五倍子抗口腔致病菌活性物質(zhì)篩選及其體外抑菌效果評價(jià)

劉玉梅 徐靜舒

五倍子抗口腔致病菌活性物質(zhì)篩選及其體外抑菌效果評價(jià)

劉玉梅 徐靜舒

目的研究3 種五倍子提取物對6 種常見口腔致病菌生長、代謝的影響。方法通過一系列提取分離純化，從五倍子中篩選出3 種活性單體,即沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子乙酯。采用液體稀釋法研究這3 種五倍子活性單體對變形鏈球菌、粘性放線菌、牙齦卟啉單胞菌、糞腸球菌、具核梭桿菌及白色念珠菌生長、代謝的影響。結(jié)果沒食子酸對6 種細(xì)菌的MIC值(mg/ml)為2.5～5、沒食子酸甲酯為2.0～4.0，沒食子酸乙酯為1.25～2.5，濃度為1 mg/ml時(shí)，3 種提取物均能抑制這6 種口腔致病菌生長、產(chǎn)酸及產(chǎn)胞外多糖。且沒食子酸乙酯作用最強(qiáng)。結(jié)論沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯在較低濃度下對口腔主要致病菌的生長、酸代謝和糖代謝都有一定的抑制作用。

口腔致病菌; 沒食子酸; 沒食子酸甲酯; 沒食子酸乙酯

五倍子，為同翅目蚜蟲科的角倍蚜或倍蛋蚜雌蟲寄生于漆樹科植物“鹽膚木”及其同屬其他植物的嫩葉或葉柄，刺傷而生成的一種囊狀聚生物蟲癭，經(jīng)烘焙干燥后所得。其化學(xué)成分主要為單寧酸(鞣酸)。已有實(shí)驗(yàn)表明，五倍子對口腔生物膜細(xì)菌具有抑制和殺滅作用,能降低細(xì)菌生物膜的活性[1-4]。本實(shí)驗(yàn)通過乙醇水溶液提取五倍子后得到的提取物利用正相硅膠柱色譜進(jìn)行粗分段。得到的粗分段物質(zhì)通過牛津杯法抑菌試驗(yàn)篩選具有抑菌活性的組分。篩選出的活性組分，進(jìn)一步通過反相硅膠柱色譜，凝膠柱色譜，高效液相色譜，重結(jié)晶等分離純化手段得到活性單體。利用核磁共振、質(zhì)譜分析得出3 種活性單體分別為沒食子酸、沒食子甲酯及沒食子酸乙酯。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究了五倍子活性單體對口腔優(yōu)勢菌變形鏈球菌、粘性放線菌、牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、糞腸球菌生長、代謝的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

五倍子(鹽津，云南)，65%乙醇，石油醚，乙酸乙酯，氯仿，甲醇，薄層板，D101大孔樹脂，硅膠；牛心腦浸液肉湯培養(yǎng)基及瓊脂培養(yǎng)基，變形鏈球菌UA159菌株,粘性放線菌(Av)菌株，牙齦卟啉單胞菌(Pg)，具核梭桿菌(Fn)，糞腸球菌(Ef)(均購于武漢大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院)；中藥粉碎機(jī)，低溫冷卻液循環(huán)泵(DL-400)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R1001-W)，循環(huán)水式多用真空泵(SHB-B95A),水浴鍋(WB-2000)，制備型高效液相色譜儀；恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 五倍子的提取和分離 采用65%乙醇加熱回流提取五倍子，并利用硅膠柱、凝膠柱以及制備型高效液相色譜柱分離純化以得到純化合物。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備 BHI 溶液： BHI粉用三蒸水搖勻溶解后置高壓滅菌鍋121 ℃、120 Kb下滅菌20 min。取出后待溫度降至40 ℃以下使用。

BHI 平板： BHI瓊脂粉用三蒸水搖勻溶解后于121 ℃下高溫高壓滅菌20 min 后鋪板，放入4 ℃冰箱中備用。

1.2.3 菌株及菌液的制備 菌株復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)，取第3 代菌株接種于BHI瓊脂斜面，于 37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后置4 ℃冰箱中保存。取一支BHI瓊脂斜面，用PBS溶液反復(fù)吹吸，洗下菌苔。用電動(dòng)混合器混合(振蕩)20 s， 使細(xì)菌懸浮均勻后，用PBS稀釋菌液，使菌液的終濃度為108CFU/ml 備用。

1.2.4 牛津杯法篩選五倍子抗口腔致病菌活性物質(zhì)

(1)倒平板：將瓊脂培養(yǎng)基高溫高壓滅菌后，在超凈工作臺(tái)上倒在培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿約20 ml，凝固;(2)標(biāo)記：菌種、牛津杯擺放位置、藥物及其濃度;(3)制備菌懸液：用PBS洗下試管內(nèi)的菌苔并稀釋;(4)菌液涂布：吸取200 μl菌液入平板表面，用無菌三角推棒將菌液涂布均勻;(5)擺放牛津杯：在培養(yǎng)基表面垂直擺放牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無空隙。一個(gè)平板擺放5 個(gè)牛津杯;(6)加入待檢藥液：將五倍子提取物各組分用水溶解后制成濃度為10 mg/ml的藥液，用移液槍吸取100 μl加入牛津杯中在杯中;(7)孵育：厭氧盒中37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。

1.2.5 五倍子活性物質(zhì)對6 種口腔致病的MIC值測定 采用厭氧菌藥物敏感試驗(yàn)-微量稀釋法:(1)藥物試驗(yàn)液的配制：將五倍子提取物各組分用水溶解后制成高濃度的貯存液;(2)將五倍子活性單體貯存液加入無菌的96 孔板中，采用倍比稀釋法，用無菌BHI肉湯培養(yǎng)基對倍稀釋各組分貯存液;(3)倍比稀釋后，在96孔板中分別加入U(xiǎn)A159、Pg、Fn、Ef、 粘性放線菌(Av)及白色念珠菌(Ca)菌懸液共培養(yǎng)24 h后通過酶標(biāo)儀測定A值測定出活性單體對這6 種菌的MIC值。

1.2.6 五倍子活性物質(zhì)對6 種口腔致病菌產(chǎn)酸的影響 選取MIC值以下4 個(gè)濃度梯度配制成含1%蔗糖的BHI 液體培養(yǎng)基，調(diào)定初始pH 7.4，按菌液與BHI液體培養(yǎng)基1/10(V/V)比例分別接種6 種細(xì)菌， 37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。以PH計(jì)測定培養(yǎng)物上清液的pH 值，并計(jì)算pH 的變化值ΔpH(初始pH-終末pH)。實(shí)驗(yàn)共分5 組，即4 個(gè)不同濃度的實(shí)驗(yàn)組與1 個(gè)不含藥物的空白對照組，每組4 個(gè)平行管。

1.2.7 五倍子活性物質(zhì)對6 種口腔致病菌產(chǎn)胞外多糖的影響 選取MIC值以下4 個(gè)濃度梯度配制成含1%葡萄糖的BHI 液體培養(yǎng)基，按菌液與BHI液體培養(yǎng)基1/10(V/V)比例分別接種6 種細(xì)菌， 37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后用3，5一二硝基水楊酸法(DNS法)測培養(yǎng)液中多糖含量。

1.2.7.1 DNS的配制 將3.25 g 3， 5-二硝基水楊酸加于含有少量水的燒杯中，攪拌溶解后加入162.5 ml 2 mol NaOH溶液，混合均勻后再加入丙三醇22.5 g，邊加邊攪拌，混勻后加蒸餾水定容至500 ml，貯存于棕色瓶中1 周后穩(wěn)定，備用。

1.2.7.2 1 mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制 準(zhǔn)確稱取80 ℃烘于至恒重的分析純葡萄糖100 mg，置于小燒杯中，加少量純凈水溶解后轉(zhuǎn)移到100 ml容量瓶中，用純凈水定容至100 ml， 混合均勻，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取6 支20 ml試管，按表 1分別加入1 mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液及蒸餾水。

表 1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將各管溶液混合均勻，與沸水浴中加熱5 min，取出后立即用冷水冷卻至室溫，再向每只試管中加入6.5 ml蒸餾水，搖勻，用紫外分光光度計(jì)于波長540 nm處測定吸光度。以葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖 1)。

圖 1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.7.4 樣品液的制備 培養(yǎng)液以10 000 r/min 離心10 min, 沉淀物用2 ml 蒸餾水洗滌、離心2 次, 水洗后的沉淀物加入0. 1 mol/L NaOH 2 ml 洗滌、離心3 次, 合并上清液作為樣品。將上清液均分為2 份，一份稀釋后用于測還原糖，另一份用6 mol/L鹽酸溶液酸水解后測總糖。胞外多糖含量即為測得的總糖減去還原糖含量。

2 結(jié) 果

2.1 從五倍子提取物中篩選出的抗口腔致病菌的活性物質(zhì)

利用牛津杯法抑菌試驗(yàn)檢與五倍子分離純化實(shí)驗(yàn)相結(jié)合從五倍子中篩選出3 種活性單體， 分別為沒食子酸、沒食子酸甲酯及沒食子酸乙酯。

2.2 五倍子活性物質(zhì)對6 種口腔致病菌的MIC值

通過微量稀釋法得出3 種五倍子活性物質(zhì)對6 種口腔致病菌的MIC值結(jié)果見表 2。

2.3 五倍子活性物質(zhì)對6 種口腔致病菌產(chǎn)酸的影響

通過測定培養(yǎng)前后培養(yǎng)液的ΔpH值，得出藥物對6 種口腔致病菌產(chǎn)酸的結(jié)果見表 3。

3 種活性藥物均可抑制6 種口腔致病菌產(chǎn)酸，且與藥物濃度正相關(guān)，藥物濃度越大，其抑制菌產(chǎn)酸的能力就越強(qiáng)(圖 2)。

表 2 藥物對6 種口腔致病菌的MIC值(mg/ml)

Tab 2 MIC values of the extracts for 6 oral pathogens (mg/ml)

2.4 五倍子活性物質(zhì)對6 種菌產(chǎn)胞外多糖的影響

這3 種五倍子活性藥物均可一定程度上抑制6 種口腔致病菌產(chǎn)胞外多糖，且與藥物濃度有一定相關(guān)性(圖 3，表4)。

圖 2 3 種提取物及洗必泰對各種細(xì)菌產(chǎn)酸的影響

表 4 藥物對6 種口腔致病菌產(chǎn)胞外多糖的影響

3 討 論

口腔致病菌致齲毒力因子主要表現(xiàn)在其對牙面的黏附和利用碳水化合物產(chǎn)生多糖以及產(chǎn)酸、耐酸。細(xì)菌合成細(xì)胞外多糖的能力與菌斑的形成及其致齲性有密切的關(guān)系。細(xì)胞外多糖,參與菌斑基質(zhì)的組成, 促進(jìn)細(xì)菌的黏附、 聚集, 加速菌斑的形成。同時(shí)還具有生物屏障作用,使菌斑內(nèi)細(xì)菌代謝產(chǎn)物如有機(jī)酸等不易擴(kuò)散, 導(dǎo)致pH 值下降。它也可作為儲(chǔ)能形式, 在外源性糖缺乏時(shí), 降解成單糖而放能、產(chǎn)酸。席清平[5]等研究發(fā)現(xiàn)五倍子水提取物對菌斑生物膜內(nèi)細(xì)菌具有良好的抑制作用。趙今[6]等研究表明不同提取組分對變形鏈球菌、血鏈球菌、乳酸桿菌、放線菌、粘稠放線菌5 種口腔浮游細(xì)菌均有良好的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)通過研究從五倍子提取物中分離純化得到的活性單體沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯對6 種口腔致病菌生長、產(chǎn)酸及產(chǎn)胞外多糖的影響，發(fā)現(xiàn)這3 種化合物在較低濃度下即可抑制口腔致病菌的生長，這與Zhao 等[2,7]研究結(jié)果一致。且這3 種五倍子活性單體在MIC 濃度以下即能夠有效抑制這6 種口腔致病菌產(chǎn)酸能力及產(chǎn)胞外多糖的能力。這與Shao 等[4]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。Huang 等[8]也證實(shí)沒食子酸能抑制菌斑生物膜中細(xì)菌的產(chǎn)酸。實(shí)驗(yàn)顯示，沒食子酸乙酯對粘性放線菌、白色念珠菌產(chǎn)酸的抑制作用強(qiáng)于沒食子酸及沒食子酸甲酯。沒食子酸甲酯及乙酯對牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)酸的抑制作用強(qiáng)于沒食子酸。實(shí)驗(yàn)表明，沒食子酸、沒食子酸甲酯對抑制白色念珠菌產(chǎn)胞外多糖的能力弱于沒食子酸乙酯。沒食子酸甲酯、乙酯對粘性放線菌產(chǎn)胞外多糖的抑制作用強(qiáng)于沒食子酸。沒食子酸乙酯對變形鏈球菌產(chǎn)胞外多糖抑制作用顯著，相同濃度下，其抑制作用明顯強(qiáng)于沒食子酸及沒食子酸甲酯。綜上所述，沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯均能抑制口腔致病菌生長、代謝，且沒食子酸乙酯抑制作用最強(qiáng)。

圖 3 3 種提取物及洗必泰對各菌產(chǎn)胞外多糖的影響

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Screeningandevaluationoftheactivesubstanceofgallnutagainstoralcavitypathogens

LIUYumei1,XUJingshu2.

1. 650032,KunmingUniversityofScienceandTechnologyAffiliatedHospital,China; 2.FirstPeople'sHospitalofYunnanProvince，Kunming

Objective: To study the effects of 3 extracts from Chinese gall on the growth and metabolism of 6 kinds of oral bacteria.MethodsThrough a series of extraction and purification, 3 active monomer, gallnut extract gallic acid, methyl gallate and gallic acid ethyl ester were selected.StreptococcusmutansUA159(UA159),Actinomycesviscosus(Av),Porphyromonasgingivalis(Pg),Enterococcusfaecalis(Ef),Fusobacteriumnucleatum(Fn) andCandidaalbicans(Ca) were treated by the extracts respectively, The growth and metabolism of the becteria were studied by liguid dilution method.ResultsThe MIC(mg/ml) of Gallic acid anainst the bacteria was 2.5-5, methyl gallate 2.0-4.0 and gallic acid ethyl ester 1.25-2.5. The extracts at 1 mg/ml could inhibit the growth, acid production and extracellular polysaccharides of the 6 oral pathogens. And ethyl gallate showed the strongest effects.ConclusionGallic acid and methyl gallate and ethyl gallate at low concentration may inhibit the growth, acid metabolism and glucose metabolism of oral bacteria.

Oralpathogens;Gallicacid;Methylgallate;Gallicacidethylester

國家自然科學(xué)基金(編號： 81360600)

650032, 昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院(劉玉梅); 云南省第一人民醫(yī)院(徐靜舒)

徐靜舒 E-mail： 15925203880@139.com

R781.1

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.04.002

(收稿： 2016-09-15 修回： 2017-01-11)