84K楊愈傷組織再生體系和直接分化再生體系遺傳轉(zhuǎn)化的比較性研究

王麗娜 王玉成 楊傳平

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

84K楊愈傷組織再生體系和直接分化再生體系遺傳轉(zhuǎn)化的比較性研究

王麗娜 王玉成 楊傳平*

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

植物轉(zhuǎn)基因必須以建立良好的植物轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)為基礎(chǔ),而良好的受體系統(tǒng)必須以具有高頻率的轉(zhuǎn)化率及較強(qiáng)的再生能力為前提。實(shí)驗(yàn)以84K楊葉片為材料研究其在不同培養(yǎng)條件、不同種類及濃度的植物激素對(duì)其脫分化及再分化的影響，并建立了兩種成熟的組織再生系統(tǒng)，得出組織培養(yǎng)體系與遺傳轉(zhuǎn)化體系的受體系統(tǒng)在激素配比方面存在一定差距，所以在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了PCK1、PCK2兩個(gè)基因的愈傷途徑和不定芽途徑途徑的遺傳轉(zhuǎn)化，并對(duì)兩種遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了對(duì)比性分析并總結(jié)出兩種體系的優(yōu)缺點(diǎn)。

84K楊；愈傷組織；直接分化；遺傳轉(zhuǎn)化

自從Parson等人[1]在1986年證實(shí)了楊樹可以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化以來，以楊樹為受體的林木基因工程取得了很大的進(jìn)展，楊樹組織培養(yǎng)技術(shù)的廣泛應(yīng)用及深入研究，對(duì)植物細(xì)胞的分化與脫分化，組織、器官的形態(tài)發(fā)生與建成，各種代謝調(diào)節(jié)機(jī)理及基因表達(dá)和調(diào)控規(guī)律等眾多基礎(chǔ)理論問題具有重要的意義，并能從多條途徑直接服務(wù)于生產(chǎn)實(shí)際[2]。84K楊葉片良好的植株再生系統(tǒng)的建立以及實(shí)驗(yàn)室在此基礎(chǔ)上開展的諸多基因轉(zhuǎn)化84K楊(Populusalba×Populusglandulosa)的研究，不僅可為進(jìn)一步研究發(fā)育生理、細(xì)胞分化以及形態(tài)建成等許多基礎(chǔ)理論問題提供新的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，而且為利用現(xiàn)代生物技術(shù)改良楊樹品種、加速育種進(jìn)程、促進(jìn)優(yōu)良種苗的快速繁殖與利用等奠定了基礎(chǔ)[3],本研究采用兩種轉(zhuǎn)基因方法結(jié)合使用進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化體系的規(guī)律總結(jié)，旨在比較直接分化的遺傳體系和脫分化、再分化相結(jié)合的遺傳轉(zhuǎn)化體系的轉(zhuǎn)化規(guī)律，建立兩種高效表達(dá)、高效轉(zhuǎn)化、穩(wěn)定遺傳的適合楊樹派系的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)基地種植的84K楊(Populusalba×Populusglandulosa)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 外植體脫毒的方法

剪取84K楊枝條進(jìn)行水培，取萌發(fā)的嫩枝作為外植體，置于自來水下沖洗1 h，去除表面污垢，在超凈臺(tái)上將枝條剪成2～4 cm長(zhǎng)、至少帶一個(gè)葉芽的莖段[4]。用酒精浸泡30 s，無菌水漂洗2～3次，用0.2%升汞溶液浸泡5 min[5]，期間不斷攪動(dòng)，之后用無菌水漂洗4～5次，最后用無菌濾紙吸干，將脫毒后的莖段置于MS培養(yǎng)基接種并擴(kuò)繁。

1.2.2愈傷組織再生體系和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的愈傷組織再生體系的主要方法

愈傷組織再生系統(tǒng)利用培養(yǎng)條件的不同將脫分化與再分化過程分開(光照與黑暗)，愈傷誘導(dǎo)體系也被稱為“暗誘導(dǎo)法”和“兩步成芽法”，外植體在黑暗條件下1～2個(gè)月后先經(jīng)脫分化誘導(dǎo)形成直徑約為1～2 cm的愈傷，將其移至光下繼續(xù)誘導(dǎo)1～2個(gè)月后，最終獲得再生植株的方法。這種方法可使用的外植體范圍廣泛，經(jīng)試驗(yàn)證明，多數(shù)植物組織、器官均能產(chǎn)生愈傷組織，該培養(yǎng)方式普遍適用于通過離體培養(yǎng)途徑能再生的植物[6～7]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的暗誘導(dǎo)法是外植體經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后，經(jīng)過共培養(yǎng)階段后，繼續(xù)黑暗1～2個(gè)月誘導(dǎo)出愈傷后，再移至光下誘芽的培養(yǎng)方法，主要分為五個(gè)階段，分別為：共培養(yǎng)階段、黑暗下誘導(dǎo)愈傷階段、光照下愈傷誘導(dǎo)不定芽階段、不定芽抽莖階段及生根階段[9]，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素使用比例的篩選方式見表1。

表184K楊愈傷組織誘導(dǎo)體系培養(yǎng)基激素的選擇

Table1Thehormoneselectionofculturemediafortheinductionof84Kpoplarcallusinductionsystem

編號(hào)No．KT濃度TheconcentrationofKT(mg·L-1)2，4?D濃度Theconcentrationof2，4?D(mg·L-1)6BA濃度Theconcentrationof6BA(mg·L-1)10．020．10．0220．050．20．0530．10．30．140．20．50．250．50．750．561．01．01．072．02．02．0

1.2.3直接分化體系和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的直接分化體系的主要方法

直接分化體系也被稱為“光誘導(dǎo)法”和“一步成芽法”，是指外植體(組織或者器官)不經(jīng)過愈傷階段直接誘導(dǎo)不定芽，直接分化出的不定芽再形成再生植株的系統(tǒng)[8]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的光誘導(dǎo)是外植體被農(nóng)桿菌侵染后，經(jīng)共培養(yǎng)階段后直接置于光照下誘導(dǎo)分化不定芽的一種轉(zhuǎn)化方法，其遺傳轉(zhuǎn)化主要分為4個(gè)階段，分別為：共培養(yǎng)階段、不定芽誘導(dǎo)階段、不定芽抽莖階段及生根階段，不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基及其使用激素比例的篩選方式見表2。

表284K楊直接分化不定芽培養(yǎng)基激素的選擇

Table2Thehormoneselectionofculturemediafortheinductionof84Kpoplardirectdifferentiationofadventitiousbuds

1.2.4 兩種轉(zhuǎn)化方案的流程

按照兩種轉(zhuǎn)化方案進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)的流程示意圖見圖1，兩種轉(zhuǎn)化方案在共培養(yǎng)之前所有的操作是相同的，黑暗下共培養(yǎng)2天后，暗誘導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是繼續(xù)黑暗培養(yǎng)，但需要更換選擇培養(yǎng)基，每10天左右更換一次，進(jìn)行選擇培養(yǎng)，等愈傷全部長(zhǎng)出后，再移至光下，更換誘芽培養(yǎng)基進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。暗培養(yǎng)的五個(gè)階段分別為：共培養(yǎng)階段、黑暗下誘導(dǎo)愈傷階段、光照下愈傷誘導(dǎo)不定芽階段、不定芽抽莖階段及生根階段。光誘導(dǎo)法是共培養(yǎng)兩天后，移至光下誘導(dǎo)，更換各種不同類型的選擇培養(yǎng)基，共4個(gè)培養(yǎng)階段分別為：共培養(yǎng)階段、光下不定芽誘導(dǎo)階段、不定芽抽莖階段及生根階段。

2 結(jié)果與分析

2.1普通植株的愈傷誘導(dǎo)體系及其遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)的愈傷誘導(dǎo)體系

利用培養(yǎng)條件將脫分化與再分化過程分開，外植體的細(xì)胞在經(jīng)歷了完整的脫分化后回到分生細(xì)胞水平，易于接受外源基因，轉(zhuǎn)化效率更高，可獲得較多的轉(zhuǎn)化子，但此方法獲得的愈傷組織和在此基礎(chǔ)上分化的不定芽的嵌合體比例較高[10]。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的愈傷誘導(dǎo)途徑時(shí)，5號(hào)培養(yǎng)基及其激素比例在遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)間最短。黑暗培養(yǎng)15～20天時(shí)，葉片傷口邊緣逐漸出現(xiàn)褶皺，葉柄處開始膨大、變紅。25天左右出現(xiàn)愈傷組織，并繼續(xù)膨大，葉柄、葉尖切口處以及葉背貼近培養(yǎng)基的部位長(zhǎng)出米粒大小黃色愈傷組織，結(jié)構(gòu)較為硬實(shí)，多數(shù)愈傷顏色初期為黃色，有的愈傷為松軟的白色(圖2)，慢慢變綠，再繼續(xù)培養(yǎng)，更換誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)基，愈傷組織開始誘導(dǎo)不定芽。

圖1 遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)愈傷組織再生體系(暗誘導(dǎo))和直接分化體系(光誘導(dǎo))流程圖Fig.1 Schematic of callus regeneration in genetic transformation(dark-induced) and direct differentiation of tissue regeneration(light-induced)

Table3Thecompositionofculturemediumandtheconcentrationofhormoneinordinarycallusregenarationsystemof84kPoplar

普通愈傷組織再生體系的不同階段Thedifferentstagesofordinarycallusregenatationsystem培養(yǎng)基組成Compositionofculturemedium誘導(dǎo)愈傷階段CallusinductionperiodMS+0．2mg·L-1KT+0．5mg·L-12，4?D+0．2mg·L-16BA愈傷分化不定芽階段TheperiodofcallusinducedadventitiousbudMS+0．02mg·L-1TDZ不定芽抽莖階段ElongationstageofadventitiousbudsMS+0．3mg·L-16BA+0．05mg·L-1NAA生根階段Thematurestageofadventitiousbudrooted1/2MS

表4 遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)愈傷組織再生體系的培養(yǎng)基及激素配比

圖2 遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)愈傷組織再生體系誘導(dǎo)流程 A,B.愈傷前期和后期；C.愈傷誘導(dǎo)不定芽；D.愈傷大量誘導(dǎo)不定芽出現(xiàn)；E.不定芽伸長(zhǎng)階段；F.不定芽生根成熟階段Fig.2 The induced process of callus regenaration system in transgenic transformation A,B.Earlier period and the later period of callus; C.Callus induced adventitious bud; D.A large number of callus induced adventitious bud; E.Elongation stage of adventitious buds; F.The mature stage of adventitious bud rooted

圖3 遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)直接分化體系的誘導(dǎo)流程 A.侵染后的84K葉片；B.光下直接誘導(dǎo)不定芽；C.不定芽抽莖；D.移栽苗Fig.3 Direct differentiation of regeneration system A.After the infection of 84K leaves; B.Light directly induce adventitious bud; C.The mature stage of adventitious bud rooted; D.Plant domestication

2.2直接分化體系及其用于遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)的直接分化體系

直接分化體系是指外植體不經(jīng)過愈傷階段直接誘導(dǎo)不定芽的過程，直接分化出的不定芽再形成完整再生植株的體系。該方法因?yàn)槭∪チ苏T導(dǎo)愈傷組織的過程，因此實(shí)驗(yàn)周期短、操作簡(jiǎn)單，由于未經(jīng)過脫分化的植株直接分化出芽，該體系的體細(xì)胞無性系變異小，在保持受體植物的遺傳穩(wěn)定性的同時(shí)能較好的保持轉(zhuǎn)化外源基因的遺傳穩(wěn)定性[11]，但是由于外植體細(xì)胞直接分化出組織或者器官較困難，因此轉(zhuǎn)化效率低是此種方法的弊端[12]，但直接分化途徑的遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)比較穩(wěn)定并且變異率很低，因?yàn)檫@個(gè)原因，器官直接培養(yǎng)成為楊樹組織培養(yǎng)中較為常用的方法(圖3)[13]。

表5普通植株直接分化再生體系的培養(yǎng)基及激素配比

Table5Thecompositionofculturemediumandtheconcentrationofhormoneinordinarydirectdifferentiationofregenerationsystem

直接分化體系的不同階段Thedifferentstagesofordinarydirectdifferentiationofregenerationsystem培養(yǎng)基組成Compositionofculturemedium不定芽誘導(dǎo)階段TheinductionofadventitiousbudMS+0．2mg·L-1NAA+0．1mg·L-1KT+0．1mg·L-16BA+0．002mg·L-1TDZ抽莖階段TheperiodofcallusinducedadventitiousbudMS+0．3mg·L-16BA+0．05mg·L-1NAA生根階段Thematurestageofadventitiousbudrooted1/2MS

表6遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)直接分化體系的培養(yǎng)基及激素配比

Table6Thecompositionofculturemediumandtheconcentrationofhormoneingenetictransformationofdirectdifferentiationofregenerationsystem

直接分化體系的不同階段Thedifferentstagesdirectdifferentiationofregenerationsystem培養(yǎng)基組成Compositionofculturemedium不定芽誘導(dǎo)階段TheinductionofadventitiousbudMS+0．5mg·L-1NAA+0．2mg·L-1KT+0．2mg·L-16BA+0．005mg·L-1TDZ+50mg·L-1kanamycin+300mg·L-1cefotaxime抽莖階段TheperiodofcallusinducedadventitiousbudMS+0．5mg·L-16BA+0．1mg·L-1NAA+50mg·L-1kanamycin+300mg·L-1cefotaxime生根階段Thematurestageofadventitiousbudrooted1/2MS+50mg·L-1kanamycin+300mg·L-1cefotaxime

表7 采用明轉(zhuǎn)法和暗轉(zhuǎn)法的84K楊轉(zhuǎn)化效率對(duì)比性分析

2.3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的84K楊遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)愈傷組織途徑和直接分化途徑的轉(zhuǎn)化效率的對(duì)比性分析

表7為PCK1、PCK2兩個(gè)基因采用明轉(zhuǎn)法和暗轉(zhuǎn)法的轉(zhuǎn)化效率比較結(jié)果分析，所有的轉(zhuǎn)化子均在卡納霉素濃度為50 mg·L-1和頭孢濃度為300 mg·L-1的基礎(chǔ)上獲得的數(shù)據(jù)。PCK1、PCK2兩個(gè)基因采用暗轉(zhuǎn)法時(shí)，從數(shù)據(jù)中可以看出，轉(zhuǎn)化效率較高，分別為：94.5%和89%。而兩個(gè)基因在采用明轉(zhuǎn)法時(shí)轉(zhuǎn)化效率只有：8.5%和7%。

3 討論

一個(gè)高效、完整的植物再生系統(tǒng)是建立遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的基礎(chǔ)，更是其先決條件，從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，組織培養(yǎng)體系與遺傳轉(zhuǎn)化體系在激素濃度的使用上是有差別的。本實(shí)驗(yàn)選用的84K楊樹具備高效、穩(wěn)定的再生能力，能接受外源DNA的整合并穩(wěn)定遺傳等優(yōu)點(diǎn)。本研究建立了兩種組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)，對(duì)PCK1、PCK2兩個(gè)基因進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，研究其在不同培養(yǎng)條件下、不同種類及濃度的植物激素對(duì)其脫分化及再分化的影響，同時(shí)使用不同激素配比進(jìn)而對(duì)比不同效果，尋找最佳配方。84K楊正常愈傷組織誘導(dǎo)體系的高效培養(yǎng)基為：MS+0.2 mg·L-1KT+0.5 mg·L-12,4-D+0.2 mg·L-16BA。84K楊遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)體系的最佳培養(yǎng)基為：MS+0.5 mg·L-1KT+0.75 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16BA+50 mg·L-1kanamycin+300 mg·L-1cefotaxime。84K楊正常愈傷組織誘導(dǎo)不定芽體系的高效培養(yǎng)基為：MS+0.02 mg·L-1TDZ。84K楊遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)愈傷組織誘導(dǎo)不定芽再生體系的高效培養(yǎng)基為：MS+0.05 mg·L-1TDZ+50 mg·L-1kanamycin+300 mg·L-1cefotaxime。84K楊普通植株直接分化體系的最佳培養(yǎng)基為：MS+0.2 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-1KT+0.1 mg·L-16BA+0.002 mg·L-1TDZ。84K楊遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)直接分化體系的最佳培養(yǎng)基為：MS+0.5 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1KT+0.2 mg·L-16BA+0.005 mg·L-1TDZ+50 mg·L-1kanamycin+300 mg·L-1cefotaxime。84K楊普通植株直接分化再生體系的抽莖階段最佳培養(yǎng)基為：MS+0.3 mg·L-16BA+0.05 mg·L-1NAA。84K楊遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)直接分化體系的抽莖階段最佳培養(yǎng)基為：MS+0.5 mg·L-16BA+0.1 mg·L-1NAA+50 mg·L-1kanamycin+300 mg·L-1cefotaxime。

在培養(yǎng)基中添加不同濃度的激素對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)分化有很大的影響，如本實(shí)驗(yàn)在誘導(dǎo)愈傷時(shí)添加不同濃度的激素和不同配比的激素，主要添加的是細(xì)胞生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素，愈傷組織特征不具有一致性，激素濃度不同，愈傷的形態(tài)也不盡相同，用所謂的“激素杠桿”來調(diào)節(jié)植株生長(zhǎng)，使其達(dá)到最佳狀態(tài)。如圖4A激素濃度偏低，愈傷乳白色，表面呈透明狀水狀，結(jié)構(gòu)松散，塊狀、分化不定芽的時(shí)間長(zhǎng)、分化效率低，生長(zhǎng)緩慢；圖4B激素濃度過高，愈傷變紅，分化時(shí)間短，但高到一定程度(圖4C)植物停止分化，總結(jié)這些規(guī)律對(duì)今后用不同濃度激素配比調(diào)控愈傷生長(zhǎng)起到理論層面的指導(dǎo)。

圖4 愈傷組織再生體系中不同濃度激素配比對(duì)愈傷形成的影響Fig.4 The influence of different concentration hormone to callus formation in the callus regeneration system

楊樹轉(zhuǎn)基因體系雖轉(zhuǎn)化較成熟，尤其是白楊派轉(zhuǎn)基因體系，但農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化楊樹的遺傳轉(zhuǎn)化體系目前仍存在很多缺點(diǎn)[14]，穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)化效率低等問題仍是轉(zhuǎn)基因體系的構(gòu)建中面臨的主要問題[15]，尤其是存在著同一轉(zhuǎn)化流程在不同實(shí)驗(yàn)室間的重復(fù)性不佳、不同操作人員間的轉(zhuǎn)化效率差別較大、同一實(shí)驗(yàn)室的轉(zhuǎn)化效率穩(wěn)定性較差等問題，在很大程度上限制了楊樹規(guī)?；D(zhuǎn)基因技術(shù)體系的進(jìn)一步深化。盡管科研工作者已針對(duì)這些問題開展了大量的研究，也取得了一些技術(shù)上的突破，但這些轉(zhuǎn)化流程的實(shí)驗(yàn)室間的重演性和穩(wěn)定性依然不高[16]。多年的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)表明，基因轉(zhuǎn)化是一種隨機(jī)小概率事件[17]，又是需要從量變到質(zhì)變的積累過程。既然屬于小概率事件，那么轉(zhuǎn)化事件的發(fā)生必須起始于量的積累，只有量積累到一定階段，才會(huì)產(chǎn)生質(zhì)變。也就是說，兩種轉(zhuǎn)化方法的同時(shí)使用，愈傷組織轉(zhuǎn)化體系和直接分化組織轉(zhuǎn)化體系相互結(jié)合，在保證轉(zhuǎn)化條件的同時(shí)，必須經(jīng)過大量的轉(zhuǎn)化與篩選，只有這些條件都具備才算做是一個(gè)成功的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

1.Parsons T J,Sinkar V P,Stettler R F,et al.Transformation of Poplar byAgrobacteriumtumefaciens[J].Nature Biotechnology,1986,4(6):533-536.

2.趙清爽.84K楊組織培養(yǎng)及基因轉(zhuǎn)化的研究[D].西安:陜西師范大學(xué),2003.

Zhao Q S.Studies on the tissue culture and gene transformation of Poplar 84[D].Xi’an:Shanxi teacher’s university,2003.

3.周熙瑩.84K楊再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué),2013.

Zhou X Y.Research on 84K populus regeneration and genetic transformation system[D].Haerbin:Northeast Forestry University,2013.

4.Liesebach M,Naujoks G.Approaches on vegetative propagation of difficult-to-rootSalixcaprea[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture,2004,79:239-247.

5.王蒂.植物組織培養(yǎng)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2004:12-18.

Wang D.The tissue culture in plant[M].Beijing:China Agriculture Press,2004:12-18.

6.Jin J Z,Liang S,Hui C,et al.An efficientAgrobacterium-mediated transformation method for the edible mushroomHypsizygusmarmoreus[J].Microbiological Research,2014,169(9-10):741-748.

7.Kayani W K,Fattahi M,Palazòn J,et al.Comprehensive screening of influential factors in theAgrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of the Himalayan elixir:Ajugabracteosa,Wall.ex.Benth[J].Journal of Applied Research on Medicinal & Aromatic Plants,2016,3(4):151-159.

8.Kalbande B B,Patil A S.Plant tissue culture independentAgrobacteriumtumefaciens,mediated In-planta,transformation strategy for upland cotton(Gossypiumhirsutum)[J].Journal of Genetic Engineering & Biotechnology,2016,14(1):9-18.

9.Rodrigues M B C,Fávaro L C D L,Pallu A P D S,et al.Agrobacterium-mediated transformation ofGuignardiacitricarpa:An efficient tool to gene transfer and random mutagenesis[J].Fungal Biology,2013,117(8):556-568.

10.付成華,沈?qū)毾?I-72楊再生體系的建立[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,25(5):564-566.

Fu C H,Shen B X.Establishment of Plant Regeneration ofPopuluseuramericanaSan Martino[J].Journal of Huazhong Agricultural University,2006,25(5):564-566.

11.Ziemienowicz A.Agrobacterium-mediated plant transformation:Factors,applications and recent advances[J].Biocatalysis & Agricultural Biotechnology,2014,3(4):95-102.

12.Martins P K,Ribeiro A P,Kobayashi A K,et al.A simple and highly efficientAgrobacterium-mediated transformation protocol forSetariaviridis[J].Biotechnology Reports,2015,6:41-44.

13.趙華燕,盧善發(fā).楊樹的組織培養(yǎng)及其基因工程研究植物學(xué)通[J].植物學(xué)通報(bào),2001,18(2):169-176.

Zhao H Y,Lu S F.Studies on Tissue Culture and Gene Engineering of Poplar[J].Chinese Bulletin of Botany,2001,18(2):169-176.

14.Mallesham Bulle.Agrobacteriumtumefaciens-Mediated transformation of Woodfordia fruticosa[J].Journal of Genetic Engineering and Biotechnology,2015,13(2):201-207.

15.張穎,王猛,柴娜.楊樹葉片離體再生系統(tǒng)的構(gòu)建[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,5(37):8-10.

Zhang Y,Wang M,Chai N.Establishment of invitro Regenaration system of Poplar leaves[J].Shandong Agriculture Sciences.2010,5(37):8-10.

16.于志水.白楊無性系莖尖培養(yǎng)及體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)研究[D].北京:北京林業(yè)大學(xué),2005.

Yu Z S.Shoot culure and somatic embryogenesis in Aspen Clones[D].Beijing:Beijing Forestry University,2005.

17.孟慶敏.復(fù)葉槭組織培養(yǎng)再生體系的建立[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué),2006.

Meng Q M.Establishment of Plant Regeneration system cultured in vitro ofAcernegundoL.[D].Haerbin:Northeast Forestry University,2006.

Fundamental Research Funds for the Central Universities(2572016BA02)；Harbin applied technology research and development project(2016RAQXJ065)

introduction：WANG Li-Na(1979—),female,Mainly Engaged in Forest Tree Genomics.

date:2017-02-02

TheComparativestudyofCallusandDirectDifferationRegenarationSystemof84KPoplar

WANG Li-Na WANG Yu-Cheng YANG Chuan-Ping*

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,51 Hexing Road,Harbin 150040)

High-frequent transformation and strong regeneration ability of plants are prerequisites to the establishment of good plant transformation receptor system, which is the foundation for plant genetic transformation. Taking 84K poplar leaves as study material, this experiment studies the influence of different types and concentrations of plant hormones to its dedifferentiation and re-differentiation under different cultivation conditions, and sets two mature plant tissue cultivation regeneration system. Based on above,here establishes genetic transformation system of adventitious buds and callus pathway, respectively as callus regeneration system and regeneration system of direct differentiation. Then through conducting comparative analysis of two tissue culture system usingPCK1 andPCK2, here summarizes the advantages and disadvantages of two methods.

Poplar84K；callus；direct differation；genetic transformation

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2572016BA02)；哈爾濱市應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項(xiàng)目(青年后備人才A類)(2016RAQXJ065)資助

王麗娜(1979—),女,講師,主要從事林木基因組研究。

* 通信作者：E-mail:yangcp@nefu.edu.cn

2017-02-02

* Corresponding author：E-mail:yangcp@nefu.edu.cn

Q75

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.04.009