一株近平滑假絲酵母的分離、鑒定和產(chǎn)油的研究

謝鑫磊 林源鋒 魯 昊 田 華 袁 博 鄭 操 陳 濤 何東平

(武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，武漢 430023)(湖北天基生物能源發(fā)展有限公司2，漢川 432300)(中國科學(xué)院武漢病毒研究所3，武漢 430071)

一株近平滑假絲酵母的分離、鑒定和產(chǎn)油的研究

謝鑫磊1林源鋒1魯 昊2田 華1袁 博1鄭 操1陳 濤3何東平1

(武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，武漢 430023)(湖北天基生物能源發(fā)展有限公司2，漢川 432300)(中國科學(xué)院武漢病毒研究所3，武漢 430071)

為了制備生物柴油而獲得高產(chǎn)油脂的酵母，分離出1株產(chǎn)油酵母，利用分子生物學(xué)技術(shù)對其RNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)(ITS區(qū))進(jìn)行了克隆測序，并與GenBank中已有的菌株基因序列進(jìn)行比對；同時(shí)，對該菌株生長發(fā)育和油脂合成進(jìn)行了研究；對生物量、糖氮代謝、油脂含量以及脂肪酸組分進(jìn)行了檢測分析。結(jié)果表明：該菌株ITS序列長度為479 bp，與GenBank中近平滑假絲酵母相比較同源率接近100%，形態(tài)結(jié)果和分子生物學(xué)鑒定表明該菌株為近平滑假絲酵母；該菌在0～12 h期間菌體數(shù)量穩(wěn)定增長，糖氮消耗明顯為近平滑假絲酵母的發(fā)酵適應(yīng)期；12～48 h，此時(shí)菌種快速繁殖，糖氮消耗非常顯著，為近平滑假絲酵母的對數(shù)期；48～120 h，菌體數(shù)量保持穩(wěn)定基本不再增長，糖氮消耗穩(wěn)定為近平滑假絲酵母的穩(wěn)定期；120 h以后，菌體數(shù)量減少，糖氮基本消耗完畢為近平滑假絲酵母的衰退期；在120 h左右胞內(nèi)油脂積累達(dá)到最大值，油脂產(chǎn)量為4.5 g/L，含油率約為22%，脂肪酸組成主要以油酸為主，并含有少量棕櫚酸和亞油酸。因此，該菌作為油脂菌株生產(chǎn)生物柴油具有一定前景,為以后調(diào)整培養(yǎng)基含量來增加菌種油脂產(chǎn)量提供了參考。

近平滑假絲酵母 分離鑒定 產(chǎn)油

微生物油脂又稱單細(xì)胞油脂，是由酵母、霉菌、細(xì)菌和藻類等微生物在一定條件下利用碳水化合物和普通油脂作為碳源在菌體內(nèi)產(chǎn)生的大量油脂[1]。利用微生物生產(chǎn)油脂，與傳統(tǒng)的油脂生產(chǎn)工藝相比，除具有油脂含量高外，還有許多優(yōu)點(diǎn)。微生物細(xì)胞增殖快，生產(chǎn)周期短；微生物生長所需的原料豐富，價(jià)格便宜，如淀粉、糖類、甚至食品工業(yè)和造紙行業(yè)的廢棄物，從而保護(hù)了環(huán)境；用微生物方法生產(chǎn)油脂，比農(nóng)業(yè)生產(chǎn)油脂所需的勞動(dòng)力少，同時(shí)不受季節(jié)、氣候變化的限制；能連續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)成本低；并且可以利用細(xì)胞融合、細(xì)胞誘變等高科技方法，使微生物生產(chǎn)出比動(dòng)、植物油脂更符合人們需要的高營養(yǎng)油脂或某些特定脂肪酸的油脂[2]。

近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)，屬假絲酵母屬[3]，可產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，如還原型谷胱甘肽[3]、氧化還原酶[4]及木糖還原酶[5]等，是具有催化能力的菌株[6-7]，也可作為發(fā)酵劑用于肉制品發(fā)酵[8]，因此具有較好的發(fā)展前景。目前，國內(nèi)外對于近平滑假絲酵母的研究多集中于醫(yī)學(xué)方面，主要是對假絲酵母感染人體造成婦科病的研究，以及對還原酶等生物催化劑方面的研究，而對于其生物量以及是否產(chǎn)油則研究較少。本試驗(yàn)通過篩選產(chǎn)油菌株得到1株酵母，利用分子生物學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行菌種鑒定，并對培養(yǎng)條件、形態(tài)學(xué)特征、生物量和產(chǎn)油進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與試劑

近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)分離于實(shí)驗(yàn)室其他產(chǎn)油菌株，保存于本實(shí)驗(yàn)室，菌號為20164071。

葡萄糖：天津博迪化工股份有限公司；酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白胨：天津市大茂化學(xué)試劑廠；酵母提取物、色譜級正己烷、鹽酸、石油醚、乙醚：天津市科密歐化學(xué)試劑制造有限公司；50%三氟化硼-甲醇：山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；無水乙醇：天津天力化學(xué)試劑有限公司；TSP101基因組抽提試劑盒：北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體篩選培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5,葡萄糖10，酵母膏3，麥芽提取物3，瓊脂20，pH 6.5。種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨5，葡萄糖10，酵母膏3，麥芽提取物3,pH 6.5。發(fā)酵培養(yǎng)基在種子培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加大了各成分的用量。

1.1.3 儀器

Agilent SP-2560氣相色譜儀：安捷倫科技(中國)有限公司；SPX-150C恒溫恒濕箱、GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HYQ-150S全溫?fù)u床：武漢匯誠生物科技有限公司，YM75立式壓力蒸汽滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；XSP-BM-2CA光學(xué)生物顯微鏡：寧波永新光學(xué)有限公司；RE-52C 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；TDZ5-WS臺式低速離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)油菌株的篩選

將長勢良好的斜面菌種挑取1環(huán)，接種于固體篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件27 ℃。然后經(jīng)多次轉(zhuǎn)接活化之后挑選生長良好的單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件27 ℃，180 r/min，培養(yǎng)48 h，然后以10%的接種量接種于裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，培養(yǎng)條件27 ℃，180 r/min，培養(yǎng)96 h。

1.2.2 菌株鑒定方法

1.2.1.1 基因組提取

將菌株挑取到無菌的超純水中，用移液器充分混勻，高溫加熱到90 ℃，釋放基因組。然后通過基因組抽提試劑盒，抽提得到該菌的基因組DNA。

1.2.1.2 ITS區(qū)擴(kuò)增

將擴(kuò)增好的基因組樣品通過特異性的鑒定引物，擴(kuò)增出目的片段。體系為：TSINGKE 金牌MIX 46μL，ITS1 1 μL，ITS4 1 μL，基因組2 μL。擴(kuò)增出片段大小為 500～700 bp的ITS區(qū)產(chǎn)物。

1.2.1.3 PCR產(chǎn)物純化及測序

將PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶。然后通過(GE0101)DNA凝膠回收試劑盒回收。然后將純化后的產(chǎn)物通過ABI的測序mix，PCR純化產(chǎn)物以及ITS引物，進(jìn)行測序PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物通過ABI3730xl測序儀進(jìn)行檢測，并將檢測結(jié)果整理后發(fā)送。

1.2.3 發(fā)酵過程中糖氮代謝的測定

1.2.3.1 含糖量的測定

蒽酮-硫酸法測定總糖

制定標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別取2 mg/mL葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用蒸餾水補(bǔ)到2.0 mL，空白管吸取2 mL蒸餾水。分別加入8.0mL蒽酮試劑，迅速浸入冰水浴中冷卻，各管加完后一起浸入沸水浴中10分鐘，封口防政法，取出用自來水冷卻，室溫放置10 min，于620 nm處比色。以吸光度為縱坐標(biāo)，糖含量為橫坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品含量測定：取樣品溶液2.0 mL，加入8 mL蒽酮試劑，同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，比色測定記錄吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算糖含量。對不同時(shí)間培養(yǎng)液從0 h起依次進(jìn)行測定，記錄數(shù)據(jù)，繪制培養(yǎng)液的糖代謝曲線[10]。

1.2.3.2 含氮量的測定

每隔12 h從搖瓶中取適量發(fā)酵液，用四層紗布過濾后取2 mL加入到裝有10 mL蒸餾水的燒杯中，再加入1滴甲基紅。用0.3 mol/L的硫酸調(diào)制紅色，然后以0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)制橙黃色，再加入4 mL18%中性甲醛。靜置10分鐘后加入8滴酚酞，用0.1 mol/L氫氧化鈉滴定至微紅后記錄氫氧化鈉使用量[11]。發(fā)酵液中氮含量的計(jì)算公式：

N= (0.1×V×0.014)/2×100

式中：N為氮含量；V為氫氧化鈉消耗的體積。

1.2.4 發(fā)酵過程中pH值測定

從菌株加入發(fā)酵瓶開始計(jì)時(shí)，每隔12 h取少量發(fā)酵液用pH計(jì)測其pH值。

1.2.5 生物量測定

近平滑假絲酵母的生物量以細(xì)胞干重計(jì)。取培養(yǎng)好的菌體發(fā)酵液100 mL于預(yù)先稱重好的離心管中以4 000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀的菌泥用鑰匙刮出置于18 cm大平皿中，然后再往離心管中加入適量蒸餾水繼續(xù)離心一次，取出剩余菌泥。將菌泥置于烘箱中于60 ℃下烘干至質(zhì)量恒定，稱質(zhì)量。生物量(g/L)的計(jì)算公式為：

1.2.6 油脂的提取及產(chǎn)量的測定

油脂的提?。簩⒔交俳z酵母發(fā)酵液經(jīng)過離心后，去除上清液，向所得藻泥中加入100 mL 6 mol/L鹽酸，震蕩混勻，室溫放置1 h后沸水浴加熱8 min后置于-20 ℃迅速冷卻30 min，倒入分液漏斗中，加入150 mL無水乙醇震蕩再加150 mL乙醚與150 mL石油醚萃取，收集有機(jī)層于已稱重的試管中，記錄空試管質(zhì)量為m1；加熱使有機(jī)溶劑揮發(fā)，稱重，記錄此時(shí)試管質(zhì)量為m2，油脂產(chǎn)量(g/L)和含油率計(jì)算公式為：

1.2.7 油脂成分的分析

1.2.7.1 待測樣品的處理: 精密稱取0.2 g油脂于20 mL試管中，加入0.5 mol/L的NAOH-CH3OH溶液2 mL，邊振蕩邊在60 ℃水浴中保溫30 min，冷卻后加入50%的BF3-CH3OH溶液2 mL，邊振蕩邊在60 ℃水浴下保溫3 min,加入2 mL正己烷，混勻，以2 000 r/min離心1 min，取上清液。然后用進(jìn)樣針經(jīng)過濾膜過濾之后注射進(jìn)進(jìn)樣瓶中待測。

1.2.7.2 油脂脂肪酸組成分析：選用Agilent SP-2560色譜柱(100 m×25 μm，0.2 μm)；升溫程序：初始溫度100 ℃，保持4 min，然后以3 ℃/min升溫至230 ℃，保持20 min，載氣(N2)流速25 mL/min，壓力2.4 kPa，進(jìn)樣量1 μL；分流比30∶1

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選和鑒定

菌株產(chǎn)生的單菌落呈圓狀黏稠白色如圖1所示。顯微鏡下單細(xì)胞個(gè)體呈圓形或橢圓形，未見芽殖及假絲菌，如圖2所示。

近平滑假絲酵母ITS區(qū)序列檢測結(jié)果：

CTTCCGTTAGCACTTACTGCATTTTTTCTTACA-CATGTGTTTTTCTTTTTTTGAAAACTTTGCTTTGGTA-GGCCTTCTATATGGGGCCTGCCAGAGATTAAACTC-AACCAAATTTTATTTAATGTCAACCGATTATTTAAT-AGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCG-CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAA-TATGAATTGCAGATATTCGTGAATCATCGAATCTTT-GAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCA-TGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCCCTCAAACCCTCGG-GTTTGGTGTTGAGCGATACGCTGGGTTTGCTTGAAA-GAAAGGCGGAGTATAAACTAATGGATAGGTTTTTTC-CACTCATTGGTACAAACTCCAAAACTTCTTCCAAAT-TCGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACT-AAGCATATCAAAAA

測序結(jié)果表明所測菌ITS區(qū)序列長度為479 bp，經(jīng)比對，該菌ITS區(qū)序列與GenBank中登錄的已知菌株Candida parapsilosis H142B(KP674827.1)，Candida parapsilosis n63b(KP675664.1)，Candida parapsilosis M180A(KP675355.1)，Candida parapsilosis M83A(KP675285.1)，Candida parapsilosis H275B(KP674969.1)，Candida parapsilosis H267C(KP674958.1)，Candida parapsilosis H230B(KP674908.1)同源率均為100%。依據(jù)形態(tài)學(xué)并結(jié)合18sRNA序列比對結(jié)果，鑒定該菌為近平滑假絲酵母。

圖1 菌落形態(tài)

圖2 菌株顯微形態(tài)

2.2 近平滑假絲酵母的生長曲線

從圖3中可見，0～12 h過程中，圖中曲線平滑前進(jìn)，菌體數(shù)量穩(wěn)定增長，可以確定為近平滑假絲酵母的發(fā)酵適應(yīng)期；12～48 h過程中，曲線快速上升，此時(shí)菌種快速繁殖，可以確定此期間為近平滑假絲酵母的對數(shù)期；48～120 h過程中，菌體數(shù)量保持穩(wěn)定基本不再增長，此期間為近平滑假絲酵母的穩(wěn)定期；120 h以后，發(fā)現(xiàn)曲線有下降趨勢，菌體數(shù)量減少，說明此期間為近平滑假絲酵母的衰退期。

圖3 近平滑假絲酵母生長曲線圖

2.3 糖氮代謝及pH值的變化

從圖4可以看出，發(fā)酵液的pH值是逐漸下降的，說明近平滑假絲酵母在發(fā)酵過程中是產(chǎn)酸的，并且在24～84 h這一過程中pH值迅速下降之后趨于平穩(wěn)，說明這一時(shí)間段內(nèi)近平滑假絲酵母大量產(chǎn)酸，之后在摸索調(diào)配最佳培養(yǎng)基時(shí)我們可以在這一時(shí)間段內(nèi)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值使其穩(wěn)定在中性。從圖5和圖6可以看出，在生長期以及對數(shù)期，培養(yǎng)基中糖和氮的消耗都非常明顯，基本都是到了84 h時(shí)全部消耗殆盡了。油脂的產(chǎn)生需要糖來轉(zhuǎn)化，而含氮量也影響著微生物的生長，因此在后續(xù)優(yōu)化培養(yǎng)基的過程中我們可以使適當(dāng)提高含糖量以及含氮量，或者在菌種糖氮消耗完時(shí)適當(dāng)補(bǔ)充一定的碳源和氮源，以期使得菌種個(gè)體生長的更大能產(chǎn)生更多的油出來。

圖4 不同時(shí)期發(fā)酵液pH值

圖5 不同時(shí)期發(fā)酵液糖濃度

圖6 不同時(shí)期發(fā)酵液氮濃度

2.4 油脂產(chǎn)量和得油率

通過圖7和圖8可以看出近平滑假絲酵母發(fā)酵120 h的時(shí)候油脂產(chǎn)量達(dá)到最大,而得油率也在此時(shí)達(dá)到最高。發(fā)酵120 h之后油脂產(chǎn)量和得油率都開始小幅度下降。所以近平滑假絲酵母最佳的發(fā)酵時(shí)間約為120 h。

圖7 不同時(shí)期油脂產(chǎn)量

圖8 不同時(shí)期得油率

2.5 近平滑假絲酵母胞內(nèi)油脂脂肪酸組分測定

通過圖9和表1，可以得到近平滑假絲酵母胞內(nèi)油脂成分的組成結(jié)果。從結(jié)果發(fā)現(xiàn)脂肪酸組成與橄欖油的脂肪酸組成相似。成分組成以油酸為主，并含有少量的棕櫚酸和亞油酸。

圖9 近平滑假絲酵母胞內(nèi)油脂脂肪酸氣相-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)總離子流圖

脂肪酸種類脂肪酸相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%C16∶013．7C18∶173．2C18∶213．1

4 結(jié)論

經(jīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)分離、篩選的菌株，利用菌體形態(tài)、菌落特征以及通過分子生物學(xué)進(jìn)行ITS區(qū)檢測得出菌株為近平滑假絲酵母。對近平滑假絲酵母的生物量、糖氮代謝、pH值、油脂含量以及脂肪酸組成進(jìn)行了分析，得出在120 h左右胞內(nèi)油脂積累達(dá)到最大值，油脂產(chǎn)量為4.5 g/L,含油率約為22%。確定近平滑假絲酵母所產(chǎn)油脂的脂肪酸組成與橄欖油相似。該菌作為油脂菌株生產(chǎn)生物柴油具有一定前景，本研究為后續(xù)繼續(xù)研究近平滑假絲酵母，調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基成分以增加油脂產(chǎn)量提供了借鑒。

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Seperation, Identification and Oil Production of aCandidaParapsilosisStrain

Xie Xinlei1Lin Yuanfeng1Lu Hao2Tian Hua1Yuan Bo1Zheng Cao1Chen Tao3He Dongping1

(College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University1, Wuhan 430023) (Hubei Tianji New Energy Limited by Share LTD2, Hanchuan 432300) (Wuhan Institute of Virus, Chinese Academy of Sciences3, Wuhan 430071)

In order to gain the yeast with high oil yield for preparing biodiesel and isolating one yeast strain, cloning and sequencing of its internal transcribed region (ITS region) of RNA gene was performed by molecular biology technique. Also it is compared with the existing gene sequences in GenBank. At the same time, the growth and development of this strain were studied. The biomass, carbohydrate and nitrogen metabolism, lipid content and fatty acid composition were also test and analyzed in our study. Results showed that firstly the strain ITS sequence length was 479 bp, compared with theCandidaparapsilosisin GenBank, the homology rate was close to 100%. Results of morphological and molecular biology identification showed that the strain wasCandidaparapsilosis. Secondly the number of bacteria increased steadily during 0～12 h. Sugar and nitrogen consumed obviously. It is the adaptation period ofCandidaparapsilosis; during 12～48 h the bacterias propagated rapidly. Sugar and nitrogen consumption were very significant. It is the Logarithmic phase ofCandidaparapsilosis; during 48～120 h, the number of bacteria remained stable and no longer increased. Sugar and nitrogen consumed stably. It is the stable phase ofCandidaparapsilosis; after 120 h, the number of bacteria decreased. Sugar and nitrogen were all consumed. It is the recession period ofCandidaparapsilosis; thirdly the accumulation value of intracellular oil reached the maximum at 120 h. Oil yield was 4.5 g/L, and the oil content was about 22%, the fatty acid composition was mainly oleic acid, and contained a small amount of palmitic acid and linoleic acid. It can be seen from the results that there are some prospects of this yeast for the production of bio diesel oil. This paper lays a foundation for adjusting the content of medium to increase the oil yield.

candidaparapsilosis,separation and identification,oil production

Q939

A

1003-0174(2017)10-0100-06

2017-04-27

謝鑫磊，男，1993年出生，碩士，微生物油脂

何東平，男，1957年出生，教授，糧食、油脂及植物蛋白