• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    丁香油抗炎鎮(zhèn)痛效果的研究

    2017-11-10 14:18楊冰李婷婷楊伊涵張煒李小軍李玉桑從仁懷唐和斌
    綠色科技 2017年20期
    關鍵詞:酸鈉抗炎丁香

    楊冰 李婷婷 楊伊涵 張煒 李小軍 李玉桑 從仁懷 唐和斌

    摘要:指出了丁香油是從中藥丁香中提取出來的揮發(fā)油,文獻報道其主要作用是抑菌消炎,但尚未見有報道研究其鎮(zhèn)痛效果及可能機制。研究中用完全弗氏佐劑CFA注射大鼠足底皮膚誘致疼痛作為無菌性的可持續(xù)疼痛模型,檢測了丁香油的消炎特別是鎮(zhèn)痛作用;并在細胞水平上進一步驗證了丁香油主要成分丁香酚對炎癥的抑制作用。研究證明:丁香油通過抑制COX|2上調,可以減輕CFA注射大鼠誘發(fā)的足底腫脹、熱痛覺過敏,表明丁香油具有進一步開發(fā)為改善慢性疼痛藥物的潛質。

    關鍵詞:丁香油;抗炎;鎮(zhèn)痛;COX|2

    中圖分類號:R285

    文獻標識碼:A文章編號:16749944(2017)20018204

    1引言

    慢性疼痛顯著地降低了罹患癌癥和糖尿病等慢性疾病病人的生活質量,使得本來就重擔在身的生活雪上加霜。因而,在臨床研究中,如何能發(fā)現(xiàn)更有效的鎮(zhèn)痛藥是一個巨大的挑戰(zhàn)[1,2]。另外,市售鎮(zhèn)痛藥常有很多副作用,如胃腸道反應、嗜睡、瘙癢、成癮性和呼吸抑制等[3]。為此,尋找并發(fā)現(xiàn)新型高效的具有更高安全性的鎮(zhèn)痛藥也是醫(yī)藥界的一大難題。最近許多相關研究發(fā)現(xiàn),某些中草藥或中草藥提取物能有效的治療或緩解疼痛,如苦參提取物,青風藤提取物[4],以及傳統(tǒng)上用于止痛的25種植物[5]。

    本研究涉及的中藥丁香是桃金娘科番櫻桃屬植物丁香的干燥花蕾,又名公丁香,別名丁子香等。味辛、性溫,歸脾、胃、肺、腎經;為食藥兩用中草藥,也是名貴香料[6]。丁香油是從丁香中分離提取得到的芳香性揮發(fā)油,是主要的抑菌成份。丁香油主要成分已經鑒定出,分別是丁香酚、β-石竹烯和乙?;∠惴覽7]。丁香油主要用于化妝品,食品芳香劑、防腐劑,臨床主要用于牙痛、風濕性疼痛及一些菌性炎癥[8]。

    目前,尚未見評估丁香油改善炎性疼痛作用的研究。本研究利用大鼠的足底炎性疼痛模型,引入兩種不同的評價方法來測試丁香油抗炎和鎮(zhèn)痛作用。此外,還在細胞水平上檢測了與炎癥誘導密切相關的分子環(huán)氧化酶COX|2的表達水平[9]。

    2實驗材料和方法

    2.1實驗儀器

    熱痛儀(意大利Ugo Basile);足趾腫脹儀(成都泰盟);水置換體積計(PV-200;成都泰夢軟件有限公司,中國成都);電泳儀(美國,BIO-RAD);等。

    2.2實驗試劑

    完全弗氏佐劑(CFA,美國Sigma公司);生理鹽水(武漢濱湖雙鶴藥業(yè));雙氯芬酸鈉(北京諾華);丁香油和氣相色譜-質譜(GCMS)丁香油的結果由無限極(中國)有限公司,廣州。所有其他試劑均購自Sigma-Aldrich,USA。

    2.3實驗動物

    在實驗開始之前,將96只年輕雄性Wistar大鼠(190~250 g)在無病原體實驗室飼養(yǎng)7 d,保證實驗室12 h光-夜循環(huán),溫度為22~25℃。許可證號:SCXK(鄂)2008-0005,合格證編號:No.42000600004036。

    2.4實驗方法

    2.4.1丁香油的分離提取

    2.4.1.1蒸餾丁香油

    將干燥丁香花蕾(購自中國廣西藥品廣西中藥廣州藥業(yè)中藥廠)粉碎并與水以1 g∶10 mL混均。然后,在蒸汽蒸餾裝置中蒸餾混合物8 h得丁香油。

    2.4.1.2 GCMS分析丁香油

    將丁香油(0.103 g)置于裝有正己烷(色譜純)的10 mL容量瓶中定容并混均。取上述溶液0.5 μL進樣到GC。檢測器為質譜選擇性Agilent 5975 檢測器,并耦合GCMS分析裝置Agilent 7890(II)GC。用HP-5MS毛細管柱分離揮發(fā)性化合物。溫度由40℃ (1 min) 以5℃/min升到220℃,并保持1 min;載氣為氦氣,流速為1.0 mL/min。分析丁香揮發(fā)油時,使用分流模式,比例為1∶60,噴射器溫度為240℃,所有樣品一式三份進行分析。用正烷烴計算保留指數(shù)(RI),通過比較其RI相對于從HP-5MS柱獲得C4-C30正烷烴的值來鑒定組分;并將所得結果與NIST質譜提供的數(shù)據(jù)庫進行比較,當質譜和RI值良好匹配時,確定正確識別組分。

    2.4.2炎癥性疼痛模型

    將大鼠隨機分為對照組(替代CFA的生理鹽水注射)和CFA誘發(fā)的炎性疼痛組(CFA注射),不同組詳細內容見“結果”部分。將150 μL CFA皮下注射到大鼠左后足底部,誘導炎癥性疼痛;對照大鼠注射等體積生理鹽水。注射CFA后,將對照組大鼠隨機分為3組(對照組),分別在第1周,第2周或第3周結束時處死。同時將CFA組隨機分為CFA處理組(CFA),CFA處理連續(xù)灌胃雙氯芬酸鈉組(CFA+diclo,30 mg/kg/d,諾華,北京),以及CFA處理連續(xù)灌胃丁香油組(CFA+ Clove Oil,10 mg/kg)。這些大鼠也分別第1周,第2周或第3周結束時處死。

    2.4.3炎癥評估

    通過測量足底腫脹大小來評估炎癥程度。用水置換體積計(PV-200;成都泰夢軟件有限公司)測量每只大鼠左足與其右足的體積,每只足被測3次,取其平均值。

    2.4.4疼痛評分測試

    全部行為評估均按照國際疼痛研究協(xié)會(IASP)的道德準則進行。所有行為測試都在雙盲條件下進行。并且,所有行為測試均在以下時間點進行:CFA注射后1,2或3周;評估疼痛評分也是在雙盲情況下4人分別單獨完成。具體方法及過程請參看本實驗室前期文章。

    2.4.5熱痛覺過敏試驗

    為了確定給藥處理后大鼠對熱刺激的傷害感受反應情況,使用足退縮反應潛伏期(WRL)值來測量。即是,將動物放在具有玻璃地板的塑料室中,使其適應10 min;輻射熱源置于大鼠每只后足所在的玻璃地板下方。使用足底測試儀(Ugo Basile Srl,Varese,Italy)測量足WRL值精確到0.1 s。校準光源強度,以在自然狀態(tài)下動物在16~25 s范圍內產生足退縮反應為度。大鼠兩只后足每只測3次,取其平均值。計算每只后足的WRL值。測量時間設定為60 s。endprint

    2.4.6細胞實驗

    選取NIH3T3細胞,用DMEM高糖培養(yǎng)基加入10% CS作為完全培養(yǎng)基,于37℃,5% CO2條件下進行培養(yǎng)。Western blot法測定細胞COX|2蛋白的表達水平:接種培養(yǎng)生長對數(shù)期NIH3T3細胞系于35 mm皿中,經不同濃度丁香酚干預2 h后,換液再加入400 ng/mL LPS和不同濃度丁香酚共處理24 h。提取細胞總蛋白,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉移至PVDF濾膜,5%脫脂奶粉封閉,加入針對COX|2抗原的抗體;洗滌后加入相對應HRP標記的二抗,加入化學發(fā)光底物進行顯色,分析目標蛋白條帶光密度。

    2.4.7統(tǒng)計分析

    本文中所有行為測試結果(除非另有說明)以平均值±SEM的形式表示為CFA注射足以及對照足的值。在Origin8.0(Originlab Corp.,MA,USA)進行單因素方差分析,然后進行Bonferroni posttests統(tǒng)計分析。所有測試均為雙尾,P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義,在所有圖中*,**或***分別表示P<0.05、0.01或0.001。

    3結果

    3.1鑒定丁香油的組成

    本研究中使用的丁香油主要化合物是丁香酚(78.69%)、β-石竹烯(11.74%)、α-石竹烯(1.59%)、石竹烯氧化物(1.11%)等。描述主要化合物的數(shù)據(jù)如表1所示,將分離鑒定出的成分與文獻[7]對比發(fā)現(xiàn),除文獻中乙?;∠惴樱?.60%)含量較多外,丁香酚(70.61%)、β-石竹烯(18.91%)、α-石竹烯(2.12%)差別不大;考慮到丁香的來源、分離提取的方法以及所使用的儀器,這些差別是可接受的,也表明我們的鑒定結果是可靠的。

    3.2丁香油減輕CFA注射誘發(fā)的大鼠后足炎性腫脹

    為了評價丁香油的抗炎和鎮(zhèn)痛作用,將應用材料和方法部分描述的CFA注射大鼠模型進行研究。如圖1(a)所示,在CFA注射前,在每組大鼠的右后足未觀察到腫脹。在CFA注射后,與對照組相比,大鼠注射的后足顯示出一定水平的腫脹(圖1(b),模型組233.68 ± 6.83%,對照組為103.47 ± 1.11%, n=19),且腫脹程度呈時間依賴性降低。給予不同的治療(陽性藥組給藥雙氯芬酸鈉,30 mg/kg/d,n=19;丁香油組給藥丁香油,10 mg/kg/d 等同60 kg人給藥100mg /d,n=19),與模型組相比,腫脹程度降低得更快。更重要的是,在丁香油存在下,大鼠后足腫脹程度降低比陽性藥組明顯增加,只在第21 d時腫脹程度降低不如陽性藥組明顯(第7d,丁香油組159.29±4.67%,陽性藥組164.64±3.70%;第14d,丁香油組133.10±3.74%,而陽性藥組為141.09±5.61%;第21 d,陽性藥組128.41±1.86%,而丁香油組為135.37±5.46%)。且在實驗過程中,每組大鼠的左后足均未觀察到腫脹(圖1c)。對比陽性藥組和丁香油組的結果,我們發(fā)現(xiàn)丁香油的抗炎效果優(yōu)于雙氯芬酸鈉的抗炎效果。

    3.3應用丁香油部分恢復CFA注射大鼠誘發(fā)的疼痛

    為了更好地表征不同給藥處理下大鼠炎癥相關的疼痛狀態(tài),本研究中引入了疼痛評分試驗。疼痛評分試驗的詳細過程在前文已有描述。如圖2(a)所示,模型組CFA注射后,其疼痛評分從第0d 0.27±0.06被提高到第1 d 1.70±0.07,且在實驗過程中持續(xù)21 d保持在相對較高的水平(第21 d為1.06±0.18),表明CFA注射成功誘發(fā)大鼠后足顯著并可持續(xù)的疼痛。陽性藥雙氯芬酸鈉給藥處理后,疼痛評分在第1 d下降至1.17±0.07,并進一步下降。在第21 d降至0.72±0.17。丁香油給藥后,在第1 d將疼痛評分降低至1.39±0.12,然而,其后下降加快,在第21d將疼痛評分降低至0.58±0.13,與對照組(0.53±0.23)相當,但超過雙氯芬酸鈉給藥的效果。表明丁香油能更好地減輕由CFA注射引起的炎性疼痛反應。

    注:對照組;模型組;陽性藥(雙氯芬酸鈉)組;丁香油組。 *,**,***分別代表P<0.05,0.01,0.001。數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示

    接著考慮利用傳統(tǒng)的熱痛痛閾檢測來進一步評估丁香油改善炎性疼痛的作用。如圖2(b)所示,觀察到CFA注射后熱誘導的疼痛反應快速而顯著的增敏,并隨試驗時間的延長逐步回升。陽性藥組給予雙氯芬酸鈉治療后,大鼠的熱痛閾值從第1d的33.22±2.67%到第14d的79.33±7.46%、第21d的100.86±13.16%,遞增約3倍。而給予丁香油治療后,大鼠的熱痛閾值從第1d的34.87±2.45%到第14d的78.66±4.32%、第21d的83.69±11.11%,遞增約2倍多。與陽性藥組雙氯芬酸鈉的效果類似,丁香油對炎性疼痛也顯示較好的效力。

    注:數(shù)據(jù)均以平均值±SEM表示。

    3.4丁香油應用在細胞水平上抑制COX|2表達

    眾所周知,丁香油具有抗致病性真菌、葡萄球菌、痢疾和大腸桿菌等多種微生物的功效;并早已應用于牙痛、皮膚病、菌類引起的炎癥等。在本文前面已經證實,丁香油中主要成份為丁香酚,這與文獻報道的結果是相符的。前人研究表明:丁香酚是丁香油中起作用的主要成份。目前,已經證明CFA注射可誘導大鼠COX|2表達[10~12]。LPS為較為常用的炎癥誘導劑。為了檢測丁香油的應用是否是通過抑制COX|2來減輕疼痛,我們擬用丁香酚和LPS刺激NIH3T3細胞,收集蛋白并用蛋白雜交檢測COX|2的表達。如圖3所示,COX|2的表達量在丁香酚和LPS處理后有所變化。單獨LPS處理后NIH3T3細胞內COX|2表達顯著上調;丁香酚和LPS共同刺激后,隨丁香酚的濃度增加COX|2表達顯著下調。提示丁香酚可抑制NIH3T3細胞的COX|2表達,且抑制能力與其濃度正相關;進一步提示丁香油是通過抑制CFA注射大鼠誘導的COX|2表達上調來減輕疼痛。endprint

    4結論及討論

    4.1結論

    本文已經證明丁香油可以通過抑制COX|2的表達上調來潛在地緩解CFA注射大鼠誘發(fā)的關節(jié)腫脹和熱痛覺過敏,因此丁香油有望成為一種緩解慢性炎癥和疼痛的潛在藥。

    注:不同濃度丁香酚和LPS處理鼠源NIH3T3細胞后蛋白雜交得到的COX|2表達及定量圖。數(shù)據(jù)均以平均值 ± SEM表示

    圖3丁香油通過抑制COX|2表達來緩解疼痛

    4.2討論

    丁香油主要成分為丁香酚,其也是藥物活性的主要成分。丁香酚有多種藥理藥效作用,但也存在一些毒副作用:例如有一定的腐蝕性;有刺激性,其會引起呼吸綜合癥;誤食后其會導致代謝性酸中毒[13]。有報道稱,丁香酚用于牙痛時會引起慢性蕁麻疹、接觸性蕁麻疹、變應性接觸性皮炎等過敏反應[14]。在該研究中,丁香油用量較小;并且在實驗中,大鼠用丁香油處理后,沒有觀察到其任何異常行為。因此,本研究中使用的丁香油至少對于實驗動物是安全的。為了人類的進一步使用,應進行更多的毒性和安全性實驗。

    在本研究中,大鼠經CFA注射后成功地在熱和觸覺刺激下產生了應激反應(疼痛評分試驗檢測到大鼠在行走期間的恢復行為,其可被視為觸覺應激反應),表明CFA注射可致如前所述的疼痛[15]。然而,與以前的研究不同,本研究中CFA注射大鼠后3周,依然檢測到相對持久的異常性疼痛和熱痛覺過敏。數(shù)據(jù)顯示,在第3周特別是模型組的測試大多數(shù)沒有恢復到對照組水平,表明CFA注射對大鼠的影響至少可持續(xù)3周。

    雙氯芬酸鈉屬于非甾體類抗炎藥,其是最常用的鎮(zhèn)痛藥之一[16]。其作為抗炎鎮(zhèn)痛藥,它可能是前列腺素最有效的抑制劑;常用于治療風濕性疾病[17]和術后止痛[18]等。然而,諸如頭痛、頭暈、皮疹、水腫以及對腎肝的潛在損傷等副作用限制了其臨床應用。為此,人們進行了許多研究,嘗試用其他物替代雙氯芬酸鈉,如維生素B和維生素E[19]。除副作用外,雙氯芬酸鈉(30 mg/kg/d)在抗炎方面不如該研究中觀察到的丁香油那樣有效。相比之下,丁香油在抗炎方面表現(xiàn)更好。

    多年來,人們一直認為COX|2在炎癥引起的疼痛中發(fā)揮重要作用,研究已經表明,大鼠經CFA注射后6 h,其COX|2蛋白和mRNA表達水平急劇升高[20]。然而,在本研究中已經在細胞水平證明COX|2的上調可被丁香酚抑制,這表明丁香油具有緩解炎癥和慢性疼痛的作用。

    參考文獻:

    [1]

    Mogil J S, Davis K D, Derbyshire S W. The necessity of animal models in pain research[J]. Pain, 2010, 151(1):12~17.

    [2]Johannes C B, Le T K, Zhou X, et al. The prevalence of chronic pain in United States adults: results of an Internet-based survey.[J]. Journal of Pain, 2010, 11(11):1230.

    [3]旋靜. 鎮(zhèn)痛藥的不良反應及處理的臨床發(fā)展概況[J]. 中國醫(yī)藥指南, 2015(16):50~51.

    [4]周志梅, 郭世民, 何靜,等. 鎮(zhèn)痛中藥的研究進展[J]. 云南中醫(yī)中藥雜志, 2007, 28(4):52~54.

    [5]Adebayo S A, Dzoyem J P, Shai L J, et al. The anti-inflammatory and antioxidant activity of 25 plant species used traditionally to treat pain in southern African[J]. Bmc Complementary & Alternative Medicine, 2015, 15(1):1~10.

    [6]朱金段, 袁德俊, 林新穎. 丁香的藥理研究現(xiàn)狀及臨床應用※[J]. 中國藥物經濟學, 2013(1):32~35.

    [7]但春, 丁立生, 彭樹林, 等. 丁香和升麻的化學成分研究[D]. 北京:中國科學院, 2006.

    [8]李英嘉, 劉洪章. 丁香揮發(fā)油的研究進展[J]. 黑龍江農業(yè)科學, 2014(7):148~151.

    [9]朱小燕, 郭曲練, 等. P300 介導調控神經病理性疼痛因子COX|2的表觀遺傳學研究[D]. 長沙:中南大學, 2013.

    [10]Seybold V S, Jia Y P, Abrahams L G. Cyclo-oxygenase-2 contributes to central sensitization in rats with peripheral inflammation[J]. Pain, 2003, 105(1-2):47~55.

    [11]Maciel I S, Silva R B, Morrone F B, et al. Synergistic effects of celecoxib and bupropion in a model of chronic inflammation-related depression in mice.[J]. Plos One, 2013, 8(9):e77227.

    [12]Fang J Q, Fang J F, Liang Y, et al. Electroacupuncture mediates extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathways in the spinal cord of rats with inflammatory pain[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2014, 14(1):1~12.endprint

    [13]孔曉軍, 李劍勇, 等. 阿司匹林丁香酚酯的致畸致突變研究[D]. 北京:中國農業(yè)科學院, 2013.05.

    [14]Tammannavar P, Pushpalatha C, Jain S, et al. An unexpected positive hypersensitive reaction to eugenol[J]. Bmj Case Reports, 2013.

    [15]王倩, 張娟, 周一,等. CFA注射致炎性疼痛過程中海馬內BDNF的表達及作用研究[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學進展, 2014, 14(36):7001~7006.

    [16]陸小松, 吳天興, 曹杰,等. 雙氯芬酸鈉的研究進展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2016(5):81~84.

    [17]盛桂華, 朱海亮, 等. 非甾體抗炎藥雙氛芬酸配合物的合成、結構表征及其生物活性研究[D]. 南京:南京大學, 2015.

    [18]Mohammadi S S, Abdi M, Movafegh A. Comparing Transcervical Intrauterine Lidocaine Instillation with Rectal Diclofenac for Pain Relief During Outpatient Hysteroscopy: A Randomized Controlled Trial[J]. Oman Medical Journal, 2015, 30(3):157.

    [19]Sena M M, Chaudhry Z F, Collins C H, et al. Direct determination of diclofenac in pharmaceutical formulations containing B vitamins by using UV spectrophotometry and partial least squares regression[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis, 2004, 36(4):743~749.

    [20]Fang J Q, Fang J F, Liang Y, et al. Electroacupuncture mediates extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathways in the spinal cord of rats with inflammatory pain[J]. BMC Complementary and Alternative Medicine, 2014, 14(1):1~12.

    Anti-inflammatory and Analgesic Effects of Clove Oil

    Yang Bing1, Li Tingting1, Yang Yihan1, Zhang Wei1, Li Xiaojun1, Li Yusang1, Cong Ronghuai2, Tang Hebin1

    (1.School of Pharmaceutical Sciences,South-central University for Nationalities,Wuhan,Hubei,430074,China;

    2.Infinitus (China) Company Ltd., Guangzhou, Guangdong, 510665, China)

    Abstract: Chronic pain, or sometimes referred to as sustainable pain, could cause physical and mental suffering and hence reduce the life quality of patients with chronic diseases such as cancer and diabetes. In recent years, Chinese Medicine, the treasure of Chinese traditional physic, has drawn more and more attentions for the search of effective drugs that can suppress chronic pain. The drug effect of Clove oil, a kind of volatile oil extracted from a Chinese traditional medicine, Ding Xiang, or Syzygiumaromaticum L., is mainly restricted in anti-bacterial activity according to current literatures. However, hardly any research has focused on the effect and detailed mechanism of its anti-inflammatory and analgesic effects. Therefore, in the current study, we used CFA-injected rats as a model of sterile chronic-pain and detected the anti-inflammatory and especially analgesic effects of clove oil. In addition, we proved in the cellular level that eugenol, the main ingredient of clove oil, could alleviate inflammation. All together, we have proven that clove oil could reduce the paw swelling and the pain hyper-sensation of rats injected with CFA by inhibiting the up-regulation of COX|2, all of which demonstrated a potential of clove oil to be further developed into a chronic pain killer.

    Key words: clove oil; anti-inflammatory; analgesic effects; COX|2endprint

    猜你喜歡
    酸鈉抗炎丁香
    The Meaningful Flowers
    玻璃酸鈉+rhEGF治療白內障術后干眼癥
    關節(jié)注射玻璃酸鈉,好嗎?
    骨質疏松癥采用阿侖膦酸鈉聯(lián)合注射用骨肽治療的效果
    老年人能用“退熱栓”嗎
    美洲大蠊提取物CⅡ—3對家兔血常規(guī)及抗氧化活性的影響
    白藜蘆醇的抗炎、抗氧化作用與帕金森病治療的探討
    “抗炎”是防治重大疾病的關鍵
    白丁香紫丁香
    極速快遞
    一个人看的www免费观看视频| 在线免费十八禁| 日韩伦理黄色片| 九九在线视频观看精品| 欧美97在线视频| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 亚洲av免费高清在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产午夜福利久久久久久| 国产精品成人在线| 在线观看国产h片| 久久精品国产a三级三级三级| 91久久精品国产一区二区三区| 国产美女午夜福利| 国产精品爽爽va在线观看网站| 在线观看一区二区三区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 午夜视频国产福利| 国产亚洲一区二区精品| 一区二区三区四区激情视频| 高清欧美精品videossex| 欧美日韩在线观看h| 欧美xxⅹ黑人| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产精品国产三级国产专区5o| 69av精品久久久久久| 亚洲av免费在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 1000部很黄的大片| 亚洲欧美成人精品一区二区| videossex国产| 亚洲国产精品专区欧美| 亚洲精品一区蜜桃| 一级片'在线观看视频| 两个人的视频大全免费| 香蕉精品网在线| 成人国产麻豆网| 亚洲经典国产精华液单| 欧美日韩精品成人综合77777| 综合色av麻豆| 国产精品一二三区在线看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 亚洲久久久久久中文字幕| 久久亚洲国产成人精品v| 大话2 男鬼变身卡| 国产男女内射视频| 少妇 在线观看| 中文字幕久久专区| 成人毛片a级毛片在线播放| 色吧在线观看| 婷婷色综合www| 99热网站在线观看| 婷婷色av中文字幕| 欧美3d第一页| 日本欧美国产在线视频| 18禁在线播放成人免费| 黄片无遮挡物在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 日本与韩国留学比较| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 男女无遮挡免费网站观看| 久久6这里有精品| 午夜福利在线在线| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲最大成人中文| 国产精品熟女久久久久浪| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 国产成人精品久久久久久| 亚洲综合色惰| 色婷婷久久久亚洲欧美| 午夜视频国产福利| 亚洲欧美日韩无卡精品| 91久久精品国产一区二区成人| 国产精品久久久久久久久免| h日本视频在线播放| 日本午夜av视频| 视频中文字幕在线观看| 欧美成人午夜免费资源| 日本免费在线观看一区| 有码 亚洲区| 亚洲国产精品成人久久小说| 人人妻人人看人人澡| 国产色婷婷99| 少妇人妻精品综合一区二区| 精品国产乱码久久久久久小说| 永久免费av网站大全| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 777米奇影视久久| 国内精品宾馆在线| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲精品日韩av片在线观看| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 99热这里只有精品一区| 插逼视频在线观看| 有码 亚洲区| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美+日韩+精品| 精华霜和精华液先用哪个| 久久韩国三级中文字幕| 欧美97在线视频| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国国产精品蜜臀av免费| 国产乱来视频区| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲伊人久久精品综合| 丝袜脚勾引网站| 亚洲人成网站在线观看播放| 五月伊人婷婷丁香| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲精品一区蜜桃| 男女边摸边吃奶| 国产精品女同一区二区软件| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲成人av在线免费| 黑人高潮一二区| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 干丝袜人妻中文字幕| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久久久久伊人网av| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产亚洲午夜精品一区二区久久 | 国产中年淑女户外野战色| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲欧美一区二区三区国产| 日韩成人伦理影院| 深夜a级毛片| 综合色丁香网| 亚洲美女搞黄在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 在现免费观看毛片| 91精品一卡2卡3卡4卡| 欧美日韩视频精品一区| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 香蕉精品网在线| 女人久久www免费人成看片| 视频区图区小说| 国产免费一区二区三区四区乱码| 免费人成在线观看视频色| 在线观看av片永久免费下载| 中国国产av一级| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 国产精品一区二区三区四区免费观看| 成人国产av品久久久| av免费观看日本| 成人美女网站在线观看视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 在线观看一区二区三区激情| av专区在线播放| 欧美区成人在线视频| 色吧在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频 | 两个人的视频大全免费| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产成人精品一,二区| 国产永久视频网站| 日本av手机在线免费观看| 99热这里只有精品一区| av在线蜜桃| 亚洲精品国产成人久久av| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲av日韩在线播放| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 亚洲av在线观看美女高潮| 三级国产精品欧美在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 成人毛片a级毛片在线播放| 校园人妻丝袜中文字幕| 国产一区有黄有色的免费视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 能在线免费看毛片的网站| 成年女人在线观看亚洲视频 | 久久久欧美国产精品| eeuss影院久久| 男插女下体视频免费在线播放| 18+在线观看网站| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲经典国产精华液单| 18禁在线播放成人免费| 国产综合懂色| 国产精品偷伦视频观看了| 好男人视频免费观看在线| 久热这里只有精品99| 黄片wwwwww| 毛片女人毛片| 色综合色国产| 欧美国产精品一级二级三级 | 91精品国产九色| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美一区二区亚洲| 国产成人a区在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲va在线va天堂va国产| 看黄色毛片网站| 草草在线视频免费看| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲av二区三区四区| 一级a做视频免费观看| 中文字幕制服av| 两个人的视频大全免费| 精品久久久精品久久久| 国产毛片a区久久久久| 国产男人的电影天堂91| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲色图综合在线观看| 精品视频人人做人人爽| 成人国产av品久久久| 看非洲黑人一级黄片| 五月天丁香电影| 日韩,欧美,国产一区二区三区| xxx大片免费视频| 免费看日本二区| 国产精品一区二区性色av| 国产黄片视频在线免费观看| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲av免费在线观看| 亚洲成人一二三区av| 在线看a的网站| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国内精品宾馆在线| 岛国毛片在线播放| 青青草视频在线视频观看| 一级爰片在线观看| 久久国产乱子免费精品| 99热全是精品| 日本一二三区视频观看| 99久久九九国产精品国产免费| 少妇的逼好多水| 欧美成人午夜免费资源| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产高清不卡午夜福利| 国产黄片视频在线免费观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久精品国产亚洲网站| av在线蜜桃| 男男h啪啪无遮挡| 免费看不卡的av| 97超视频在线观看视频| 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲精品aⅴ在线观看| 男男h啪啪无遮挡| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产成人福利小说| 日韩欧美 国产精品| 91在线精品国自产拍蜜月| 联通29元200g的流量卡| 我的女老师完整版在线观看| 99热这里只有精品一区| 婷婷色综合大香蕉| 啦啦啦啦在线视频资源| 91久久精品电影网| 亚洲精品日本国产第一区| 女人久久www免费人成看片| 国产视频首页在线观看| 联通29元200g的流量卡| 最近最新中文字幕免费大全7| 婷婷色av中文字幕| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久国内精品自在自线图片| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 深爱激情五月婷婷| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲av免费在线观看| 久久精品久久久久久久性| 一个人看视频在线观看www免费| 久久精品国产a三级三级三级| 尾随美女入室| 中文欧美无线码| 男男h啪啪无遮挡| 性色av一级| 亚洲成色77777| 免费电影在线观看免费观看| 99久久精品国产国产毛片| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲成色77777| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 18禁在线播放成人免费| 香蕉精品网在线| 高清午夜精品一区二区三区| 色视频在线一区二区三区| 男人添女人高潮全过程视频| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲成人一二三区av| 大陆偷拍与自拍| 草草在线视频免费看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 精品久久久久久电影网| 久久精品久久久久久噜噜老黄| a级毛片免费高清观看在线播放| 韩国高清视频一区二区三区| 欧美三级亚洲精品| 视频中文字幕在线观看| 高清在线视频一区二区三区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产精品一及| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产免费又黄又爽又色| 国产乱人视频| 亚洲内射少妇av| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产成人freesex在线| 大码成人一级视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 各种免费的搞黄视频| 99热全是精品| 在线天堂最新版资源| 久久久精品94久久精品| 亚洲精品456在线播放app| 制服丝袜香蕉在线| 亚洲av一区综合| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲国产精品成人综合色| 成人综合一区亚洲| 国产真实伦视频高清在线观看| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲不卡免费看| 在线a可以看的网站| 五月玫瑰六月丁香| 欧美 日韩 精品 国产| 三级国产精品欧美在线观看| 搡老乐熟女国产| av线在线观看网站| 男的添女的下面高潮视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 成人黄色视频免费在线看| 91精品伊人久久大香线蕉| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲色图av天堂| 色哟哟·www| 国产精品蜜桃在线观看| 成年版毛片免费区| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲国产最新在线播放| 精品视频人人做人人爽| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 免费看不卡的av| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 国产片特级美女逼逼视频| 久久久久久久久久久免费av| 国产免费一区二区三区四区乱码| 九九在线视频观看精品| 禁无遮挡网站| 日本黄大片高清| 高清欧美精品videossex| 欧美最新免费一区二区三区| 能在线免费看毛片的网站| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 激情五月婷婷亚洲| 新久久久久国产一级毛片| 久久99热这里只有精品18| 国产中年淑女户外野战色| 免费av不卡在线播放| 男男h啪啪无遮挡| h日本视频在线播放| 男男h啪啪无遮挡| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲国产精品成人综合色| 国产毛片a区久久久久| 国产成人免费无遮挡视频| 伦理电影大哥的女人| 国产高清有码在线观看视频| 白带黄色成豆腐渣| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| av.在线天堂| 午夜福利视频1000在线观看| 国产高潮美女av| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲av二区三区四区| 日韩强制内射视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 欧美日韩综合久久久久久| 99九九线精品视频在线观看视频| 一个人看的www免费观看视频| a级毛片免费高清观看在线播放| av线在线观看网站| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久人人爽av亚洲精品天堂 | 亚洲精品第二区| 国产毛片a区久久久久| 精品久久久久久久久av| 日本黄色片子视频| 国产高潮美女av| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲精品亚洲一区二区| 韩国高清视频一区二区三区| 欧美日韩精品成人综合77777| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲怡红院男人天堂| 涩涩av久久男人的天堂| 国产亚洲91精品色在线| 国产精品人妻久久久久久| 深爱激情五月婷婷| 人妻一区二区av| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲在久久综合| 亚洲国产精品成人综合色| 免费av不卡在线播放| 性色avwww在线观看| 高清午夜精品一区二区三区| 精品一区二区三区视频在线| 国产精品国产三级专区第一集| 国产亚洲一区二区精品| 国内揄拍国产精品人妻在线| 97在线人人人人妻| xxx大片免费视频| 欧美潮喷喷水| 欧美性感艳星| 伦精品一区二区三区| 综合色丁香网| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 高清欧美精品videossex| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久人人爽人人片av| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲av成人精品一区久久| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 在线精品无人区一区二区三 | 九九爱精品视频在线观看| 国产精品一及| 日韩欧美一区视频在线观看 | 一边亲一边摸免费视频| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲色图综合在线观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲人与动物交配视频| 日本午夜av视频| 国产乱人偷精品视频| 国产成年人精品一区二区| 久久久精品免费免费高清| 听说在线观看完整版免费高清| 在线精品无人区一区二区三 | 国产日韩欧美亚洲二区| 国产黄a三级三级三级人| 国产伦理片在线播放av一区| 天天躁日日操中文字幕| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲成人久久爱视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 国产精品国产av在线观看| 色哟哟·www| 高清视频免费观看一区二区| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 成年女人看的毛片在线观看| 少妇 在线观看| 美女主播在线视频| 在线观看人妻少妇| 欧美少妇被猛烈插入视频| 不卡视频在线观看欧美| 亚洲国产最新在线播放| 在线观看av片永久免费下载| 国产精品蜜桃在线观看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产成人精品久久久久久| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产 一区精品| 亚洲精品一区蜜桃| 国国产精品蜜臀av免费| 九草在线视频观看| 国内精品宾馆在线| 日韩av不卡免费在线播放| 极品教师在线视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 大片免费播放器 马上看| 边亲边吃奶的免费视频| 香蕉精品网在线| 成人国产av品久久久| 日韩av免费高清视频| 亚洲无线观看免费| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 综合色av麻豆| 国产黄片美女视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久精品国产自在天天线| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲最大成人av| h日本视频在线播放| 亚洲国产精品成人久久小说| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲天堂国产精品一区在线| 久久ye,这里只有精品| 三级经典国产精品| 熟女人妻精品中文字幕| 26uuu在线亚洲综合色| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产男人的电影天堂91| 亚洲在久久综合| 美女cb高潮喷水在线观看| 2022亚洲国产成人精品| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 丰满乱子伦码专区| 欧美最新免费一区二区三区| 少妇 在线观看| 少妇人妻 视频| 青春草视频在线免费观看| 青青草视频在线视频观看| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 成年免费大片在线观看| 久久久久久久久大av| 国产又色又爽无遮挡免| 国产免费一区二区三区四区乱码| 午夜日本视频在线| 日本三级黄在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲国产日韩一区二区| 成年人午夜在线观看视频| 深夜a级毛片| 国产成人a区在线观看| 综合色丁香网| 在线看a的网站| 国产精品久久久久久久久免| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 天天一区二区日本电影三级| 国产淫片久久久久久久久| 黄片wwwwww| 日韩电影二区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产欧美亚洲国产| 青青草视频在线视频观看| 亚洲欧美清纯卡通| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 色视频在线一区二区三区| 国产大屁股一区二区在线视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产久久久一区二区三区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 午夜福利视频1000在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 国模一区二区三区四区视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲av免费高清在线观看| 天堂中文最新版在线下载 | 日本三级黄在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲自偷自拍三级| 免费大片黄手机在线观看| 丝袜脚勾引网站| 国产伦精品一区二区三区视频9| 少妇的逼水好多| 一区二区三区免费毛片| 只有这里有精品99| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 男女边摸边吃奶| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产精品女同一区二区软件| 国产免费福利视频在线观看| 特大巨黑吊av在线直播| 久久久久久国产a免费观看| 久久久久久久久久人人人人人人| 日本黄色片子视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 99久久九九国产精品国产免费| 少妇人妻精品综合一区二区| 少妇人妻久久综合中文| 色5月婷婷丁香| 99久久精品国产国产毛片| 3wmmmm亚洲av在线观看| 熟女av电影| 亚洲最大成人手机在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产又色又爽无遮挡免| 大香蕉97超碰在线| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产又色又爽无遮挡免| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日韩中字成人| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲欧美清纯卡通| eeuss影院久久| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲四区av| 看非洲黑人一级黄片| 国产又色又爽无遮挡免| 2021少妇久久久久久久久久久| 26uuu在线亚洲综合色| 日韩在线高清观看一区二区三区| 亚洲av免费高清在线观看| 成人国产麻豆网| 91狼人影院| 人妻少妇偷人精品九色| 我的女老师完整版在线观看| 黄色配什么色好看| 麻豆乱淫一区二区| 午夜激情久久久久久久| 成人亚洲欧美一区二区av| 91精品国产九色| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲第一区二区三区不卡| 高清毛片免费看| 色视频在线一区二区三区| 日韩一本色道免费dvd| 老女人水多毛片| 色播亚洲综合网|