplantated tumor

2.4 Western blot結(jié)果分析

Western blot 檢測裸鼠移植瘤組織中HIF-1α、CEACAM1及VEGF-C蛋白的表達，結(jié)果顯示，HIF-1α、CEACAM1及VEGF-C蛋白在HIF-1α干擾組中的表達水平均顯著低于空白對照組和陰性對照組，且在空白對照組和陰性對照組的表達差異無統(tǒng)計學意義(圖 4)，說明HIF-1α下調(diào)時，誘導CEACAM1及VEGF-C蛋白表達下調(diào)。

圖 4 HIF-1α、CEACAM1及VEGF-C蛋白在各組移植瘤中的表達

Fig 4 The protein expression level of HIF-1α, CEACAM1 and VEGF-C in transplantated tumor

3 討 論

本研究中分別將Tca8113細胞、陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染的Tca8113細胞、HIF-1α-siRNA轉(zhuǎn)染的Tca8113細胞分別接種到裸鼠的右腋部皮下，建立口腔癌移植瘤裸鼠模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α干擾組裸鼠移植瘤的體積及重量均顯著小于空白對照組，表明HIF-1α表達沉默能顯著抑制移植瘤的生長，同時明顯下調(diào)CEACAM1及VEGF-C的表達。發(fā)生惡性腫瘤時造成缺氧的微環(huán)境，缺氧會誘導腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，不僅增強腫瘤細胞對放射治療或是藥物治療、甚至是放化療聯(lián)合治療的耐受能力，而且能促進腫瘤的生長和侵襲，因此，腫瘤缺氧的微環(huán)境與腫瘤不良預(yù)后存在密切聯(lián)系[9]。發(fā)生這些現(xiàn)象的根本原因在于一系列基因和蛋白的表達，HIF-1α是缺氧誘導基因表達的中心調(diào)節(jié)因子，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。有研究表明，在多種惡性腫瘤組織中HIF-1α呈現(xiàn)過度表達，且它的表達受多種腫瘤基因及多種因子的調(diào)節(jié)，Alves等[11]發(fā)現(xiàn)HIF-1α在口腔癌中高表達，且增加口腔癌發(fā)生的風險。周沐青[12]等觀察VEGF-C和CEACAM1在消化道癌組織和癌旁組織的表達情況，探究其表達和腫瘤分期的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃腸道腫瘤中的VEGF-C和CEACAM1表達量與腫瘤分期有關(guān)，預(yù)示VEGF-C mRNA在癌組織中的表達水平可作為惡性腫瘤臨床分子診斷的預(yù)測指標。

HIF-1α過度表達情況下能激活包括VEGF-C和CEACAM1等刺激血管生成的調(diào)控因子的轉(zhuǎn)錄和翻譯[13]，從而促進腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)在食管鱗狀細胞癌中HIF-1α與VEGF均呈現(xiàn)過度表達，且HIF-1α的表達與VEGF呈正相關(guān)，本研究中沉默HIF-1α表達后，VEGF-C表達亦受到抑制，與過去的研究結(jié)果相符。CEACAM1能抑制腫瘤生長和上皮細胞的增殖，誘導上皮細胞的凋亡，抑制T細胞的增殖和活化[15]，促進血管生成[16]。最初的研究發(fā)現(xiàn)CEACAM1在一些上皮來源的惡性腫瘤中表達明顯低于正常組織，因此被認為是一種腫瘤抑制因子，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)CEACAM1的表達與癌癥的分級相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示抑制HIF-1α可以下調(diào)血管生成因子CEACAM1和促血管內(nèi)皮生成因子VEGF-C的表達，并抑制移植瘤的生長。發(fā)生這種現(xiàn)象的原因可能在于HIF-1α沉默抑制了腫瘤組織中過表達的HIF-1α對腫瘤血管生成的促進作用，減弱腫瘤增殖活力，形成了新的微環(huán)境從而抑制腫瘤組織缺氧環(huán)境下的惡性轉(zhuǎn)化。我們推測在口腔癌中HIF-1α可能通過調(diào)節(jié)CEACAM1及VEGF-C表達影響腫瘤內(nèi)的血管生成和成瘤過程。

[1] Kademani D. Oral cancer[J]. Mayo Clin Proc, 2007, 82(7): 878-887.

[2] Cvetkovic D, Movsas B, Dicker AP, et al. Increased hypoxia correlates with increased expression of the angiogenesis marker vascular endothelial growth factor in human prostate cancer[J]. Urology, 2001, 57(4): 821-825.

[3] Brennan PA, Mackenzie N, Quintero M. Hypoxia-inducible factor 1alpha in oral cancer[J]. J Oral Pathol Med, 2005, 34(7): 385-389.

[4] 鮑永霞， 呂福禎， 馬迎軍. 低氧對小鼠缺氧誘導因子-1α、P53和血管內(nèi)皮生長因子表達的影響[J]. 中國康復(fù)醫(yī)學雜志, 2006, 21(5): 408-411.

[5] 張慶元， 李金榮， 李武修， 等. 口腔鱗狀細胞癌血管內(nèi)皮細胞生長因子的表達[J]. 實用口腔醫(yī)學雜志, 2003, 19(4): 362-365.

[6] Joukov V, Pajusola K, Kaipainen A, et al. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt4(VEGFR-3) and KDR(VEGFR-2) receptor tyrosine kinases[J]. EMBO J, 1996, 15(2): 290-298.

[7] 張偉鋒.RNA干擾HIF-1α對食管鱗癌細胞Eca-109糖酵解相關(guān)基因表達的影響[D]. 江蘇：南京醫(yī)科大學, 2010.

[8] 鄧鎖琴， 靳元， 陳公琰. 癌胚抗原粘附分子1在肺癌組織中的表達及其臨床意義[J]. 齊齊哈爾醫(yī)學院學報, 2010, 31(15): 2357-2358.

[9] Marton I, Knezevic F, Ramic S, et al. Immunohistochemical expression and prognostic significance of HIF-1alpha and VEGF-C in neuroendocrine breast cancer[J]. Anticancer Res, 2012, 32(12): 5227-5232.

[10]Thairu, Munga N. Mechanisms of colorectal cancer pathogenesis: Role of hypoxia[D]. London: Imperial College London,2013.

[11]Alves LR, Fraga CA, Oliveira MV, et al. High HIF-1α expression genotypes increase odds ratio of oral cancer[J]. Head Neck Oncol, 2012, 4(5): 87.

[12]周沐青， 劉鷖雯， 王穎智， 等. 熒光定量PCR檢測VEGF-C、CEACAM-1在胃腸腫瘤中的表達及意義[J]. 檢驗醫(yī)學, 2011, 26(5): 299-305.

[13]Mohamed KM, Le A, Hai D, et al. Correlation between VEGF and HIF-1α expression in human oral squamous cell carcinoma[J]. Exp Mol Pathol, 2004, 76(2): 143-152.

[14]Zhang H, Wang Y, Xu N, et al. Expression and clinical significance of HIF-1α,VEGF and Survivin in esophageal squamous cell carcinoma[J]. Chinese-German J Clin Oncol, 2007, 6(4): 339-344.

[15]Nagaishi T, Iijima H, Nakajima A, et al. Role of CEACAM1 as a regulator of T cells[J]. Ann N Y Acad Sci, 2006, 1072: 155-175.

[16]Lu R, Kujawski M, Pan H, et al. Tumor angiogenesis mediated by myeloid cells is negatively regulated by CEACAM1[J]. Cancer Res, 2012, 72(9): 2239-2250.

TheeffectsofHIF-1αonthegrowthoftransplantedoralcancerinnudemiceandontheexpressionofCEACAM1andVEGF-Cinthetumor

DAIYinhua,DAIQun,ZOUWenying,YANGQiong,LIUZiyan,DONGYaoyu.

330006,DepartmentofGeneraldentistry,StomatologicalHospitalAffiliatedofNanchanguniversity;TheKeyLaboratoryofOralBiomedicine,JiangxiProvince

Objective: To explore the effects of HIF-1α on the growth of transplanted oral cancer and on the expression of CEACAM1 and VEGF-C in the tumor.MethodsNude mouse model of oral cancer was established by transplantation of Tca8113 cells respectively treated by HIF-1α siRNA and negative control siRNA subcutaneously into right axillary region of nude mice. 3 weeks after transplantation the mice were sacrificed, the tumor volum and weight were measured. The tumor tissue was examined by ELISA method for the detection HIF-1α protein expression, by real-time quantitative PCR and western blot for the detection of mRNA and protein expression of HIF-1α, CEACAM1 and VEGF-C respectively.ResultsThe volume and weight of the transplanted tumor in HIF-1α siRNA group were significantly less than those in the control group(P<0.05), CEACAM1 and VEGF-C mRNA and protein were down-regulate in HIF-1α siRNA group(P<0.05).ConclusionHIF-1α expression is positively related to the expression of CEACAM1 and VEGF-C in the regulation of oral tumor growth.

Oralcancer；Hypoxiainduciblefactor1α(HIF-1α)；CEACAM1；VEGF-C

330006， 南昌大學附屬口腔醫(yī)院綜合科·江西省口腔生物醫(yī)學重點實驗室

戴群 E-mail: 512968304@qq.com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.04.007

(收稿： 2016-12-02 修回： 2017-03-26)