宋 躍 李淑娟 白曉明 張含國(guó)
(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150040)
響應(yīng)面優(yōu)化長(zhǎng)白落葉松體胚形成早期培養(yǎng)條件的研究
宋 躍 李淑娟*白曉明 張含國(guó)
(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,哈爾濱 150040)
以長(zhǎng)白落葉松胚性愈傷組織為材料,通過(guò)Box-Behnken Design設(shè)計(jì)試驗(yàn),建立以體胚發(fā)生量為響應(yīng)值的響應(yīng)面模型,優(yōu)化長(zhǎng)白落葉松體胚形成早期的培養(yǎng)條件。結(jié)果表明:相對(duì)離子濃度(P=0.007)、肌醇濃度(P=0.000)、培養(yǎng)周期(P=0.000)、肌醇濃度與培養(yǎng)周期的交互作用(P=0.007)對(duì)長(zhǎng)白落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生量的影響極為顯著。長(zhǎng)白落葉松體胚形成早期的最適培養(yǎng)條件為:相對(duì)離子濃度26.767 7% BM、肌醇濃度10.454 5 g·L-1、培養(yǎng)周期12.656 6 d,預(yù)測(cè)體細(xì)胞胚胎的發(fā)生量為337.04 個(gè)·g-1。為便于實(shí)際操作,驗(yàn)證試驗(yàn)將培養(yǎng)條件調(diào)整為:離子濃度25% BM、肌醇濃度10 g·L-1、培養(yǎng)周期13 d,體胚平均發(fā)生量為336.46 個(gè)·g-1,與預(yù)測(cè)值336.29 個(gè)·g-1基本一致,體胚萌發(fā)率與生根率分別達(dá)100%和83.33±5.78%,與前期試驗(yàn)相比,長(zhǎng)白落葉松體胚發(fā)生的數(shù)量和質(zhì)量均有顯著提高。
落葉松屬;長(zhǎng)白落葉松;響應(yīng)面優(yōu)化;體胚發(fā)生;胚胎形成早期
落葉松(LarixMill.)具早期速生、抗逆性強(qiáng)、輪伐期短等特點(diǎn)[1],是我國(guó)東北地區(qū)三大針葉用材樹(shù)種之一。長(zhǎng)白落葉松(Larixolgensis)作為東北地區(qū)的優(yōu)良鄉(xiāng)土樹(shù)種,其種源試驗(yàn)開(kāi)展較早,自上世紀(jì)70年代末以來(lái)已有一批速生豐產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良長(zhǎng)白落葉松家系被陸續(xù)選育出來(lái),其栽培區(qū)不斷向北延伸,推廣面積超過(guò)60余萬(wàn)hm2[2]。但長(zhǎng)白落葉松的種子產(chǎn)量不穩(wěn)定[3],有性生殖的子代變異大,許多優(yōu)良性狀難以維持,而扦插等無(wú)性繁殖也存在生根率較低等問(wèn)題[2~4],限制了落葉松良種的大規(guī)模繁育利用,難以滿足林業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際需求。
植物的體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有數(shù)量多、繁殖快、結(jié)構(gòu)完整、植株再生率高以及不受季節(jié)影響等特點(diǎn),被認(rèn)為是一種可實(shí)現(xiàn)針葉樹(shù)大規(guī)模繁殖的重要技術(shù)手段[4]。通過(guò)幾十年來(lái)的不斷努力,落葉松的體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)獲得了突破性進(jìn)展。其中一些種,如歐洲落葉松(Larixdecidua)[5]、日本落葉松(Larixkaempferi)[5~7]、華北落葉松(Larixprincipis-rupprechtii)[8]、雜種落葉松(L.decidua×principis-rupprechtii)(L.decidua×kaempferi)(L.kaempferi×decidua)(L.kaempferi×olgensis)[9~11]等均已通過(guò)體胚發(fā)生途徑獲得了再生植株。但就目前而言,想要利用落葉松的無(wú)性繁殖來(lái)代替種子繁殖依然存在許多技術(shù)上的難題[2]。尤其是在體胚發(fā)生體系中,優(yōu)質(zhì)體胚的大量獲得是落葉松體胚規(guī)?;a(chǎn)的重要環(huán)節(jié),而高質(zhì)量的體胚能否大量獲得受早期原胚發(fā)育狀態(tài)的直接影響[12~13]。
因此,有必要優(yōu)化體細(xì)胞胚胎形成早期的培養(yǎng)條件,以改善原胚團(tuán)在體胚成熟前的生理和發(fā)育狀態(tài)。但對(duì)落葉松屬植物而言,有關(guān)該方面的研究報(bào)道較少,且尚未見(jiàn)長(zhǎng)白落葉松體胚形成早期影響因子研究的詳細(xì)報(bào)道。
響應(yīng)面法作為一種多因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)回歸分析方法[14],具有試驗(yàn)次數(shù)較少、可分析實(shí)驗(yàn)因素間的交互作用、求得的回歸方程精度高等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、化學(xué)、食品及制造等領(lǐng)域[15]。本研究以長(zhǎng)白落葉松胚性愈傷組織為材料,通過(guò)Box-Behnken Design設(shè)計(jì)試驗(yàn),建立以體胚發(fā)生量為響應(yīng)值的響應(yīng)面模型,優(yōu)化長(zhǎng)白落葉松體胚形成早期的培養(yǎng)條件,為其良種的規(guī)?;庇屠玫於ɑA(chǔ)。
1.1 試驗(yàn)材料
以林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))誘導(dǎo)并保存的長(zhǎng)白落葉松胚性愈傷組織為研究對(duì)象[4]。供試的胚性愈傷組織避光繼代于含2,4-D 0.15 mg·L-1、BA 0.05 mg·L-1、KT 0.05 mg·L-1、肌醇1.0 g·L-1、水解酪蛋白CH 0.5 g·L-1、谷氨酰胺1.0 g·L-1、瓊脂6 g·L-1,pH值為(6.00±0.02)的BM培養(yǎng)基上,培養(yǎng)溫度為(25±1)℃。取增殖培養(yǎng)約14 d的新鮮組織作為試材。
1.2 體細(xì)胞胚胎的成熟
稱取約0.2 g長(zhǎng)白落葉松胚性愈傷組織,接種到含不同相對(duì)離子(無(wú)機(jī)鹽)濃度及肌醇濃度、且不含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上進(jìn)行過(guò)渡培養(yǎng)。一定時(shí)間后,將上述組織轉(zhuǎn)接于含有ABA 20 mg·L-1、PEG400080 g·L-1、AgNO35 mg·L-1、肌醇0.5 g·L-1、谷氨酰胺0.5 g·L-1、水解酪蛋白0.25 g·L-1、瓊脂6 g·L-1,pH值為(6.00±0.02)的BM培養(yǎng)基上,(25±1)℃暗培養(yǎng),完成體細(xì)胞胚胎的成熟,8周后統(tǒng)計(jì)獲得子葉胚的數(shù)量。各處理均設(shè)置3次重復(fù),每次重復(fù)接種3團(tuán)胚性愈傷組織。
1.3 響應(yīng)面法優(yōu)化體胚形成早期培養(yǎng)條件
前期研究結(jié)果[16]的方差分析表明,在長(zhǎng)白落葉松體胚形成早期培養(yǎng)階段,培養(yǎng)周期(P=0.000)、相對(duì)離子濃度(P=0.000)及肌醇濃度(P=0.002)對(duì)體胚發(fā)生量的影響極為顯著,而蔗糖(P=0.321)、水解酪蛋白(P=0.600)及谷氨酰胺濃度(P=0.122)的影響并不顯著。
因此,本研究著重對(duì)培養(yǎng)介質(zhì)的相對(duì)離子濃度、肌醇濃度及培養(yǎng)周期等3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化,以每克胚性愈傷組織的體細(xì)胞胚胎發(fā)生量(個(gè)·g-1)為響應(yīng)值建立響應(yīng)面模型,試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。
表1試驗(yàn)因素和水平
Table1Experimentalfactorsandlevels
編號(hào)Code試驗(yàn)因素Experimentalfactors處理水平Treatmentlevels-10+1A相對(duì)離子濃度Relativeionconcentration(%)02550B肌醇濃度Inositolconcentration(g·L-1)51525C培養(yǎng)周期Cultureperiod(d)71421
注:以BM培養(yǎng)基所含有的相對(duì)離子濃度為100%,以去離子水所含有的相對(duì)離子濃度為0%。
Note:The relative ion concentration in the BM medium was 100%,and the relative ion concentration in deionized water was about 0%.
1.4 驗(yàn)證試驗(yàn)
為驗(yàn)證優(yōu)化結(jié)果的可靠性,同時(shí)考慮到試驗(yàn)的可行性,選取各條件優(yōu)化值的臨近整數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證,待體胚成熟后,統(tǒng)計(jì)子葉胚的數(shù)量,并與模型預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。驗(yàn)證共進(jìn)行3次平行試驗(yàn),每次試驗(yàn)重復(fù)接種3團(tuán)鮮質(zhì)量約0.2 g的胚性愈傷組織。
1.5 體細(xì)胞胚胎的萌發(fā)
選取發(fā)育正常的子葉胚,放置在含有蔗糖20 g·L-1,瓊脂4.0 g·L-1,VB13.0 mg·L-1,AC 2.0 g·L-1的WPM培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)。每個(gè)培養(yǎng)皿接種10個(gè)體胚,重復(fù)3次。光照時(shí)間為16 h·d-1,光照強(qiáng)度約為50 μmol·m-2·s-1。7 d后統(tǒng)計(jì)體胚的萌發(fā)率,8周后統(tǒng)計(jì)生根率。
1.6 統(tǒng)計(jì)與分析
每克胚性愈傷組織的體細(xì)胞胚胎發(fā)生量(個(gè)·g-1)=體細(xì)胞胚胎發(fā)生數(shù)/體胚成熟培養(yǎng)前胚性愈傷組織的鮮質(zhì)量;體細(xì)胞胚胎的萌發(fā)率(%)=萌發(fā)的體胚數(shù)/接種的體胚數(shù)×100%;體細(xì)胞胚胎的生根率(%)=生根的體胚數(shù)/接種的體胚數(shù)×100%
文中數(shù)據(jù)使用PASW Statistics 18、Minitab 17軟件進(jìn)行分析,Duncan法進(jìn)行多重比較。
2.1 體胚成熟初期培養(yǎng)條件的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果2.1.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)
基于BBD(Box-Behnken Design)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。采用響應(yīng)面分析法分析試驗(yàn)結(jié)果,由此建立以體胚發(fā)生量為響應(yīng)值Y的回歸方程:
Y=-71.2+819.6A+12.41B+36.94C-1 474.1A2-0.428 2B2-1.31C2+1.08A·B-2.83A·C-0.299 9B·C
(1)
式中:A為培養(yǎng)介質(zhì)的相對(duì)離子濃度(% BM);B為肌醇濃度(g·L-1);C為培養(yǎng)周期(d)。
方差分析結(jié)果(表3)可知,以體細(xì)胞胚胎發(fā)生量為響應(yīng)值時(shí),上述二次方程模型極顯著(P=0.000),而該模型的失擬不顯著(P=0.320),說(shuō)明該模型的擬合良好,可進(jìn)行下一步的優(yōu)化研究[17]。本實(shí)驗(yàn)中的3個(gè)因素A(P=0.007)、B(P=0.000)、C(P=0.000),二次項(xiàng)A2(P=0.000)、B2(P=0.000)、C2(P=0.000)及B·C(P=0.007)對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著,而因素A與B(P=0.601)、C間交互作用(P=0.352)的影響不顯著。這表明各個(gè)具體的試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。
表2響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果
Table2Experimentaldesignandresultsofresponsesurfaceoptimizationoftransitioncultureconditions
序號(hào)Runs變量VariablequantityABC體胚發(fā)生量(個(gè)·g-1)Somaticembryogenesis擬合值Fittedvalues1-1-10210.53219.662+1-10246.30243.823-1+10124.53127.014+1+10171.05161.935-10-1187.00181.576+10-1214.82220.997-10+1128.57122.408+10+1136.61142.0490-1-1276.92273.23100+1-1225.00227.95110-1+1249.11246.16120+1+1113.21116.9013000328.42323.0514000325.93323.0515000314.81323.05
表3離子濃度、肌醇濃度及培養(yǎng)周期對(duì)體胚發(fā)生量影響的方差分析
Table3Varianceanalysisoftheeffectofionic,inositolcontentandtheculturedayontheoccurrenceofsomaticembryogenesis
變異來(lái)源Sources平方和SS自由度df均方MSF值F?measureP值P?measure顯著性Significant模型Model75590.298398.990.540.000???A1744.911744.918.810.007??B15231.2115231.2164.190.000???C9538.619538.6102.820.000???A231340.4131340.4337.840.000???B26770.216770.272.980.000???C215205.5115205.5163.910.000???AB28.9128.90.310.601NSAC97.8197.81.050.352NSBC1763.211763.219.010.007??殘差Residual463.8592.8失擬Lackoffit358.83119.62.280.320NS純誤差Pureerror105.0252.5總計(jì)Total76054.114
** .P<0.010; *** .P<0.001; NS.P>0.050
該模型的相關(guān)系數(shù)R-sq=0.993 9、R-sq(調(diào)整)=0.982 9、R-sq(預(yù)測(cè))=0.921 4,表明此方程可以解釋98.29%的數(shù)據(jù),且使用該模型推測(cè)的結(jié)果較為可靠。此外,變異系數(shù)(CV)可以反映模型的置信度,CV值越高,模型的置信度越低,反之相反[18]。本試驗(yàn)的CV=4.44%,說(shuō)明該模型的置信度較高,模型方程能夠真實(shí)地反映試驗(yàn)值,可以較好地分析響應(yīng)值的變化。
2.1.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化
通過(guò)Minitab 17軟件對(duì)各因素之間的交互作用進(jìn)行響應(yīng)面分析,并繪制響應(yīng)面曲線圖及等高線圖。
從圖1~3A可知,每個(gè)響應(yīng)面均為開(kāi)口向下的凸形曲面,這表明響應(yīng)值存在最大值[19~21]。在一定范圍內(nèi)調(diào)整體胚形成早期階段的培養(yǎng)條件,體胚發(fā)生量會(huì)隨介質(zhì)所含的相對(duì)離子濃度、肌醇濃度以及培養(yǎng)周期的增加或延長(zhǎng)而呈現(xiàn)出先提高后降低的變化趨勢(shì)。等高線圖可以直觀地反映出各因素間交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響[19]。由圖1~3的圖B可知,相對(duì)離子濃度、肌醇濃度、培養(yǎng)周期間的交互作用均對(duì)體胚發(fā)生量有一定的影響,其交互作用的影響力排序?yàn)椋杭〈紳舛扰c培養(yǎng)周期>相對(duì)離子濃度與培養(yǎng)周期>相對(duì)離子濃度與肌醇濃度。
圖1 相對(duì)離子濃度與肌醇濃度對(duì)體胚發(fā)生量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.1 Response surface and contour lines effects of ion and inositol content on the occurrence of somatic embryos
圖2 相對(duì)離子濃度與培養(yǎng)周期對(duì)體胚發(fā)生量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.2 Response surface and contour lines effects of ion concentration and synchronized culture period on the occurrence of somatic embryos
圖3 肌醇濃度與培養(yǎng)周期對(duì)體胚發(fā)生量影響的響應(yīng)面圖及等高線Fig.3 Response surface and contour lines effects of inositol content and synchronized culture period on the occurrence of somatic embryos
圖4 長(zhǎng)白落葉松胚性愈傷組織及早期原胚顯微結(jié)構(gòu)A.長(zhǎng)白落葉松早期原胚的顯微結(jié)構(gòu);B.體胚形成早期階段的長(zhǎng)白落葉松胚性愈傷組織Fig.4 L.olgensis embryogenic callus and early proembryo microstructure A. Microstructure of early proembryos of L.olgensis; B. Surface structure of embryogenic callus in early stage of somatic embryogenesis of L.olgensis
圖5 長(zhǎng)白落葉松體細(xì)胞胚胎的成熟Fig.5 The mature somatic embryos of L.olgensis
2.2 最佳培養(yǎng)條件的驗(yàn)證
通過(guò)模型優(yōu)化獲得的最適培養(yǎng)條件為:無(wú)機(jī)鹽濃度26.767 7% BM、肌醇濃度10.454 5 g·L-1、培養(yǎng)周期12.656 6 d,體細(xì)胞胚胎的發(fā)生量為337.04 個(gè)·g-1。為便于實(shí)際操作,選取各條件的臨近整數(shù)值,具體為:無(wú)機(jī)鹽濃度25% BM、肌醇濃度10 g·L-1、培養(yǎng)周期13 d,重復(fù)試驗(yàn)3次,體胚平均發(fā)生量為336.46 個(gè)·g-1,與預(yù)測(cè)值336.29 個(gè)·g-1基本一致,表明該方程與實(shí)際情況的擬合良好。
2.3體胚成熟早期培養(yǎng)對(duì)體胚形態(tài)發(fā)生及萌發(fā)的影響
形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),在體胚形成早期培養(yǎng)階段,胚性愈傷組織逐漸由半透明轉(zhuǎn)變?yōu)槿榘咨?,組織表面結(jié)構(gòu)也隨之干燥、最終呈繩索狀或顆粒狀(圖4B);鏡檢原胚的發(fā)育狀態(tài)相對(duì)較好,胚柄類似結(jié)構(gòu)較為粗壯、胚頭飽滿(圖4A)。將這些原胚轉(zhuǎn)接于含ABA的成熟培養(yǎng)基上約15 d,即有數(shù)量可觀、子葉整齊、大小適中、形態(tài)修長(zhǎng)、呈子彈狀的子葉胚出現(xiàn)(圖5),并且這些胚胎發(fā)生的同步性較高、畸形率低。
相對(duì)而言,未經(jīng)過(guò)渡培養(yǎng)而直接進(jìn)行成熟培養(yǎng)的體胚,其發(fā)生量較低、成熟周期相對(duì)較長(zhǎng)、同步性差、形態(tài)大小不一且畸形胚所占比率較高。通常,原胚團(tuán)接種45 d后才可觀察到零星的子葉胚出現(xiàn),這些胚胎的苗端雖已分化并形成子葉,但仍有部分胚胎根端的胚柄類似結(jié)構(gòu)未能完全消失,導(dǎo)致下胚軸膨大、愈傷化、根原基發(fā)育異常,這些畸形胚的萌發(fā)較為困難且成苗率極低。
綜上所述,在體胚形成的早期階段,適當(dāng)改變培養(yǎng)基成份進(jìn)行一定時(shí)間的過(guò)渡培養(yǎng)可以促進(jìn)長(zhǎng)白落葉松體胚的發(fā)生與形態(tài)建成,并能明顯提高體胚的數(shù)量與質(zhì)量。最優(yōu)培養(yǎng)條件下獲得的體胚,其萌發(fā)率高達(dá)100%,生根率也達(dá)80%以上(表4);與原有的長(zhǎng)白落葉松體胚發(fā)生體系[4](子葉胚發(fā)生頻率相對(duì)較低,每克愈傷組織上只發(fā)生67.60~179.89個(gè)子葉胚,體胚的萌發(fā)率僅為75%,而體胚的生根率不足70%)相比有較大改善。
表4體胚成熟早期培養(yǎng)對(duì)體胚萌發(fā)的影響
Table4Effectsofearlyembryocultureonsomaticembryogermination
培養(yǎng)周期Cultureperiod(d)肌醇濃度Inositolcontent(g·L-1)體胚發(fā)生量(個(gè)·g-1)Somaticembryogenesis萌發(fā)率Germinationrate(%)生根率Regenerationrate(%)0—32.33±8.39a62.67±28.87a11.00±5.67a1310336.46±7.25c100b83.33±5.78c1415323.05±4.36b100b50.00±10.0b
注:不同字母表示在0.05水平上差異顯著。
Note:Different letters indicate significant differences at 0.05 level.
植物的體細(xì)胞胚胎發(fā)生是一個(gè)極為復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程,在體胚發(fā)生的不同階段,原胚團(tuán)及體細(xì)胞胚胎的生理狀態(tài)有所不同[22]。因此需根據(jù)胚胎發(fā)育的需求,適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基的成份。松杉類植物的體細(xì)胞胚胎發(fā)育可分為三個(gè)階段,即原胚團(tuán)時(shí)期、胚胎形成早期及胚胎形成晚期[23~24]。根據(jù)原胚團(tuán)形態(tài)的差異,又可將原胚團(tuán)時(shí)期分為原胚團(tuán)Ⅰ、原胚團(tuán)Ⅱ及原胚團(tuán)Ⅲ等3個(gè)階段[25]。而在這3個(gè)階段的原胚團(tuán)中,僅有處于原胚團(tuán)Ⅲ階段的原胚團(tuán)才能進(jìn)一步發(fā)育形成成熟的體細(xì)胞胚,而增殖培養(yǎng)基中添加的細(xì)胞分裂素(如6-BA、KT)與生長(zhǎng)素(如2,4-D、NAA)會(huì)促使細(xì)胞的無(wú)序分裂而破壞體胚的極性,導(dǎo)致原胚團(tuán)Ⅲ破裂[26]。因此在胚胎形成的早期適當(dāng)改變培養(yǎng)條件,即在體胚成熟早期進(jìn)行過(guò)渡培養(yǎng)利于針葉樹(shù)體細(xì)胞胚胎的形態(tài)建成。
培養(yǎng)介質(zhì)中添加的各類元素在細(xì)胞的生命活動(dòng)過(guò)程中均起著不同的重要作用。植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的不同階段,胚性細(xì)胞對(duì)各種無(wú)機(jī)離子的吸收程度也有所不同[22]。有研究表明,處于不同時(shí)期的胚性懸浮細(xì)胞中氮元素及礦質(zhì)元素的含量變化明顯,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),鈣、銅、鐵的含量逐漸降低;鉀、氮、鎂的含量有所增加;而磷的含量則呈現(xiàn)出先增加后急劇降低的趨勢(shì)[27]。本研究表明,在長(zhǎng)白落葉松體胚成熟的早期階段,適當(dāng)降低培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的濃度可以顯著提高成熟體胚的獲得量。推測(cè)這種現(xiàn)象的原因可能是:某些無(wú)機(jī)鹽(如KCl、KH2PO4、MgSO4)的濃度過(guò)高,影響或抑制了原胚團(tuán)細(xì)胞對(duì)其他無(wú)機(jī)離子(如Zn2+、Cu2+、Co2+、Mn2+等與體胚形成至關(guān)重要的離子)的吸收與利用[22],其內(nèi)在的分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。
肌醇作為一種小分子有機(jī)化合物可以參與滲透壓的調(diào)節(jié),并為植物的生長(zhǎng)提供碳源,其衍生物還參與如:細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)素的合成及運(yùn)輸及植物細(xì)胞的抗逆調(diào)節(jié)等多種理化過(guò)程[28~33]。有研究表明,肌醇作為合成磷脂酰肌醇以及磷脂酰肌醇磷酸的底物,參與維持內(nèi)膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能,從而影響生長(zhǎng)素調(diào)控植物胚胎的發(fā)育過(guò)程[33]。日本落葉松及日本×長(zhǎng)白落葉松的原胚團(tuán)經(jīng)9 g·L-1肌醇高滲處理42 d,胚頭的質(zhì)量與密度較對(duì)照組有明顯的改善[34]。本文的研究結(jié)果表明:肌醇濃度對(duì)長(zhǎng)白落葉松體胚發(fā)生的影響極為顯著。在體細(xì)胞胚胎成熟的早期階段,適當(dāng)提高肌醇濃度可以促進(jìn)體細(xì)胞胚的成熟。
本研究對(duì)體胚成熟早期階段培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽離子濃度、肌醇濃度及培養(yǎng)周期等因素對(duì)長(zhǎng)白落葉松體胚發(fā)生數(shù)量的影響進(jìn)行了研究,采用響應(yīng)面法進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明:相對(duì)離子濃度(P=0.007)、肌醇濃度(P=0.000)以及培養(yǎng)周期(P=0.000)對(duì)長(zhǎng)白落葉松體胚發(fā)生量的影響極為顯著。模型擬合的最優(yōu)培養(yǎng)條件為:相對(duì)離子濃度26.767 7% BM、肌醇濃度10.454 5 g·L-1、培養(yǎng)周期12.656 6 d,體胚發(fā)生量為337.04 個(gè)·g-1。實(shí)際操作時(shí)調(diào)整培養(yǎng)條件為:相對(duì)離子濃度25% BM、肌醇濃度10 g·L-1、培養(yǎng)周期13 d,體胚的發(fā)生量為336.46 個(gè)·g-1,其萌發(fā)率與生根率分別可達(dá)100%、83.33±5.78%,為實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)白落葉松良種的規(guī)模化繁育奠定了基礎(chǔ)。
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National High-tech R&D Program(“863” Program 2013AA102704-04-03)
introduction:SONG Yue(1991—),male,master,Mainly engaged in larch genetic breeding research.
date:2017-01-06
ResponseSurfaceOptimizationofCultureConditionsfortheFormationofEarlyEmbryosinLarixolgensis
SONG Yue LI Shu-Juan*BAI Xiao-Ming ZHANG Han-Guo
(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Harbin 150040)
With the larch embryogenic callus, through the Design Box-Behnken design test, we established a response surface model based on the somatic embryogenesis. The culture conditions of somatic embryo early maturation was optimized inLarixolgensis. The relative ion concentration(P=0.007), the inositol concentration(P=0.000), the culture period(P=0.000) and the interaction between inositol content and culture period(P=0.007) effect on the number of somatic embryos ofL.olgensiswere extremely significant. Cultivation of Larix somatic embryo maturation was 337.04 ind·g-1at the early stage of the most optimum conditions for relative ion content of 26.767 7% BM basic culture medium, inositol 10.454 5 g·L-1, culture time 12.656 6 d, and the number of somatic embryos average. In order to facilitate the practical operation, the culture condition was changed to the relative ion concentration of 25% BM, inositol 10 g·L-1, incubation period of 13 d, then the average number of somatic embryos was 336.46 ind·g-1, that was consistent with the predicted value 336.29 ind·g-1. Compared with previous test, the quantity and quality ofL.olgensissomatic embryos were increased significantly.
Larix;Larixolgensis;response surface optimization;somatic embryogenesis;early embryo formation
國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(“863”計(jì)劃2013AA102704-04-03)
宋躍(1991—),男,碩士研究生,主要從事落葉松遺傳育種方面的研究。
* 通信作者:E-mail:lishujuan@126.com
2017-01-06
* Corresponding author:E-mail:lishujuan@126.com
S791.22;Q943.1
A
10.7525/j.issn.1673-5102.2017.04.018