利用pmi標記基因篩選培育轉EaDREB2B基因甘蔗

吳 楊 賀 俐 黃 勇 張木清

(1.井岡山大學生命科學院，吉安 343009； 2.福建農林大學農業(yè)部甘蔗生理生態(tài)與遺傳改良重點實驗室，福州 350002)

利用pmi標記基因篩選培育轉EaDREB2B基因甘蔗

吳 楊1,2賀 俐1黃 勇1張木清2

(1.井岡山大學生命科學院，吉安 343009；2.福建農林大學農業(yè)部甘蔗生理生態(tài)與遺傳改良重點實驗室，福州 350002)

利用已構建的植物表達載體prd29a-dreb-hyg，通過酶切連接到含有磷酸甘露糖異構酶基因(pmi)的表達質粒pZMLR14上，構建植物表達載體pDREB-PMI。利用基因槍轟擊轉化甘蔗愈傷，經過甘露糖篩選，共獲51株抗性苗，轉化再生頻率為4.25%。對轉基因植株進行分子檢測，結果表明有8株為陽性轉基因無性系。氯酚紅試驗表明標記磷酸甘露糖異構酶基因在轉基因株系中均有表達。對轉基因T1代甘蔗植株進行分子檢測，結果表明EaDREB2B基因在轉基因甘蔗無性系T1代中穩(wěn)定遺傳。該結果為進一步研究EaDREB2B基因在甘蔗抗旱方面的作用奠定了基礎。

甘蔗；pmi基因；甘露糖

甘蔗是世界上最重要的糖料作物，但干旱是造成我國甘蔗單產低、品質差的主要原因之一。根據(jù)發(fā)達國家的生產實踐證明，選育抗旱性強、水分利用率高的作物或品種是提高農業(yè)水分效率的最有效措施之一[1]。甘蔗無性繁殖，高度多倍性，遺傳背景復雜的特點使其利用常規(guī)雜交育種方法實現(xiàn)遺傳改良十分困難。植物基因工程技術的發(fā)展為解決這一困難提供了新途徑，使在優(yōu)良品種中導入目的基因進行品種遺傳改良成為可能[2～3]。同時，甘蔗在世界上大部分地區(qū)不開花，轉基因植株所帶來的抗性基因不會隨花粉發(fā)生“基因漂流”而對環(huán)境造成危害，而且作為生產蔗糖和乙醇的工業(yè)原料，經高溫煉煮，用外源轉基因技術培育的甘蔗新品種對環(huán)境和食品基本沒有潛在威脅，因此也是理想的開展轉基因育種的作物。

轉錄因子DREB是AP2/EREBP(APETALA2/ethylene responsive element binding protein)基因家族的一個亞家族，在脅迫應答基因表達中起著重要作用。自Stockinger等[4]從擬南芥中分離出編碼DRE結合蛋白的cDNA以來，已經從多種植物中分離出許多基因。研究表明，利用轉錄因子提高植物抗逆性，能獲得較為理想的效果，一個DREB轉錄因子可以調控多個與植物干旱、高鹽及低溫耐性有關的功能基因的表達[5]。逆境條件下，過表達轉DREB基因植株，脯氨酸含量、可溶性糖明顯高于對照，說明過表達的DREB類轉錄因子能夠調控下游基因，并且與游離脯氨酸、可溶性糖等功能蛋白基因的合成有關，進而提高轉基因株系的抗逆能力[6]。李墨野等[7]通過對轉LbDREB基因大青楊的研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下轉基因各株系在生長和生理指標上較對照具有明顯優(yōu)勢，且LbDREB基因瞬時表達顯著升高，轉基因植株的抗旱性顯著增強。Chen[8]等在綠豆中克隆得到一個DREB2A基因(VrDREB2A)，過表達該基因可以增強玉米的抗熱性。Mizoi等[9]從大豆中分離得到一個新的DREB2基因(GmDREB2A;2)，該基因在干旱脅迫下具有較高的轉錄活性，在轉基因擬南芥中能調控大量脅迫基因的表達，從而顯著增強植物的抗旱性。

目前在甘蔗遺傳轉化中廣泛應用的標記基因有抗除草劑和抗生素基因，但是這兩類基因對生態(tài)環(huán)境和人類健康潛在的安全性問題越來越引起全世界的關注，制約著轉基因甘蔗的商業(yè)化生產。因此，開發(fā)利用安全的篩選體系對甘蔗遺傳轉化具有非常重要的現(xiàn)實意義。以糖代謝酶基因磷酸甘露糖異構酶(phosphomannose isomerase，PMI)基因為篩選標記的方法，對人體健康和環(huán)境安全無危害[10]。磷酸甘露糖異構酶基因來自大腸桿菌，自然界中除肉桂和大多數(shù)豆類含有磷酸甘露糖異構酶基因外大多數(shù)植物都不含有該基因[11]，但在細菌、酵母、動物及人體中磷酸甘露糖異構酶基因廣泛存在，目前已經從這些生物中克隆到Pmi基因。將6-磷酸甘露糖轉變?yōu)榱姿峁荹12]，在以甘露糖為單一碳源的培養(yǎng)基上，轉化子可以正常生長，非轉化子因為無法利用甘露糖不能正常生長[13]。自從1998年Joersbo等將PMI/甘露糖陽性篩選系統(tǒng)用于篩選甜菜轉基因植物以來，現(xiàn)已用于不同植物遺傳轉化篩選中[14～15]。

為了獲得抗旱且對環(huán)境安全的轉基因甘蔗，本研究以福建農林大學甘蔗研究所選育的早熟高糖高產品種福農95-1702為材料，利用從甘蔗近緣屬斑茅中克隆得到的EaDREB2B基因構建以pmi基因(manA)為選擇標記基因的植物表達載體，遺傳轉化甘蔗愈傷組織，以期培育出抗旱行強且對環(huán)境具有安全性的轉基因甘蔗無性系。

1 材料和方法

1.1 材料

甘蔗品種福農95-1702(SaccharumofficinarumL.)由福建農林大學甘蔗研究所提供。大腸桿菌(E.coli)DH5α由農業(yè)部甘蔗生理生態(tài)與遺傳改良重點實驗室提供。真核表達載體pZMLR14由福建農林大學農業(yè)部甘蔗遺傳改良與生理生態(tài)重點開放實驗室提供；pRd29a-dreb-hyg植物表達載體為本實驗室構建保存；用于本研究的其他工具酶和生化試劑等購自上海生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 植物表達載體pDREB-PMI的構建

將構建好的pRd29a-dreb-hyg表達載體用HindⅢ進行酶切，回收純化含EaDREB2B基因的表達框，連接到用同樣內切酶切開的載體pZMLR14中。轉化感受態(tài)大腸桿菌DH5α后，利用氨芐青霉素篩選陽性克隆，隨機挑取單菌落接種于300 μL含80 mg·L-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 150 r·min-1過夜培養(yǎng)。以10 μL菌液為模板，在EaDREB2B基因上設計引物DP1:5′-CCAAGGAGATGGAGTTAGAG-3′，DP2：5′-GAATCATTACCACCAGGCT-3′，兩引物之間片段大小約為650 bp，檢測EaDREB2B基因是否插入到表達載體中，在此基礎上提取質粒并用HindⅢ進行酶切以驗證表達載體構建的正確性。

1.2.2 甘露糖對甘蔗愈傷組織分化的影響

選取生長旺盛、直徑約2 mm的愈傷組織塊為試驗材料，接種到不同質量濃度甘露糖和蔗糖配比的分化培養(yǎng)基中，每個試驗濃度接種3瓶，每瓶15塊材料。設置6種甘露糖和蔗糖的質量配比，記錄分析甘蔗愈傷分化對甘露糖的敏感性。設定甘露糖和蔗糖的總含量為30 g·L-1，甘露糖的質量濃度分別為0、1、2、3、4和5 g·L-1。35天后觀察統(tǒng)計愈傷的分化情況，選擇最佳的甘露糖篩選濃度。

1.2.3 甘露糖對甘蔗無菌苗生根的影響

選取生長旺盛長勢一致，株高4～5 cm的分化苗為試驗材料，接種到含有不同質量濃度(同1.2.2)甘露糖的生根培養(yǎng)基中，每個試驗濃度接種3瓶，每瓶15棵苗。35天后觀察統(tǒng)計無菌苗生根情況，確定甘蔗無菌苗生根培養(yǎng)基中的甘露糖最佳篩選濃度。

1.2.4 甘蔗的遺傳轉化

本試驗采用基因槍轉化法，轟擊前挑選生長旺盛的甘蔗胚性愈傷組織接種于高滲培養(yǎng)基(MS+2 mg·L-12,4-D+0.2 mol·L-1山梨醇+0.2 mol·L-1甘露醇+30 g·L-1蔗糖+6 g·L-1瓊脂粉，pH5.8)中進行預處理。基因槍為Bio-Rad公司PDS-1000/He型，轟擊前將預處理的愈傷組織集中在培養(yǎng)皿的中心位置，每皿轟擊1次。本研究選擇28英寸汞柱真空度，1 100 psi的轟擊壓力和6 cm的轟擊距離作為轟擊參數(shù)。具體步驟參照儀器操作說明書進行。轟擊后將愈傷組織繼續(xù)滲透處理18h，然后轉接至不含甘露糖的繼代培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng)1周，最后接種到誘導不定芽的甘露糖篩選培養(yǎng)基上進行篩選，待不定芽長至2 cm時接到添加最適濃度甘露糖的生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。

1.2.5 轉化植株的分子檢測

PCR檢測：采用CTAB法提取甘蔗基因組DNA，在rd29A啟動子區(qū)域設計上游引物S1:5′-CGTGTCCCTTTATCTCTCTCAGTC-3′和目的基因處設計下游引物S2:5′-CCTTTACCTTTCATACAGCCTTTC-3′，兩引物之間片段大小為364 bp，反應條件為：94℃預變性3 min；94℃變性40 s，59℃退火40 s，72℃延伸50 s，循環(huán)40次；72℃延伸反應7 min。擴增產物用1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳，在成像系統(tǒng)下拍照分析。

點雜交檢測：提取PCR擴增呈陽性的甘蔗植物總DNA作模板，采用地高辛標法對探針進行標記，具體操作方法參照Roche DNA Labeling and Detection Kit雜交試劑盒說明書進行。

RT-PCR檢測：參照Invitrogen Trizol Reagent RNA提取試劑盒方法提取葉片總RNA，采用TakaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0試劑盒進行RNA反轉錄，得到cDNA，使用引物DP1、DP2進行擴增檢測。

1.2.6 轉基因甘蔗的氯酚紅檢測

配制1/2MS+3 g·L-1甘露糖+50 g·L-1氯酚紅溶液，過濾滅菌后滴至無菌的2 mL離心管中，并分別放入面積、鮮質量相當，苗齡相同的轉基因葉片和非轉基因對照葉片，密封后置于27℃培養(yǎng)箱，暗培養(yǎng)4 d后觀察氯酚紅溶液顏色的變化，具體操作方法參照文獻進行[16]。

2 結果與分析

2.1植物表達載體pDREB-PMI的構建及重組鑒定

將prd29a-dreb-hyg質粒用HindⅢ酶切，通過瓊脂糖電泳回收DREB基因整個表達框；同時利用HindⅢ酶切pZMLR14表達載體把環(huán)狀表達載體打開，電泳回收載體片段。將線性DREB表達框和切開后pZMLR14表達載體相連接，產物轉化大腸桿菌DH5α，利用基因特異性引物進行菌液PCR鑒定，結果如圖1所示，重組表達載體擴增條帶大小約為650 bp，與預期結果一致；將得到的陽性重組菌提取質粒后，經HindⅢ酶切電泳后，得到大小約為1 920 bp的片段，與預期一致(圖2)。由此可以證明pDREB-PMI植物表達載體構建成功。

圖1 重組菌pDREB-PMI的PCR鑒定 M. DL2000(TakaRa)；1.陽性對照(質粒DNA)；2.空白對照；3～16.重組菌Fig.1 PCR Identification of Recombinant bacteria pDREB-PMI M. DL2000(TakaRa); 1.Plasmid DNA(Postive control); 2.Blank control; 3-17.Recombinant bacteria

圖2 植物表達載體pDREB-PMI酶切鑒定M.TaKaRa Wide Range DNA Marker (500～12 000)；1,3.重組質粒pDREB-PMI/HindⅢ；2,4.重組質粒Fig.2 Identification of plant expression vector pDREB-PMI by restriction digestionM.TaKaRa Wide Range DNA Marker (500～12 000); 1,3.Recombinant plasmid pDREB-PMI/HindⅢ; 2,4.Recombinant plasmid

2.2 甘蔗對甘露糖的敏感性試驗

2.2.1 甘露糖濃度對甘蔗愈傷組織分化的影響

為了有效篩選出轉化植株，淘汰非轉化植物，選取生長旺盛、直徑約2 mm的甘蔗愈傷組織塊接種到不同質量濃度甘露糖和蔗糖配比的分化培養(yǎng)基中，通過觀察愈傷組織分化情況確定甘露糖的臨界耐受濃度。結果如圖3，當甘露糖質量濃度為1 g·L-1時，愈傷組織分化正常。甘露糖質量濃度為2 g·L-1時，愈傷組織分化受到了嚴重影響， 只看到少量綠色芽點。甘露糖質量濃度為3 g·L-1時，少量分化的外植體后期黃化死亡。為此，選擇3 g·L-1的甘露糖濃度用于甘蔗遺傳轉化分化階段的選擇壓。

2.2.2 甘露糖濃度對甘蔗無菌苗生根的影響

甘露糖能抑制無菌苗生根，轉化植株在含有甘露糖的培養(yǎng)基上正常生根，非轉化植株將不能生根死亡。為了有效篩選抗性植株，將無菌苗莖段接種到不同質量濃度的甘露糖和蔗糖培養(yǎng)基中。通過觀察甘蔗無菌苗生根情況確定甘露糖的臨界耐受濃度。結果如圖4，當甘露糖質量濃度為1或2 g·L-1時，無菌苗能長出新根。當甘露糖質量濃度為3 g·L-1時，無菌苗生根受到抑制。隨著甘露糖質量濃度的不斷增加，根系無法生長，葉片開始變黃，基部也開始褐化。為此，本研究在進行促根篩選時，以3 g·L-1甘露糖作為篩選濃度。

圖3 甘露糖濃度對甘蔗愈傷組織分化的影響Fig.3 Results of callus differentiation under different mannose selection pressures

圖4 生根培養(yǎng)對甘露糖的敏感性Fig.4 Results of rooting under different mannose selection pressures

2.3 轉化植株的檢測

2.3.1 轉化植株的PCR檢測

利用基因槍轉化技術，共轟擊15個培養(yǎng)皿1 200個愈傷組織塊，獲得51株幼苗，轉化再生頻率為4.25%。對篩選獲得的抗性植株分別提取葉片DNA，進行目的基因的PCR檢測。結果有8株擴增出預期大小的特異性條帶，與質粒擴增的條帶大小相同，而非轉化植株對照植株中未擴增出相應的條帶(圖5)。初步證明外源EaDREB2B基因已整合到甘蔗基因組中。

圖5 轉化植株的PCR檢測 M. 250 bp DNA Ladder Marker(TakaRa)；1.質粒DNA(陽性對照)；2.空白對照；3.未轉化植株(陰性對照)；4～17.轉化甘蔗植株Fig.5 The PCR detection of transformed sugarcane M. 250 bp DNA Ladder Marker(TakaRa); 1.Plasmid DNA(Positive control); 2.Blank control; 3.Nontransformed sugarcane(negative control); 4-17.Transformed sugarcane

2.3.2 轉化植株的點雜交(Dot-blotting)檢測

為了進一步確定目的片段整合到甘蔗基因組中，以pDREB-PMI植物表達載體質粒DNA為模板，利用PCR檢測引物對其進行擴增，將獲得的產物片段回收純化用作雜交探針，對8株PCR呈陽性的轉化植株進行點雜交分析，為了增強實驗結果的可靠性，在進行雜交分析時，選取2個PCR檢測呈陰性的非轉基因抗性植株作為質控點(圖6)。8株陽性植株都出現(xiàn)和質粒對照一樣的雜交信號，表明目的片段已整合到甘蔗基因組中。

圖6 轉化植株的點雜交分析1.質粒；2.未轉基因甘蔗；3～12.抗性轉化植株 3～4、6～7、9～12. PCR檢測陽性植株Fig.6 Dot blotting analysis of transformed sugarcane1.Plasmid; 2.Non-transgenic sugarcane; 3-12.Putative transgenic sugarcane

2.3.3 轉基因甘蔗的RT-PCR檢測

為了檢測干旱脅迫下轉基因甘蔗中EaDREB2B基因能否在誘導型啟動子rd29A的驅動下轉錄表達，本實驗將點雜交呈陽性的轉基因植株進行干旱脅迫后，對其葉片提取RNA后進行RT-PCR分析。鑒定結果表明(圖7)：在干旱脅迫下，轉基因甘蔗中的EaDREB2B基因均能在轉錄水平上表達。

圖7 轉基因甘蔗的RT-PCR分析M. DL2000 Marker(TakaRa)；P.質粒；B.空白對照；CK.未轉基因甘蔗；1～8.轉基因甘蔗Fig.7 RT-PCR analysis of the EaDREB2B expression in transgenic sugarcaneM.DL2000 Marker(TakaRa)；P.Plasmid；B.Blank control；CK.Untransformed sugarcane(negative control)；1-8.Transformed sugarcane

2.3.4 轉基因甘蔗的氯酚紅(CPR)檢測

氯酚紅染色培養(yǎng)4 d天后觀察實驗結果(圖8)表明：在含有甘露糖的液體培養(yǎng)基中，8個轉基因無性系葉片呈現(xiàn)陽性反應，培養(yǎng)基顏色發(fā)生變化，呈現(xiàn)黃色，在不含有甘露糖的液體培養(yǎng)基中顏色未發(fā)生改變。實驗結果說明8個轉基因無性系具有PMI活性，pmi基因不僅可以作為一種選擇標記基因，而且還完全可以象Gus基因一樣，作為轉基因植株的報告基因，因此pmi基因作為一種標記基因，不僅安全，而且檢測方便，可以減少假陽性植株。

圖8 轉基因甘蔗葉片的氯酚紅(CPR)分析 CK1.未轉化的組培苗；CK2.空白對照；1～8.待檢測的轉基因植株 第1排液體培養(yǎng)基中含有3 g·L-1甘露糖；第2排液體培養(yǎng)基中不含甘露糖Fig.8 Chlorophenol red asasy of transgenic sugarcane leaf CK1.Nontransformed tissue culture sugarcane；CK2.Blank control；1-8.Transformed sugarcane

圖9 第一代轉基因甘蔗EaDREB2B基因的PCR檢測 M.DL2000 Marker(TakaRa)；1.質粒DNA(陽性對照)；2.空白對照；3.未轉化植株(陰性對照)；4～17.轉化甘蔗植株Fig.9 The PCR detection of EaDREB2B gene in first generation of transgenci sugarcane M.DL2000 Marker(TakaRa)；1.Plasmid DNA(Positive control)；2.Blank control；3.Nontransformed sugarcane(negative control)；4-17：Transformed sugarcane

圖10 第一代轉基因甘蔗EaDREB2B基因的RT-PCR檢測 M.DL2000 Marker(TakaRa)；P.質粒DNA；B.空白對照；CK.未轉化甘蔗；1～8.轉基因甘蔗Fig.10 RT-PCR detection of EaDREB2B gene in first generation of transgenic sugarcane M.DL2000 Marker(TakaRa)；P.Plasmid DNA；B.Blank control；CK.nontransformed sugarcane；1-8.Transgenic sugarcane

2.3.5轉基因甘蔗后代中EaDREB2B基因的遺傳穩(wěn)定性

對轉基因T1代甘蔗植株遺傳檢測直接采用PCR擴增外源EaDREB2B基因，電泳結果顯示(圖9)：在轉基因甘蔗中仍能檢測到EaDREB2B基因，而在非轉基因甘蔗中未檢測到目的條帶；同時，本研究取脅迫處理下T1代各無性系的葉片提取RNA，進行RT-PCR分析，電泳結果顯示(圖10)：8個樣品都擴增出陽性目的的條帶。以上結果表明EaDREB2B基因在轉基因甘蔗無性系T1代中穩(wěn)定遺傳。

3 討論

目前使用的抗性標記基因大多數(shù)是抗生素或除草劑抗性基因。當目的基因導入植物基因組后，標記基因就完成了使命[17～18]。隨著轉基因植物的商品化，抗性標記基因潛在的生態(tài)和食用安全性倍受關注。植物體內的標記基因持久表達不僅給植物生長發(fā)育產生抑制作用，而且給其它有利性狀基因的表達帶來不確定的影響。對于環(huán)境釋放或商品化生產的轉基因植物而言，人們擔心標記基因的抗性遷移會給目前使用的抗生素和除草劑帶來挑戰(zhàn)。盡管目前沒有關于標記基因遷移帶來危害的報道[19]，但抗性標記基因潛在的生態(tài)環(huán)境和食用安全性一直頗具爭議，人們對轉基因作物的這些擔心依舊是制約轉基因作物發(fā)展的一個因素。

就轉基因安全而言，大力發(fā)展正向篩選系統(tǒng)，使用對生物安全的非抗性標記基因是最為有效的辦法[20]。目前，磷酸甘露糖異構酶基因(pmi)作為有效的正向選擇體系的安全標記基因，已經在果樹、水稻、棉花及番茄的遺傳轉化篩選中得到了應用。Reed等[10]對轉基因玉米和甜菜中pmi基因所編碼的蛋白質進行了全面的分析，認為甘露糖篩選體系對人體健康和環(huán)境十分安全，世界上30多個獨立科學委員會已認可pmi基因的安全性[21]。本實驗通過甘露糖對甘蔗愈傷組織分化及無菌苗生根的影響，建立了甘蔗以甘露糖為篩選標記的轉化體系。從實驗結果來看，通過甘露糖篩選共獲51株抗性苗，經分子檢測其中8株為陽性轉化植株，多為假陽性植株，陽性檢出率較低，不排除有其他因素，篩選壓也有待于進一步優(yōu)化。此外，本實驗pmi基因的表達情況能通過氯酚紅由紫紅色變?yōu)辄S色的顏色變化來定性檢測，與傳統(tǒng)分子雜交相比，該方法具有操作簡便、快捷、經濟高效等優(yōu)點。因此，除作為標記基因外，pmi基因還可在一定程度上行使報告基因的功能。

本研究成功構建含pmi標記基因的植物表達載體，遺傳轉化甘蔗后經分子檢測結果表明，EaDREB2B基因已經整合到甘蔗基因組中，并在轉基因甘蔗無性系T1代中穩(wěn)定遺傳。本實驗為更好的利用該標記基因提高轉基因甘蔗的安全性奠定基礎，同時對進一步研究EaDREB2B基因在提高甘蔗抗旱性方面奠定了基礎。

1.張木清,陳如凱.作物抗旱分子生理與遺傳改良[M].北京:科學出版社,2005.

Zhang M Q,Chen R K.Molecular physiological and genetic modified of Corp drought resistance[M].Beijing:Science Press,2005.

2.王自章,張樹珍,楊本鵬,等.甘蔗根癌農桿菌介導轉化海藻糖合酶基因獲得抗?jié)B透脅迫能力增強植株[J].中國農業(yè)科學,2003,36(2):140-146.

Wang Z Z,Zhang S Z,Yang B B,et al.Trehalose synthase gene transfer mediated byAgrobacteriumtumefaciensenhances resistance to osmotic stress in sugarcane[J].Scientia Agricultura Sinica,2003,36(2):140-146.

3.姚偉,余愛麗,徐景升,等.轉ScMV-CP基因甘蔗的分子生物學分析與鑒定[J].分子植物育種,2004,2(1):13-18.

Yao W,Yu A L,Xu J S,et al.Analysis and identification for transgenic sugarcane of ScMv-CP gene[J].Molecular Plant Breeding,2004,2(1):13-18.

4.Stockinger E J,Gilmour S J,Thomashow M F.ArabidopsisthalianaCBF1 encodes an AP2domain-containing transcriptional activator that binds to the C-repeat/DRE,a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1997,94(3):1035-1040.

5.Rehman S,Mahmood T.Functional role of DREB and ERF transcription factors:regulating stress-responsive network in plants[J].Acta Physiologiae Plantarum,2015,37(9):178.

6.劉翠芳,鄒杰,陳信波.DREB轉錄因子與植物非生物脅迫抗性研究進展[J].生物技術通報,2010(10):26-30,48.

Liu C F,Zou J,Chen X B.Advances in DREB transcription factors and plant abiotic stress tolerance[J].Biotechnology Bulletin,2010(10):26-30,48.

7.李墨野,王娜,周宇,等.干旱脅迫條件下轉LbDREB基因大青楊瞬時基因表達及生長、生理指標變異分析[J].植物研究,2016,36(3):409-415.

Li M Y,Wang N,Zhou Y,et al.Variation analysis of transient gene expression and growth,physiological indicators under drought stress in expressedLbDREBPopulusussuriensiskom[J].Bulletin of Botanical Research,2016,36(3):409-415.

8.Chen H L,Liu L P,Wang L X,et al.VrDREB2A,a DREB-binding transcription factor fromVignaradiata,increased drought and high-salt tolerance in transgenicArabidopsisthaliana[J].Journal of Plant Research,2016,129(2):263-273.

9.Mizoi J,Ohori T,Moriwaki T,et al.GmDREB2A; 2,a canonical dehydration-responsive element-binding protein2-type transcription factor in soybean,is posttranslationally regulated and mediates dehydration-responsive element-dependent gene expression[J].Plant Physiology,2013,161(1):346-361.

10.Reed J,Privalle M,Powell L,et al.Phosphomannose isomerase:an efficient selectable marker for plant transformation[J].In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant,2001,37(2):127-132.

11.Lee B T,Matheson N K.Phosphomannoisomerase and Phosphoglucoisomerase in seeds ofCassiacoluteoidesand some other legumes that synthesize galactomannan[J].Phytochemistry,1984,23(5):983-987.

12.Joersbo M,Donaldson I,Kreiberg E,et al.Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet[J].Molecular Breeding,1998,4(2):111-117.

13.Hansen G,Wright M S.Recent advances in the transformation of plants[J].Trends in Plant Science,1999,4(6):226-231.

14.Min B W,Cho Y N,Song M J,et al.Successful genetic transformation of Chinese cabbage using phosphomannose isomerase as a selection marker[J].Plant Cell Reports,2007,26(3):337-344.

15.Wallbraun M,Sonntag K,Eisenhauer C,et al.Phosphomannose-isomerase(pmi) gene as a selectable marker forAgrobacterium-mediated transformation of rapeseed[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture(PCTOC),2009,99(3):345-356.

16.Jain M,Chengalrayan K,Abouzid A,et al.Prospecting the utility of a PMI/mannose selection system for the recovery of transgenic sugarcane(Saccharumspp.hybrid) plants[J].Plant Cell Reports,2007,26(5):581-590.

17.Hohn B,Levy A A,Puchta H.Elimination of selection markers from transgenic plants[J].Current Opinion in Biotechnology,2001,12(2):139-143.

18.Hare P D,Chua N H.Excision of selectable marker genes from transgenic plants[J].Nature Biotechnology,2002,20(6):575-580.

19.Puchta H.Marker-free transgenic plants[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2003,74(2):123-134.

20.Wright M,Dawson J,Dunder E,et al.Efficient biolistic transformation of maize(ZeamaysL.) and wheat(TriticumaestivumL.) using the phosphomannose isomerase gene,pmi,as the selectable marker[J].Plant Cell Reports,2001,20(5):429-436.

21.Haldrup A,Petersen S G,Okkels F T.Positive selection:a plant selection principle based on xylose isomerase,an enzyme used in the food industry[J].Plant Cell Reports,1998,18(1-2):76-81.

The science and technology support project of Jiangxi Province(20122BBF60135);The science foundation of Jiangxi Provincial education department(GJJ13543)

introduction：WU Yang(1980—),male,doctor,associate professor,major in plant stress physiology and molecular biology.

date:2016-11-14

TransformationofEaDREB2BGeneintoSugarcaneUsingpmiGeneasSelectableMarker

WU Yang1,2HE Li1HUANG Yong1ZHANG Mu-Qing2

(1.School of Life Sceinces,Jinggangshan University,Ji’an 343009；2.Ministry of Agriculture Key Lab of Eco-physiology and Genetic Improvement for Sugarcane,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002)

The plant expression vector of pDREB-PMI was constructed successfully with expression vector of prd29a-dreb-hyg and pZMLR14 by restriction-ligase reaction. Sugarcane callus were transformed with pDREB-PMI expression vector by bombardment. After mannose selection, 51 regenerated plants were obtained with the transformation rate of 4.25%. All of these 51 seedlings were detected with molecular detection, and the 8 seedlings were positive transgenic sugarcane. Chlorophenol red assay of transgenic sugarcane leaf showed that thepmigene was expressed in transgenic plants. T1-generation transgenic sugarcane were detected by PCR and RT-PCR, and the exogenous geneEaDREB2Bwas stably inherited. The results laid the foundation of further research on the effect ofEaDREB2Bgene in improving sugarcane resistance to drought stress.

sugarcane;pmigene;mannose

江西省科技廳科技支撐計劃項目(20122BBF60135)；江西省教育廳科技計劃項目(GJJ13543)

吳楊(1980—)，男，博士，副教授，主要從事植物逆境生理與分子生物學研究。

* 通信作者：E-mail:wuyangfenghao@163.com

2016-11-14

* Corresponding author：E-mail:wuyangfenghao@163.com

S566.1

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.03.007