響應(yīng)面優(yōu)化長(zhǎng)白落葉松體胚形成早期培養(yǎng)條件的研究

宋 躍 李淑娟 白曉明 張含國(guó)

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

響應(yīng)面優(yōu)化長(zhǎng)白落葉松體胚形成早期培養(yǎng)條件的研究

宋 躍 李淑娟*白曉明 張含國(guó)

(東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

以長(zhǎng)白落葉松胚性愈傷組織為材料，通過(guò)Box-Behnken Design設(shè)計(jì)試驗(yàn)，建立以體胚發(fā)生量為響應(yīng)值的響應(yīng)面模型，優(yōu)化長(zhǎng)白落葉松體胚形成早期的培養(yǎng)條件。結(jié)果表明：相對(duì)離子濃度(P=0.007)、肌醇濃度(P=0.000)、培養(yǎng)周期(P=0.000)、肌醇濃度與培養(yǎng)周期的交互作用(P=0.007)對(duì)長(zhǎng)白落葉松體細(xì)胞胚胎發(fā)生量的影響極為顯著。長(zhǎng)白落葉松體胚形成早期的最適培養(yǎng)條件為：相對(duì)離子濃度26.767 7% BM、肌醇濃度10.454 5 g·L-1、培養(yǎng)周期12.656 6 d，預(yù)測(cè)體細(xì)胞胚胎的發(fā)生量為337.04 個(gè)·g-1。為便于實(shí)際操作，驗(yàn)證試驗(yàn)將培養(yǎng)條件調(diào)整為：離子濃度25% BM、肌醇濃度10 g·L-1、培養(yǎng)周期13 d，體胚平均發(fā)生量為336.46 個(gè)·g-1，與預(yù)測(cè)值336.29 個(gè)·g-1基本一致，體胚萌發(fā)率與生根率分別達(dá)100%和83.33±5.78%，與前期試驗(yàn)相比，長(zhǎng)白落葉松體胚發(fā)生的數(shù)量和質(zhì)量均有顯著提高。

落葉松屬；長(zhǎng)白落葉松；響應(yīng)面優(yōu)化；體胚發(fā)生；胚胎形成早期

落葉松(LarixMill.)具早期速生、抗逆性強(qiáng)、輪伐期短等特點(diǎn)[1]，是我國(guó)東北地區(qū)三大針葉用材樹(shù)種之一。長(zhǎng)白落葉松(Larixolgensis)作為東北地區(qū)的優(yōu)良鄉(xiāng)土樹(shù)種，其種源試驗(yàn)開(kāi)展較早，自上世紀(jì)70年代末以來(lái)已有一批速生豐產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)的優(yōu)良長(zhǎng)白落葉松家系被陸續(xù)選育出來(lái)，其栽培區(qū)不斷向北延伸，推廣面積超過(guò)60余萬(wàn)hm2[2]。但長(zhǎng)白落葉松的種子產(chǎn)量不穩(wěn)定[3]，有性生殖的子代變異大，許多優(yōu)良性狀難以維持，而扦插等無(wú)性繁殖也存在生根率較低等問(wèn)題[2～4]，限制了落葉松良種的大規(guī)模繁育利用，難以滿足林業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際需求。

植物的體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有數(shù)量多、繁殖快、結(jié)構(gòu)完整、植株再生率高以及不受季節(jié)影響等特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種可實(shí)現(xiàn)針葉樹(shù)大規(guī)模繁殖的重要技術(shù)手段[4]。通過(guò)幾十年來(lái)的不斷努力，落葉松的體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)獲得了突破性進(jìn)展。其中一些種，如歐洲落葉松(Larixdecidua)[5]、日本落葉松(Larixkaempferi)[5～7]、華北落葉松(Larixprincipis-rupprechtii)[8]、雜種落葉松(L.decidua×principis-rupprechtii)(L.decidua×kaempferi)(L.kaempferi×decidua)(L.kaempferi×olgensis)[9～11]等均已通過(guò)體胚發(fā)生途徑獲得了再生植株。但就目前而言，想要利用落葉松的無(wú)性繁殖來(lái)代替種子繁殖依然存在許多技術(shù)上的難題[2]。尤其是在體胚發(fā)生體系中，優(yōu)質(zhì)體胚的大量獲得是落葉松體胚規(guī)?；a(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，而高質(zhì)量的體胚能否大量獲得受早期原胚發(fā)育狀態(tài)的直接影響[12～13]。

因此，有必要優(yōu)化體細(xì)胞胚胎形成早期的培養(yǎng)條件，以改善原胚團(tuán)在體胚成熟前的生理和發(fā)育狀態(tài)。但對(duì)落葉松屬植物而言，有關(guān)該方面的研究報(bào)道較少，且尚未見(jiàn)長(zhǎng)白落葉松體胚形成早期影響因子研究的詳細(xì)報(bào)道。

響應(yīng)面法作為一種多因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)回歸分析方法[14]，具有試驗(yàn)次數(shù)較少、可分析實(shí)驗(yàn)因素間的交互作用、求得的回歸方程精度高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、化學(xué)、食品及制造等領(lǐng)域[15]。本研究以長(zhǎng)白落葉松胚性愈傷組織為材料，通過(guò)Box-Behnken Design設(shè)計(jì)試驗(yàn)，建立以體胚發(fā)生量為響應(yīng)值的響應(yīng)面模型，優(yōu)化長(zhǎng)白落葉松體胚形成早期的培養(yǎng)條件，為其良種的規(guī)?；庇屠玫於ɑA(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))誘導(dǎo)并保存的長(zhǎng)白落葉松胚性愈傷組織為研究對(duì)象[4]。供試的胚性愈傷組織避光繼代于含2,4-D 0.15 mg·L-1、BA 0.05 mg·L-1、KT 0.05 mg·L-1、肌醇1.0 g·L-1、水解酪蛋白CH 0.5 g·L-1、谷氨酰胺1.0 g·L-1、瓊脂6 g·L-1，pH值為(6.00±0.02)的BM培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為(25±1)℃。取增殖培養(yǎng)約14 d的新鮮組織作為試材。

1.2 體細(xì)胞胚胎的成熟

稱取約0.2 g長(zhǎng)白落葉松胚性愈傷組織，接種到含不同相對(duì)離子(無(wú)機(jī)鹽)濃度及肌醇濃度、且不含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上進(jìn)行過(guò)渡培養(yǎng)。一定時(shí)間后，將上述組織轉(zhuǎn)接于含有ABA 20 mg·L-1、PEG400080 g·L-1、AgNO35 mg·L-1、肌醇0.5 g·L-1、谷氨酰胺0.5 g·L-1、水解酪蛋白0.25 g·L-1、瓊脂6 g·L-1，pH值為(6.00±0.02)的BM培養(yǎng)基上，(25±1)℃暗培養(yǎng)，完成體細(xì)胞胚胎的成熟，8周后統(tǒng)計(jì)獲得子葉胚的數(shù)量。各處理均設(shè)置3次重復(fù)，每次重復(fù)接種3團(tuán)胚性愈傷組織。

1.3 響應(yīng)面法優(yōu)化體胚形成早期培養(yǎng)條件

前期研究結(jié)果[16]的方差分析表明，在長(zhǎng)白落葉松體胚形成早期培養(yǎng)階段，培養(yǎng)周期(P=0.000)、相對(duì)離子濃度(P=0.000)及肌醇濃度(P=0.002)對(duì)體胚發(fā)生量的影響極為顯著，而蔗糖(P=0.321)、水解酪蛋白(P=0.600)及谷氨酰胺濃度(P=0.122)的影響并不顯著。

因此，本研究著重對(duì)培養(yǎng)介質(zhì)的相對(duì)離子濃度、肌醇濃度及培養(yǎng)周期等3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，以每克胚性愈傷組織的體細(xì)胞胚胎發(fā)生量(個(gè)·g-1)為響應(yīng)值建立響應(yīng)面模型，試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

表1試驗(yàn)因素和水平

Table1Experimentalfactorsandlevels

編號(hào)Code試驗(yàn)因素Experimentalfactors處理水平Treatmentlevels-10+1A相對(duì)離子濃度Relativeionconcentration(%)02550B肌醇濃度Inositolconcentration(g·L-1)51525C培養(yǎng)周期Cultureperiod(d)71421

注：以BM培養(yǎng)基所含有的相對(duì)離子濃度為100%，以去離子水所含有的相對(duì)離子濃度為0%。

Note:The relative ion concentration in the BM medium was 100%,and the relative ion concentration in deionized water was about 0%.

1.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證優(yōu)化結(jié)果的可靠性，同時(shí)考慮到試驗(yàn)的可行性，選取各條件優(yōu)化值的臨近整數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，待體胚成熟后，統(tǒng)計(jì)子葉胚的數(shù)量，并與模型預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。驗(yàn)證共進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，每次試驗(yàn)重復(fù)接種3團(tuán)鮮質(zhì)量約0.2 g的胚性愈傷組織。

1.5 體細(xì)胞胚胎的萌發(fā)

選取發(fā)育正常的子葉胚，放置在含有蔗糖20 g·L-1，瓊脂4.0 g·L-1，VB13.0 mg·L-1，AC 2.0 g·L-1的WPM培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)。每個(gè)培養(yǎng)皿接種10個(gè)體胚，重復(fù)3次。光照時(shí)間為16 h·d-1，光照強(qiáng)度約為50 μmol·m-2·s-1。7 d后統(tǒng)計(jì)體胚的萌發(fā)率，8周后統(tǒng)計(jì)生根率。

1.6 統(tǒng)計(jì)與分析

每克胚性愈傷組織的體細(xì)胞胚胎發(fā)生量(個(gè)·g-1)=體細(xì)胞胚胎發(fā)生數(shù)/體胚成熟培養(yǎng)前胚性愈傷組織的鮮質(zhì)量；體細(xì)胞胚胎的萌發(fā)率(%)=萌發(fā)的體胚數(shù)/接種的體胚數(shù)×100%；體細(xì)胞胚胎的生根率(%)=生根的體胚數(shù)/接種的體胚數(shù)×100%

文中數(shù)據(jù)使用PASW Statistics 18、Minitab 17軟件進(jìn)行分析，Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 體胚成熟初期培養(yǎng)條件的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果2.1.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

基于BBD(Box-Behnken Design)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。采用響應(yīng)面分析法分析試驗(yàn)結(jié)果，由此建立以體胚發(fā)生量為響應(yīng)值Y的回歸方程：

Y=-71.2+819.6A+12.41B+36.94C-1 474.1A2-0.428 2B2-1.31C2+1.08A·B-2.83A·C-0.299 9B·C

(1)

式中：A為培養(yǎng)介質(zhì)的相對(duì)離子濃度(% BM)；B為肌醇濃度(g·L-1)；C為培養(yǎng)周期(d)。

方差分析結(jié)果(表3)可知，以體細(xì)胞胚胎發(fā)生量為響應(yīng)值時(shí)，上述二次方程模型極顯著(P=0.000)，而該模型的失擬不顯著(P=0.320)，說(shuō)明該模型的擬合良好，可進(jìn)行下一步的優(yōu)化研究[17]。本實(shí)驗(yàn)中的3個(gè)因素A(P=0.007)、B(P=0.000)、C(P=0.000)，二次項(xiàng)A2(P=0.000)、B2(P=0.000)、C2(P=0.000)及B·C(P=0.007)對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著，而因素A與B(P=0.601)、C間交互作用(P=0.352)的影響不顯著。這表明各個(gè)具體的試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

表2響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

Table2Experimentaldesignandresultsofresponsesurfaceoptimizationoftransitioncultureconditions

序號(hào)Runs變量VariablequantityABC體胚發(fā)生量(個(gè)·g-1)Somaticembryogenesis擬合值Fittedvalues1-1-10210．53219．662+1-10246．30243．823-1+10124．53127．014+1+10171．05161．935-10-1187．00181．576+10-1214．82220．997-10+1128．57122．408+10+1136．61142．0490-1-1276．92273．23100+1-1225．00227．95110-1+1249．11246．16120+1+1113．21116．9013000328．42323．0514000325．93323．0515000314．81323．05

表3離子濃度、肌醇濃度及培養(yǎng)周期對(duì)體胚發(fā)生量影響的方差分析

Table3Varianceanalysisoftheeffectofionic,inositolcontentandtheculturedayontheoccurrenceofsomaticembryogenesis

變異來(lái)源Sources平方和SS自由度df均方MSF值F?measureP值P?measure顯著性Significant模型Model75590．298398．990．540．000???A1744．911744．918．810．007??B15231．2115231．2164．190．000???C9538．619538．6102．820．000???A231340．4131340．4337．840．000???B26770．216770．272．980．000???C215205．5115205．5163．910．000???AB28．9128．90．310．601NSAC97．8197．81．050．352NSBC1763．211763．219．010．007??殘差Residual463．8592．8失擬Lackoffit358．83119．62．280．320NS純誤差Pureerror105．0252．5總計(jì)Total76054．114

** .P<0.010； *** .P<0.001； NS.P>0.050

該模型的相關(guān)系數(shù)R-sq=0.993 9、R-sq(調(diào)整)=0.982 9、R-sq(預(yù)測(cè))=0.921 4，表明此方程可以解釋98.29%的數(shù)據(jù)，且使用該模型推測(cè)的結(jié)果較為可靠。此外，變異系數(shù)(CV)可以反映模型的置信度，CV值越高，模型的置信度越低，反之相反[18]。本試驗(yàn)的CV=4.44%，說(shuō)明該模型的置信度較高，模型方程能夠真實(shí)地反映試驗(yàn)值，可以較好地分析響應(yīng)值的變化。

2.1.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

通過(guò)Minitab 17軟件對(duì)各因素之間的交互作用進(jìn)行響應(yīng)面分析，并繪制響應(yīng)面曲線圖及等高線圖。

從圖1～3A可知，每個(gè)響應(yīng)面均為開(kāi)口向下的凸形曲面，這表明響應(yīng)值存在最大值[19～21]。在一定范圍內(nèi)調(diào)整體胚形成早期階段的培養(yǎng)條件，體胚發(fā)生量會(huì)隨介質(zhì)所含的相對(duì)離子濃度、肌醇濃度以及培養(yǎng)周期的增加或延長(zhǎng)而呈現(xiàn)出先提高后降低的變化趨勢(shì)。等高線圖可以直觀地反映出各因素間交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響[19]。由圖1～3的圖B可知，相對(duì)離子濃度、肌醇濃度、培養(yǎng)周期間的交互作用均對(duì)體胚發(fā)生量有一定的影響，其交互作用的影響力排序?yàn)椋杭〈紳舛扰c培養(yǎng)周期>相對(duì)離子濃度與培養(yǎng)周期>相對(duì)離子濃度與肌醇濃度。

圖1 相對(duì)離子濃度與肌醇濃度對(duì)體胚發(fā)生量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.1 Response surface and contour lines effects of ion and inositol content on the occurrence of somatic embryos

圖2 相對(duì)離子濃度與培養(yǎng)周期對(duì)體胚發(fā)生量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.2 Response surface and contour lines effects of ion concentration and synchronized culture period on the occurrence of somatic embryos

圖3 肌醇濃度與培養(yǎng)周期對(duì)體胚發(fā)生量影響的響應(yīng)面圖及等高線Fig.3 Response surface and contour lines effects of inositol content and synchronized culture period on the occurrence of somatic embryos

圖4 長(zhǎng)白落葉松胚性愈傷組織及早期原胚顯微結(jié)構(gòu)A.長(zhǎng)白落葉松早期原胚的顯微結(jié)構(gòu)；B.體胚形成早期階段的長(zhǎng)白落葉松胚性愈傷組織Fig.4 L.olgensis embryogenic callus and early proembryo microstructure A. Microstructure of early proembryos of L.olgensis; B. Surface structure of embryogenic callus in early stage of somatic embryogenesis of L.olgensis

圖5 長(zhǎng)白落葉松體細(xì)胞胚胎的成熟Fig.5 The mature somatic embryos of L.olgensis

2.2 最佳培養(yǎng)條件的驗(yàn)證

通過(guò)模型優(yōu)化獲得的最適培養(yǎng)條件為：無(wú)機(jī)鹽濃度26.767 7% BM、肌醇濃度10.454 5 g·L-1、培養(yǎng)周期12.656 6 d，體細(xì)胞胚胎的發(fā)生量為337.04 個(gè)·g-1。為便于實(shí)際操作，選取各條件的臨近整數(shù)值，具體為：無(wú)機(jī)鹽濃度25% BM、肌醇濃度10 g·L-1、培養(yǎng)周期13 d，重復(fù)試驗(yàn)3次，體胚平均發(fā)生量為336.46 個(gè)·g-1，與預(yù)測(cè)值336.29 個(gè)·g-1基本一致，表明該方程與實(shí)際情況的擬合良好。

2.3體胚成熟早期培養(yǎng)對(duì)體胚形態(tài)發(fā)生及萌發(fā)的影響

形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在體胚形成早期培養(yǎng)階段，胚性愈傷組織逐漸由半透明轉(zhuǎn)變?yōu)槿榘咨?，組織表面結(jié)構(gòu)也隨之干燥、最終呈繩索狀或顆粒狀(圖4B)；鏡檢原胚的發(fā)育狀態(tài)相對(duì)較好，胚柄類似結(jié)構(gòu)較為粗壯、胚頭飽滿(圖4A)。將這些原胚轉(zhuǎn)接于含ABA的成熟培養(yǎng)基上約15 d，即有數(shù)量可觀、子葉整齊、大小適中、形態(tài)修長(zhǎng)、呈子彈狀的子葉胚出現(xiàn)(圖5)，并且這些胚胎發(fā)生的同步性較高、畸形率低。

相對(duì)而言，未經(jīng)過(guò)渡培養(yǎng)而直接進(jìn)行成熟培養(yǎng)的體胚，其發(fā)生量較低、成熟周期相對(duì)較長(zhǎng)、同步性差、形態(tài)大小不一且畸形胚所占比率較高。通常，原胚團(tuán)接種45 d后才可觀察到零星的子葉胚出現(xiàn)，這些胚胎的苗端雖已分化并形成子葉，但仍有部分胚胎根端的胚柄類似結(jié)構(gòu)未能完全消失，導(dǎo)致下胚軸膨大、愈傷化、根原基發(fā)育異常，這些畸形胚的萌發(fā)較為困難且成苗率極低。

綜上所述，在體胚形成的早期階段，適當(dāng)改變培養(yǎng)基成份進(jìn)行一定時(shí)間的過(guò)渡培養(yǎng)可以促進(jìn)長(zhǎng)白落葉松體胚的發(fā)生與形態(tài)建成，并能明顯提高體胚的數(shù)量與質(zhì)量。最優(yōu)培養(yǎng)條件下獲得的體胚，其萌發(fā)率高達(dá)100%，生根率也達(dá)80%以上(表4)；與原有的長(zhǎng)白落葉松體胚發(fā)生體系[4](子葉胚發(fā)生頻率相對(duì)較低，每克愈傷組織上只發(fā)生67.60～179.89個(gè)子葉胚，體胚的萌發(fā)率僅為75%，而體胚的生根率不足70%)相比有較大改善。

表4體胚成熟早期培養(yǎng)對(duì)體胚萌發(fā)的影響

Table4Effectsofearlyembryocultureonsomaticembryogermination

培養(yǎng)周期Cultureperiod(d)肌醇濃度Inositolcontent(g·L-1)體胚發(fā)生量(個(gè)·g-1)Somaticembryogenesis萌發(fā)率Germinationrate(%)生根率Regenerationrate(%)0—32．33±8．39a62．67±28．87a11．00±5．67a1310336．46±7．25c100b83．33±5．78c1415323．05±4．36b100b50．00±10．0b

注：不同字母表示在0.05水平上差異顯著。

Note:Different letters indicate significant differences at 0.05 level.

3 討論

植物的體細(xì)胞胚胎發(fā)生是一個(gè)極為復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，在體胚發(fā)生的不同階段，原胚團(tuán)及體細(xì)胞胚胎的生理狀態(tài)有所不同[22]。因此需根據(jù)胚胎發(fā)育的需求，適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基的成份。松杉類植物的體細(xì)胞胚胎發(fā)育可分為三個(gè)階段，即原胚團(tuán)時(shí)期、胚胎形成早期及胚胎形成晚期[23～24]。根據(jù)原胚團(tuán)形態(tài)的差異，又可將原胚團(tuán)時(shí)期分為原胚團(tuán)Ⅰ、原胚團(tuán)Ⅱ及原胚團(tuán)Ⅲ等3個(gè)階段[25]。而在這3個(gè)階段的原胚團(tuán)中，僅有處于原胚團(tuán)Ⅲ階段的原胚團(tuán)才能進(jìn)一步發(fā)育形成成熟的體細(xì)胞胚，而增殖培養(yǎng)基中添加的細(xì)胞分裂素(如6-BA、KT)與生長(zhǎng)素(如2,4-D、NAA)會(huì)促使細(xì)胞的無(wú)序分裂而破壞體胚的極性，導(dǎo)致原胚團(tuán)Ⅲ破裂[26]。因此在胚胎形成的早期適當(dāng)改變培養(yǎng)條件，即在體胚成熟早期進(jìn)行過(guò)渡培養(yǎng)利于針葉樹(shù)體細(xì)胞胚胎的形態(tài)建成。

培養(yǎng)介質(zhì)中添加的各類元素在細(xì)胞的生命活動(dòng)過(guò)程中均起著不同的重要作用。植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的不同階段，胚性細(xì)胞對(duì)各種無(wú)機(jī)離子的吸收程度也有所不同[22]。有研究表明，處于不同時(shí)期的胚性懸浮細(xì)胞中氮元素及礦質(zhì)元素的含量變化明顯，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，鈣、銅、鐵的含量逐漸降低；鉀、氮、鎂的含量有所增加；而磷的含量則呈現(xiàn)出先增加后急劇降低的趨勢(shì)[27]。本研究表明，在長(zhǎng)白落葉松體胚成熟的早期階段，適當(dāng)降低培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的濃度可以顯著提高成熟體胚的獲得量。推測(cè)這種現(xiàn)象的原因可能是：某些無(wú)機(jī)鹽(如KCl、KH2PO4、MgSO4)的濃度過(guò)高，影響或抑制了原胚團(tuán)細(xì)胞對(duì)其他無(wú)機(jī)離子(如Zn2+、Cu2+、Co2+、Mn2+等與體胚形成至關(guān)重要的離子)的吸收與利用[22]，其內(nèi)在的分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

肌醇作為一種小分子有機(jī)化合物可以參與滲透壓的調(diào)節(jié)，并為植物的生長(zhǎng)提供碳源，其衍生物還參與如：細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)素的合成及運(yùn)輸及植物細(xì)胞的抗逆調(diào)節(jié)等多種理化過(guò)程[28～33]。有研究表明，肌醇作為合成磷脂酰肌醇以及磷脂酰肌醇磷酸的底物，參與維持內(nèi)膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能，從而影響生長(zhǎng)素調(diào)控植物胚胎的發(fā)育過(guò)程[33]。日本落葉松及日本×長(zhǎng)白落葉松的原胚團(tuán)經(jīng)9 g·L-1肌醇高滲處理42 d，胚頭的質(zhì)量與密度較對(duì)照組有明顯的改善[34]。本文的研究結(jié)果表明：肌醇濃度對(duì)長(zhǎng)白落葉松體胚發(fā)生的影響極為顯著。在體細(xì)胞胚胎成熟的早期階段，適當(dāng)提高肌醇濃度可以促進(jìn)體細(xì)胞胚的成熟。

4 結(jié)論

本研究對(duì)體胚成熟早期階段培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽離子濃度、肌醇濃度及培養(yǎng)周期等因素對(duì)長(zhǎng)白落葉松體胚發(fā)生數(shù)量的影響進(jìn)行了研究，采用響應(yīng)面法進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明：相對(duì)離子濃度(P=0.007)、肌醇濃度(P=0.000)以及培養(yǎng)周期(P=0.000)對(duì)長(zhǎng)白落葉松體胚發(fā)生量的影響極為顯著。模型擬合的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：相對(duì)離子濃度26.767 7% BM、肌醇濃度10.454 5 g·L-1、培養(yǎng)周期12.656 6 d，體胚發(fā)生量為337.04 個(gè)·g-1。實(shí)際操作時(shí)調(diào)整培養(yǎng)條件為：相對(duì)離子濃度25% BM、肌醇濃度10 g·L-1、培養(yǎng)周期13 d，體胚的發(fā)生量為336.46 個(gè)·g-1，其萌發(fā)率與生根率分別可達(dá)100%、83.33±5.78%，為實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)白落葉松良種的規(guī)模化繁育奠定了基礎(chǔ)。

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National High-tech R&D Program(“863” Program 2013AA102704-04-03)

introduction：SONG Yue(1991—)，male，master，Mainly engaged in larch genetic breeding research.

date:2017-01-06

ResponseSurfaceOptimizationofCultureConditionsfortheFormationofEarlyEmbryosinLarixolgensis

SONG Yue LI Shu-Juan*BAI Xiao-Ming ZHANG Han-Guo

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

With the larch embryogenic callus, through the Design Box-Behnken design test, we established a response surface model based on the somatic embryogenesis. The culture conditions of somatic embryo early maturation was optimized inLarixolgensis. The relative ion concentration(P=0.007), the inositol concentration(P=0.000), the culture period(P=0.000) and the interaction between inositol content and culture period(P=0.007) effect on the number of somatic embryos ofL.olgensiswere extremely significant. Cultivation of Larix somatic embryo maturation was 337.04 ind·g-1at the early stage of the most optimum conditions for relative ion content of 26.767 7% BM basic culture medium, inositol 10.454 5 g·L-1, culture time 12.656 6 d, and the number of somatic embryos average. In order to facilitate the practical operation, the culture condition was changed to the relative ion concentration of 25% BM, inositol 10 g·L-1, incubation period of 13 d, then the average number of somatic embryos was 336.46 ind·g-1, that was consistent with the predicted value 336.29 ind·g-1. Compared with previous test, the quantity and quality ofL.olgensissomatic embryos were increased significantly.

Larix;Larixolgensis;response surface optimization;somatic embryogenesis;early embryo formation

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(“863”計(jì)劃2013AA102704-04-03)

宋躍(1991—)，男，碩士研究生，主要從事落葉松遺傳育種方面的研究。

* 通信作者：E-mail：lishujuan@126.com

2017-01-06

* Corresponding author：E-mail：lishujuan@126.com

S791.22；Q943.1

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.04.018