擬南芥RING E3連接酶AtASSR1在鹽脅迫響應(yīng)中的功能初探

楊 亮，常 偉*，李 志，苗明軍，李躍建，劉志斌，李旭鋒，楊 毅

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066；2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610064）

擬南芥RING E3連接酶AtASSR1在鹽脅迫響應(yīng)中的功能初探

楊 亮1，常 偉1*，李 志1，苗明軍1，李躍建1，劉志斌2，李旭鋒2，楊 毅2

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066；2.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610064）

【目的】構(gòu)建擬南芥AtASSR1轉(zhuǎn)基因株系，研究并初步揭示RING E3連接酶AtASSR1在鹽脅迫應(yīng)答中的作用?！痉椒ā坷棉r(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法，成功獲得AtASSR1基因插入的純合轉(zhuǎn)基因株系，并通過(guò)檢測(cè)鹽脅迫處理前后，轉(zhuǎn)基因株系及野生型、atassr1突變體植株中生理生化指標(biāo)來(lái)初步揭示AtASSR1的功能?！窘Y(jié)果】通過(guò)檢測(cè)鹽脅迫處理前后，不同基因型株系的H2O2、過(guò)氧化氫酶活性、丙二醛的含量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系中的過(guò)氧化氫酶活性最低，而積累的H2O2與丙二醛含量最多；分析脯氨酸含量發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫處理后突變體株系的脯氨酸含量積累最多?！窘Y(jié)論】E3連接酶AtASSR1可能在介導(dǎo)植物響應(yīng)鹽脅迫等非生物脅迫的應(yīng)答中發(fā)揮重要生理功能。

擬南芥；AtASSR1；E3連接酶；鹽脅迫

鹽脅迫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育最重要的非生物脅迫之一，土壤鹽漬化造成可耕地面積減少及農(nóng)作物減產(chǎn)[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)土地鹽漬化面積達(dá)3.7×105km2，其中耕地面積達(dá)7×104km2[2]。不斷擴(kuò)大的鹽漬化土地面積已對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了重大損失。鹽脅迫能夠誘導(dǎo)植物體內(nèi)活性氧的積累，使植物產(chǎn)生氧化脅迫應(yīng)答。為避免過(guò)量產(chǎn)生的活性氧對(duì)自身的傷害，植物在進(jìn)化過(guò)程中形成了一套去除及中和活性氧的防御體系，包括抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)的抗氧化劑類[3]。

泛素化作用是一種蛋白質(zhì)的翻譯后修飾過(guò)程，幾乎存在于所有的真核生物當(dāng)中[4]。泛素分子能通過(guò)底物蛋白的賴氨酸殘基與其形成共價(jià)鍵而結(jié)合。通過(guò)泛素化作用，不僅能使底物蛋白發(fā)生穩(wěn)定性及活性上的改變，而且其亞細(xì)胞定位也會(huì)相應(yīng)得到調(diào)整[5]。對(duì)擬南芥基因組序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，超過(guò)6%的編碼蛋白基因都直接或間接地參與到泛素介導(dǎo)的26S蛋白酶體降解途徑（ubiquitin-mediaed 26S proteasome system，UPS）中[6]。UPS 主要由泛素、泛素激活酶 E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3，以及26S蛋白酶體組成，不同組分之間通過(guò)連續(xù)的酶促反應(yīng)，可將泛素分子連接至底物蛋白[7]。其中，泛素連接酶E3在此途徑中起到識(shí)別底物與呈遞泛素分子的作用，是泛素化過(guò)程最為關(guān)鍵的成員[8]。

根據(jù)結(jié)構(gòu)域的差異，E3泛素連接酶可分為兩大類：含有 HETC（homology to E6-AP C-terminus）結(jié)構(gòu)域的E3連接酶和含有RING（really interesting new gene）finger結(jié)構(gòu)域的E3連接酶。RING finger型E3連接酶包含一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域（zinc finger motif），由半胱氨酸和組氨酸組成的8個(gè)氨基酸殘基，與兩個(gè)鋅離子發(fā)生螯合作用，形成該類蛋白的催化活性中心。其中，以C3H2C3（RING-H2）構(gòu)型和C3HC4（RINGHC）構(gòu)型最為常見(jiàn)，約占RING finger E3總數(shù)的90%。在模式植物擬南芥中，分別包含241個(gè)C3H2C3型E3連接酶和186個(gè)C3HC4型E3連接酶，它們的主要差異是第5配基是否為組氨酸[9]。

單亞基RING E3連接酶在植物中呈現(xiàn)高度的多樣化，僅在擬南芥中，包含的單亞基RING E3連接酶就多達(dá)469種[10]。最近幾年的研究揭示出這一類E3連接酶在植物生長(zhǎng)發(fā)育中具有相當(dāng)重要的作用，直接或間接參與多種非生物脅迫響應(yīng)。例如，RING E3連接酶CHYR1能夠被SnRK2.6蛋白激酶磷酸化，從而作為正調(diào)控因子參與到脫落酸（abscisic acid，ABA）與干旱脅迫的響應(yīng)中[11]；KEG通過(guò)降解ABI5而對(duì)ABA信號(hào)通路起負(fù)調(diào)控的作用[12-13]；SDIR1能夠與SDIRIP1相互作用發(fā)生降解，后者能夠調(diào)節(jié)ABA信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因ABI5的表達(dá)，從而對(duì)ABA信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控[14]；AtAIRP1/2/3/4，及 RHA2a/2b都是ABA信號(hào)通路的正調(diào)控因子，同時(shí)，在植物中過(guò)表達(dá)上述蛋白的基因，都能夠通過(guò)減少ABA介導(dǎo)的氣孔開(kāi)度，達(dá)到增強(qiáng)植物抗旱的表型[15-21]。

AtASSR1是本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過(guò)對(duì)擬南芥基因組的生物信息學(xué)分析獲得的一個(gè)具有體外活性的E3連接酶，運(yùn)用RT-PCR的方法克隆出AtASSR1的編碼區(qū)序列，并將其構(gòu)建到植物表達(dá)載體pZh01中，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法對(duì)該基因的擬南芥TDNA插入突變體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，篩選后，成功得到純合的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系，并對(duì)得到的轉(zhuǎn)基因株系連同野生型與突變體一起，進(jìn)行了鹽脅迫處理前及處理后的生理生化指標(biāo)檢測(cè)，為進(jìn)一步研究AtASSR1在植物鹽脅迫應(yīng)答中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究所用擬南芥（Arabidopsis thaliana）的生態(tài)型背景均為哥倫比亞型（Columbia）擬南芥；野生型擬南芥（Col-0）為本實(shí)驗(yàn)室保存；突變體atassr1（Salk_115341）購(gòu)于擬南芥生物資源中心（Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC）。

植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司；MDA、CAT試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；DAB購(gòu)自AMRSCO公司；潮霉素（hygromycin）購(gòu)自Roche公司；SYBGreen購(gòu)自Bio-Rad公司；引物合成與測(cè)序均交由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司；植物表達(dá)載體pZh01由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物培養(yǎng)

將擬南芥種子浸泡于30%的漂白溶劑（包含1.5%V/V的次氯酸鈉與0.1%V/V的Triton X-100）中滅菌15min，隨后用無(wú)菌的ddH2O清洗4次，均勻平鋪在1/2 MS固體培養(yǎng)基（0.8%W/V瓊脂，1%W/V蔗糖）中，4℃避光春化2 d，轉(zhuǎn)移到22℃溫室培養(yǎng)5～7 d后移植至培養(yǎng)土中，光周期為16 h光照/8 h黑暗，溫度22℃，濕度70%，光照強(qiáng)度120 mol/m2·s。

1.2.2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

利用 TAIR（http://www.arabidopsis.org/）上已公布的AtASSR1的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，序列為AtASSR1-CDS-F：5’-CGC GGA TCCATG GCT AAA TTA TCT TTC AAG G-3’和AtASSR1-CDS-R：5’-CGA GCT CTC TCA CAT GGA AAT CGT AAG GAG-3’，分別包含BamHI與Ecl136II酶切位點(diǎn)。提取生長(zhǎng)10d后的野生型擬南芥幼苗總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，以此為模板，利用上述全長(zhǎng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收后，利用BamHI與Ecl136II內(nèi)切酶將片段連入植物表達(dá)載體pZh01中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞JM109，選取部分單克隆進(jìn)行PCR及酶切驗(yàn)證后，進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)驗(yàn)證正確后即構(gòu)建成植物表達(dá)載體pZh01-AtASSR1。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因株系的獲得及鑒定

將pZh01-AtASSR1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞，驗(yàn)證篩選出正確克隆后，挑取單菌落，轉(zhuǎn)接入LB液體培養(yǎng)基（利福平：75 mg/L；卡那霉素：50 mg/L）中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，28℃振蕩培養(yǎng)至OD值在0.8～1.2之間，離心收集菌體后，用浸染液（1/2 MS液體培養(yǎng)液；5%蔗糖）重懸，調(diào)OD值至0.6～0.8，加入 silwet L-77（0.02%V/V），靜置 1 h；將 4 周大已去除莢果的擬南芥atassr1突變體花序浸入浸染液中約30 s；浸染完成的擬南芥花序用保鮮膜包裹，置于溫室中避光培養(yǎng)16 h以上，隨后恢復(fù)正常培養(yǎng)條件生長(zhǎng)。

將收獲的T0代種子經(jīng)表面滅菌后，平鋪于含有25 mg/L潮霉素（hygromycin，Hyg）的 1/2 MS固體培養(yǎng)基上，4℃春化2 d后，于正常生長(zhǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)篩選，7 d后，將陽(yáng)性幼苗小心轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)土中繼續(xù)生長(zhǎng)，2周后，提取轉(zhuǎn)基因幼苗的DNA，PCR檢測(cè)潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因Hpt的插入情況，引物為HygII-F：5’-CTA TTT CTT TGC CCT CGG ACG AG-3’和 HygII-R：5’-G ATT CCG GAA GTG CTT GAC AT-3’。

單株收集T1代轉(zhuǎn)基因株系的種子，繼續(xù)進(jìn)行潮霉素篩選，繼代培養(yǎng)4周后，提取葉片RNA，通過(guò)定量RT-PCR的方法檢測(cè)目的基因AtASSR1的表達(dá)情況，所用定量引物為AtASSR1-F：5’-ATTG GCG AGG GAG ATC ACA GTCA-3’和 AtASSR1-R：5’-ACG CAT ACA CTT GAT CTG GAA CCA-3’，內(nèi)參選擇擬南芥肌動(dòng)蛋白基因2[22]（AtActin 2），引物序列為 Actin2-RT-F：5’-GCA CCA CCT GAA AGG AAG TAC A-3’和 Actin2-RT-R：5’-CGA TTC CTG GAC CTG CCT CAT C-3’。對(duì)T2代株系進(jìn)行單株收種后，若在潮霉素篩選培養(yǎng)基中不再出現(xiàn)分離比，即可認(rèn)為該株系為純合的單位點(diǎn)插入轉(zhuǎn)基因株系，可用于后續(xù)的表型分析實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 DAB染色

剪取3周大的幼苗葉片，經(jīng)150 mM NaCl脅迫處理6 h后，進(jìn)行DAB染色[23]。

1.2.5 不同抗氧化酶的提取與分析

150 mM NaCl處理3周大的幼苗4 d后，分別剪取野生型、突變體及轉(zhuǎn)基因株系的葉片0.1 g，置于液氮中充分研磨，按照南京建成生物工程研究所的丙二醛提取試劑盒及過(guò)氧化氫酶提取試劑盒的操作步驟完成提取與檢測(cè)。在進(jìn)行過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定前，利用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)不同樣本中總蛋白濃度。

1.2.6 脯氨酸含量測(cè)定

150 mM NaCl處理3周大的幼苗4 d后，分別剪取野生型、突變體及轉(zhuǎn)基因株系的葉片0.2 g，置于液氮中充分研磨，測(cè)定各自葉片中脯氨酸的含量[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtASSR1的克隆及植物表達(dá)載體的構(gòu)建

AtASSR1基因位于擬南芥第5對(duì)染色體上，全長(zhǎng)2155 bp，包含 5個(gè)外顯子與 4個(gè)內(nèi)含子，除去內(nèi)含子的基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為729 bp。分析該基因編碼的氨基酸序列，全長(zhǎng)為242個(gè)氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)分子量為28.1 kDa，等電點(diǎn)pI=7.49。對(duì)該蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析（http://smart.embl-heidelberg.de/）發(fā)現(xiàn)，在其第144位至181位氨基酸殘基之間包含一個(gè)RING結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)儆诘湫偷腃3HC4型RING結(jié)構(gòu)域，是E3連接酶的催化活性中心（圖1a）。采用http://www.expasy.org/網(wǎng)站上的SWISS-MODEL程序，預(yù)測(cè)了該蛋白的三維結(jié)構(gòu)（圖1b），可以看到，在蛋白的RING結(jié)構(gòu)域中，包含2個(gè)鋅離子及α-螺旋及β旋片狀折疊。以擬南芥cDNA為模板，通過(guò)引物對(duì)AtASSR1-CDS-F與AtASSR1-CDS-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得大小約為750 bp的電泳條帶（圖1c）。

將擴(kuò)增得到的AtASSR1全長(zhǎng)片段經(jīng)過(guò)BamHI與Ecl136II內(nèi)切酶酶切后，連入經(jīng)相同內(nèi)切酶處理的植物表達(dá)載體pZh01中，經(jīng)過(guò)酶切驗(yàn)證及測(cè)序后，將序列正確的載體保留備用，至此構(gòu)建成pZh01-AtASSR1，具體構(gòu)建過(guò)程如圖2所示。

圖1 AtASSR1結(jié)構(gòu)域分析及其基因的克隆Figure 1 Analysis and identification of AtASSR1 domain and full-length cDNA sequences

圖2 植物表達(dá)載體pZh01-AtASSR1構(gòu)建過(guò)程Figure 2 Schematic diagram of the construction of plant expression vector pZh01-AtASSR1

2.2 轉(zhuǎn)基因株系的獲得及鑒定

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法轉(zhuǎn)化純合的atassr1突變體，將獲得的T0代轉(zhuǎn)基因種子在含有潮霉素的MS篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，對(duì)潮霉素表現(xiàn)抗性的T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株（圖3a），提取其葉片基因組DNA，利用特異引物檢測(cè)pZh01載體中潮霉素抗性基因Hpt的插入情況，并以pZh01-AtASSR1質(zhì)粒與野生型擬南芥植株（wild type，WT）DNA分別作為正負(fù)對(duì)照。如圖3b所示，1～4泳道檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因株系 C-2、C-6、C-8、C-12以及質(zhì)粒正對(duì)照均能擴(kuò)增出預(yù)期大小的片段，而在野生型擬南芥WT中不能擴(kuò)增出目的片段，說(shuō)明pZh01-AtASSR1質(zhì)粒片段成功插入atassr1突變體基因組中。

圖3 陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系的篩選及鑒定Figure 3 Selection and identification of positive transgenic plants

在Hpt檢測(cè)呈陽(yáng)性的株系中，單株收取T1代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系的種子，將其鋪于含有潮霉素的MS篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行分離比的統(tǒng)計(jì)，并觀測(cè)分離得到純合轉(zhuǎn)基因株系。將純合株系幼苗移栽生長(zhǎng)3周后，提取葉片RNA，通過(guò)定量RT-PCR檢測(cè)目的基因AtASSR1的mRNA水平。如圖3c所示，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系C-2、C-6、C-12中AtASSR1的表達(dá)水平較野生型擬南芥有明顯升高，升高倍數(shù)均在200倍以上，其中，C-12株系中的AtASSR1的表達(dá)水平最高，是野生型株系的318倍。以上結(jié)果說(shuō)明，AtASSR1基因成功轉(zhuǎn)入突變體植株中，表達(dá)量符合預(yù)期，可用于后續(xù)表型分析。

2.3 鹽脅迫處理對(duì)不同基因型株系幼苗根長(zhǎng)的影響

為了探究AtASSR1對(duì)植物鹽脅迫下的響應(yīng)，將經(jīng)過(guò)春化的野生型、突變體及轉(zhuǎn)基因株系的種子播種于1/2 MS固體平板上，萌發(fā)3 d后，分別移至正常和含有150 mM NaCl的1/2 MS平板上繼續(xù)進(jìn)行垂直培養(yǎng)，5 d后觀察并測(cè)量不同株系間根長(zhǎng)的差異。如圖4所示，在正常1/2 MS平板生長(zhǎng)的植株，各株系均生長(zhǎng)良好，并無(wú)明顯差異；當(dāng)鹽濃度升高至150 mM時(shí)，突變體的生長(zhǎng)狀況明顯要好于野生型與轉(zhuǎn)基因株系。對(duì)根長(zhǎng)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在鹽濃度為150 mM時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系與野生型及突變體根長(zhǎng)出現(xiàn)顯著性差異，說(shuō)明由于AtASSR1基因在轉(zhuǎn)基因株系中的超量表達(dá)導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因株系對(duì)Na+的敏感性增強(qiáng)，從而抑制了植物的生長(zhǎng)。

圖4 鹽脅迫對(duì)不同株系幼苗根長(zhǎng)的影響Figure 4 Effect of salt press on seedlings of different transgenic lines

2.4 過(guò)量表達(dá)AtASSR1基因?qū)е轮参矬w內(nèi)過(guò)氧化物的含量增加

先前的研究表明，AtASSR1基因在成熟衰老的組織中積累量多，并且受氧化脅迫誘導(dǎo)明顯，表明AtASSR1可能直接或間接參與擬南芥體內(nèi)的氧化代謝反應(yīng)[25]。為進(jìn)一步研究AtASSR1在氧化代謝反應(yīng)中的作用，首先通過(guò)二氨基聯(lián)苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）對(duì)鹽脅迫處理后的野生型、atassr1突變體及轉(zhuǎn)基因株系C-2、C-6、C-12的葉片進(jìn)行染色，以檢測(cè)處理前后葉片中H2O2的含量。DAB染色后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因株系C-2、C-6、C-12在鹽脅迫處理前，其褐色面積及深度就大于野生型及突變體株系（圖5a），表明轉(zhuǎn)基因株系較野生型和突變體在體內(nèi)積累了更多的H2O2；相反，突變體株系中的H2O2的積累量最低。而鹽脅迫處理之后，轉(zhuǎn)基因株系中的H2O2積累的更多，導(dǎo)致褐色現(xiàn)象更加明顯。

為進(jìn)一步確認(rèn)轉(zhuǎn)基因株系中H2O2的過(guò)量積累是否是由其體內(nèi)抗氧化酶活性變化引起的，對(duì)關(guān)鍵的抗氧化酶過(guò)氧化氫酶（CAT）以及反映植物膜脂過(guò)氧化指標(biāo)的丙二醛（MDA）進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，在NaCl處理前，轉(zhuǎn)基因株系中的CAT含量低于野生型及突變體，150 mM NaCl處理后，盡管CAT在不同株系中的含量都有所提高，但仍表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因株系中最低，而突變體中最高（圖5b）。同時(shí)，MDA的含量在NaCl處理前后均表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因株系中最高，突變體中最低。以上結(jié)果說(shuō)明，植株中過(guò)量表達(dá)AtASSR1基因能夠減少或抑制植物體內(nèi)過(guò)氧化氫酶的活性，破壞了機(jī)體清除ROS的機(jī)制，導(dǎo)致體內(nèi)ROS的積累量增加。

2.5 鹽脅迫下不同基因型株系中脯氨酸含量的差異

脯氨酸不僅是植物蛋白質(zhì)的組成部分，而且可以游離狀態(tài)存在于植物體中，當(dāng)植物遭受逆境脅迫時(shí)，其體內(nèi)脯氨酸大量積累，并作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，減輕植物細(xì)胞在逆境下的損害。因此，植物體內(nèi)的脯氨酸含量在一定程度上可作為其抗逆性的指標(biāo)。為研究AtASSR1是否會(huì)對(duì)植物的抗逆性產(chǎn)生影響，檢測(cè)了野生型、atassr1突變體及轉(zhuǎn)基因株系C-2、C-12在150 mM NaCl處理前后，各自體內(nèi)脯氨酸含量的變化情況。如圖6所示，未經(jīng)鹽脅迫處理之前，不同基因型株系中的脯氨酸含量基本一致；但是在150 mM NaCl脅迫條件下，atassr1突變體中的脯氨酸含量明顯高于野生型與兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中的脯氨酸含量，并且，兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系C-2與C-12中的脯氨酸含量是最低的。這表明，AtASSR1在突變體中的過(guò)量表達(dá)很可能降低了植株對(duì)鹽脅迫或滲透脅迫的耐受性。

圖5 轉(zhuǎn)AtASSR1基因后植株對(duì)鹽脅迫應(yīng)答表型分析Figure 5 Phenotypes of transgenic plants AtASSR1 under abiotic stress

圖6 鹽脅迫處理前后不同基因型株系中脯氨酸含量的檢測(cè)Figure 6 Effects of salt stress on activities of proline content in different genotype lines

3 討論與結(jié)論

活性氧（ROS）作為一種信號(hào)分子在介導(dǎo)植物應(yīng)對(duì)生物與非生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程中具有重要的功能[26]。當(dāng)植物遭受非生物脅迫，如高鹽、干旱、滲透時(shí)，會(huì)造成體內(nèi)ROS的過(guò)量積累，打破了植物對(duì)活性氧清除的動(dòng)態(tài)平衡。積累過(guò)多的ROS能夠與植物體內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，從而造成對(duì)植物體的傷害。由E3連接酶介導(dǎo)的蛋白泛素化在植物抵御非生物脅迫中起到關(guān)鍵的作用[27-29]。但是，目前在植物中發(fā)現(xiàn)的包含RING結(jié)構(gòu)域的E3連接酶，如 KEG、SDIR1、OsHTAS、AtAIRP1/2/3/4 等[12，15-18，21，30]，大都與ABA介導(dǎo)的干旱耐受相關(guān)，而參與植物氧化脅迫調(diào)控的RING E3連接酶鮮有報(bào)道。

本研究首先以一個(gè)能夠受H2O2誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的E3連接酶基因擬南芥突變體為母本，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法篩選出純合的轉(zhuǎn)基因株系，并在DNA水平與RNA水平分別驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因株系構(gòu)建成功（圖3）。鹽脅迫處理不同株系幼苗結(jié)果顯示，AtASSR1基因的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因株系對(duì)Na+的敏感性增強(qiáng)（圖4）。對(duì)NaCl處理前后的離體葉片進(jìn)行DAB染色結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系能夠在體內(nèi)積累更多的H2O2（圖5a）。并且進(jìn)一步分析不同株系中過(guò)氧化氫酶CAT與丙二醛MDA的含量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系中的CAT含量最低，而MDA含量最高（圖5b）。由于過(guò)氧化氫酶是廣泛存在于動(dòng)植物中的一種催化過(guò)氧化氫分解成氧和水的酶類，主要定位于過(guò)氧化物酶體中，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。植物體內(nèi)的CAT與其調(diào)節(jié)非生物脅迫反應(yīng)之間的關(guān)系相當(dāng)密切，如在農(nóng)作物中過(guò)量表達(dá)CAT基因，或者提高CAT的活性，均能夠使植物對(duì)非生物脅迫的耐受性增加[31]。與此同時(shí)，當(dāng)植物體內(nèi)的ROS無(wú)法及時(shí)分解時(shí)，會(huì)使細(xì)胞的膜脂發(fā)生過(guò)氧化作用，丙二醛MDA既是該作用的最終分解產(chǎn)物，對(duì)其含量的測(cè)定可以反映植物所遭受的氧化脅迫損害的程度[32]。對(duì)不同株系進(jìn)行NaCl處理后，轉(zhuǎn)基因株系中的CAT與MDA的變化趨勢(shì)并沒(méi)有發(fā)生明顯變化，仍然表現(xiàn)為CAT活性最高而MDA含量最低（圖5b）。這一結(jié)果表明，AtASSR1的過(guò)量表達(dá)在植物正常生長(zhǎng)條件下就打破了其體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與分解的平衡，考慮到AtASSR1是一個(gè)具有RING結(jié)構(gòu)域的E3連接酶，推測(cè)其可能是參與泛素化降解活性氧分解代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶類。通過(guò)檢測(cè)NaCl處理前后不同株系中脯氨酸含量分析結(jié)果顯示，鹽脅迫處理后突變體內(nèi)的脯氨酸含量明顯高于野生型與轉(zhuǎn)基因株系，而植物體內(nèi)的脯氨酸水平與其抗逆性成正相關(guān)，這表明，AtASSR1的過(guò)量表達(dá)很可能降低了植株對(duì)非生物脅迫的抗性。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)，盡管C-12轉(zhuǎn)基因株系的AtASSR1表達(dá)量要高于C-2株系，但并未發(fā)現(xiàn)它們的CAT活性、MDA含量及脯氨酸含量存在顯著性差異，推測(cè)可能是由于植物體內(nèi)存在對(duì)該基因超量表達(dá)的反饋抑制效應(yīng)。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了AtASSR1單拷貝插入的純合轉(zhuǎn)基因株系，通過(guò)分析野生型、突變體、轉(zhuǎn)基因株系中過(guò)氧化物酶的活性、丙二醛與脯氨酸的含量，證實(shí)了AtASSR1能夠參與植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)，這項(xiàng)研究結(jié)果為進(jìn)一步研究包含RING結(jié)構(gòu)域的E3連接酶同植物脅迫應(yīng)答之間的互作關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

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Preliminary Study on Function of Arabidopsis RING E3 Ligase AtASSR1 in Salt Stress Response

YANG Liang1，CHANG Wei1*，LI Zhi1，MIAO Ming-jun1，LI Yue-jian1，LIU Zhi-bin2，LI Xu-feng2，YANG Yi2
（1.Horticulture Research Institute，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Vegetable Germplasm Innovation and Variety Improvement Key Laboratory of Sichuan Province，Chengdu 610066，China；2.Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment，Ministry of Education，College of Life Science，Sichuan University，Chengdu 610064，China）

【Objective】The AtASSR1 transgenic plants were constructed and studied to investigate the function of RING E3 ligase AtASSR1 plays an important effect on the responses of Arabidopsis to salt stress.【Method】AtASSR1 homozygous transgenic lines were successfully constructed through the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation.This studies was performed to preliminarily reveal the function of AtASSR1 by analyzing the physiological and biochemical indexes in wild-type，atassr1 mutant，and transgenic lines treated with or without NaCl.【Results】The results show that the transgenic lines have the lowest activity of CAT and the highest content of H2O2and MDA by analyzing the content of H2O2，catalase（CAT），and Malondialdehyde（MDA）in different genotypes of lines treated with or without NaCl.The atassr1 mutant accumulates the highest content of proline after salt stress by analyzing the content of proline in different genotype lines.【Conclusion】Alloftheseresultssuggestedthat AtASSR1 may play an important physiological function in plant abiotic stress responses.

Arabidopsis thaliana；AtASSR1；E3 ligase；salt stress

Q943.2；Q945.78

A

1000-2650（2017）03-0381-08

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.03.015

2017-05-05

四川省科技計(jì)劃應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目（2016JY0164）；四川蔬菜（花卉）種質(zhì)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)提升關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)項(xiàng)目（2017CYTS-001）。

楊亮，博士，助理研究員，主要研究方向?yàn)槭卟朔肿佑N，E-mail：yangshaoliang@163.com。*責(zé)任作者：常偉，碩士，副研究員，主要研究方向?yàn)槭卟擞N與栽培，E-mail：mchangwei@sohu.com。

（本文審稿：武 晶；責(zé)任編輯：劉詩(shī)航；英文編輯：劉詩(shī)航）