夏南牛無角性狀的分子鑒定技術(shù)及應(yīng)用

曾璐嵐，郝新興，祁興磊，林鳳鵬，黃永震，黨瑞華，藍(lán)賢勇，陳 宏，雷初朝﹡

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.河南省泌陽縣畜牧局，河南 泌陽 463700)

夏南牛無角性狀的分子鑒定技術(shù)及應(yīng)用

曾璐嵐1，郝新興2，祁興磊2，林鳳鵬2，黃永震1，黨瑞華1，藍(lán)賢勇1，陳 宏1，雷初朝1﹡

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.河南省泌陽縣畜牧局，河南 泌陽 463700)

[目的]旨在檢測夏南牛公牛和母牛的有角與無角性狀及其相應(yīng)的基因型，為夏南牛無角品系的選育奠定分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。[方法]采用PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳分型的方法。[結(jié)果]通過對(duì)夏南牛P202ID位點(diǎn)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其基因型有三種，即PC/PC，PC/prs和Prs/Prs，其基因型頻率分別為3.54%，78.76% 和 17.70%。分子鑒定結(jié)果表明，113頭夏南牛的基因型與其無角與有角性狀一致。[結(jié)論]可利用單倍型P202ID有效鑒定夏南牛無角與有角性狀，并用于夏南牛無角品系的選育，具有重要推廣價(jià)值。

夏南牛；無角性狀；基因型；分子鑒定

牛角是?？苿?dòng)物特有的組織結(jié)構(gòu)，它由外角質(zhì)蛋白層和中空的骨組成[1]。角的發(fā)育依賴于不同的組織及其相互作用[2,3]。馴化前，角對(duì)動(dòng)物的自衛(wèi)非常重要。但是近年來，隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，特別是進(jìn)入集約規(guī)模化飼養(yǎng)后，角容易對(duì)動(dòng)物或飼養(yǎng)人員造成傷害。所以，幼年時(shí)去角在現(xiàn)代化養(yǎng)牛業(yè)中已經(jīng)成為一種公認(rèn)的實(shí)踐管理方法，但是這種方法不僅加大了畜牧場的工作量，而且會(huì)對(duì)動(dòng)物造成一定程度的傷害，有違動(dòng)物福利原則[4]。在一些發(fā)達(dá)國家，如歐盟，已經(jīng)啟動(dòng)了關(guān)于禁止動(dòng)物閹割和去角的ALCASDE工程[5]，而德國的動(dòng)物福利組織也聯(lián)合政府積極推廣無角公牛的精液，從而使牛群繁育向無角牛的方向發(fā)展。因此，通過對(duì)角性狀的研究，利用分子遺傳學(xué)技術(shù)鑒定并培育無角肉牛新品系成為解決經(jīng)濟(jì)利益與動(dòng)物福利原則沖突的最佳方法。

牛無角屬于顯性遺傳[3,6]。1993年Georges等[7]通過微衛(wèi)星標(biāo)記推測出控制牛角性狀的基因，并將其定位在1號(hào)染色體上。通過全基因組微衛(wèi)星篩選，篩選到BTA1上3個(gè)與牛的有角與無角性狀密切相關(guān)的標(biāo)記，分別為BM6438、TGLA49和SOD1[8-10]。2005年，Drgemüller等[11]對(duì)1號(hào)染色體一段4Mb區(qū)域進(jìn)行精確分析，并把角性狀基因的區(qū)域縮小到1Mb。Cargill 等[12]在2008年發(fā)現(xiàn)BTA1上的13個(gè)SNPs與角性狀密切相關(guān)。Li等[13]在北歐亞牛發(fā)現(xiàn)2個(gè)與無角性狀相關(guān)標(biāo)記即SOD1和AGLG17，分別位于BTA1和BTA20。Medugorac等[14]研究發(fā)現(xiàn)，牛6個(gè)無角突變位點(diǎn)(P5ID，PG1654405A，PC1655463T，PC1768587A，P80kbID和P202ID)控制牛的無角性狀，其中前5個(gè)突變位點(diǎn)是連鎖的，為荷斯坦奶牛特有的無角基因，命名為PF，除奶牛外，其他牛的無角性狀均為P202ID位點(diǎn)控制，其無角基因命名為PC；牛有角性狀則由prs基因控制。PF、PC、Prs是3個(gè)復(fù)等位基因；而PF、PC是2個(gè)等顯性等位基因，是相互獨(dú)立的2個(gè)遺傳系統(tǒng)，彼此不重組，其中任意一個(gè)突變位點(diǎn)存在牛都表現(xiàn)為無角性狀。因此，基于這6個(gè)無角突變位點(diǎn)就能鑒定該牛是無角牛還是有角牛。本試驗(yàn)旨在利用分子遺傳學(xué)技術(shù)鑒定夏南牛公牛和核心群母牛的有角與無角性狀，所選夏南牛血統(tǒng)純正，無荷斯坦奶牛血統(tǒng)。因此，本研究通過PCR擴(kuò)增方法對(duì)夏南牛P202ID位點(diǎn)進(jìn)行檢測，就可以利用該突變位點(diǎn)有效鑒定夏南牛角的有無及其相應(yīng)的基因型，為夏南牛無角品系的選育奠定分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本研究采集了113頭夏南牛耳組織樣(采自河南省泌陽縣夏南牛保種場)；其中93頭無角夏南牛 (其中公牛2頭，母牛91頭)、20頭有角夏南牛(公牛1頭，母牛19頭)。-20℃保存。

1.2 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增

利用酚-氯仿法提取基因組DNA。根據(jù)Medugorac等[14]發(fā)表的引物，正鏈序列為：5′-TCAAGAAGGCGGCACTATCT-3′; 反鏈序列為: 5′-TGATAAACTGACCCTCTGCCTATA-3′，由華大基因科技股份有限公司合成引物。PCR反應(yīng)體系為12.5 μL，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性4 min；94℃變性40s，59℃退火40s，72℃延伸30 s，32個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。分別以超純水、夏南牛的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中超純水作為空白對(duì)照。采用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

本研究利用合成的一對(duì)引物，共擴(kuò)增了92頭無角(其中公牛1頭，母牛91頭) 夏南牛、20頭(公牛1頭，母牛19頭)有角夏南牛的基因組DNA，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示；對(duì)夏南牛P202ID位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增片段大小、基因型及基因型頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見表1。從圖1和表1可以看出，夏南無角牛又分純合無角牛與雜合無角牛，純合無角夏南牛(母牛4頭)的基因型為PC/PC，只有1條擴(kuò)增帶571 bp，其頻率為3.54%；雜合無角夏南牛(其中公牛2頭，母牛87頭)的基因型為PC/Prs，有2條擴(kuò)增帶571 bp和369 bp，頻率為78.76%，無角夏南牛總的頻率為82.30%；有角夏南牛(公牛1頭，母牛19頭)為隱性純合子，其基因型為Prs/Prs，只有1條擴(kuò)增帶369 bp，其頻率為17.70%。因此，本研究的結(jié)果可以用于夏南牛中無角與有角性狀的分子鑒定，也適用于國內(nèi)其他黃牛品種無角與有角性狀的分子鑒定。這個(gè)標(biāo)記簡單實(shí)用，可以用于夏南牛無角品系的選育，具有重要推廣價(jià)值。

表1 夏南牛P202ID位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物大小、基因型與基因型頻率

3 討論

角是牛重要的外貌性狀，但是在進(jìn)入集約規(guī)?；曫B(yǎng)后，牛角不僅容易在集中運(yùn)輸和屠宰過程中對(duì)牛只和飼養(yǎng)人員造成傷害，還可能在飼養(yǎng)過程中破壞圈舍，損壞設(shè)施，從而造成不必要的經(jīng)濟(jì)損失[15]，因此，長期以來，牛的無角表型都是選擇和研究的目標(biāo)。世界各國的科學(xué)家在培育新的肉牛品種時(shí)都非常注重培育無角牛。目前已經(jīng)成功培育出多個(gè)無角品種[16]。例如，美國就曾利用英國最古老的肉用品種牛之一的短角牛育成無角短角牛。我國也已培育出大通牦牛無角新品系[17]。隨著時(shí)代的發(fā)展，分子遺傳技術(shù)正逐步與經(jīng)典的育種方法相結(jié)合應(yīng)用于牛的育種。Medugorac[18]等通過全基因組測序，發(fā)現(xiàn)在POLLED位點(diǎn)上有121-kb的片段從黃牛滲入到牦牛中，導(dǎo)致牦牛也變成了無角，這在很大程度上促進(jìn)了牦牛無角品系的培育。在奶牛上，Carlson等[19]利用基因編輯技術(shù)去除牛角，從而培育出無角奶牛，以提高動(dòng)物福利及方便規(guī)模化管理。

圖1 夏南牛無角與有角性狀的基因型注：1為雜合無角牛，3為純合無角牛，2、4為有角牛，5為空白對(duì)照

夏南牛是以夏洛來牛為父本，南陽牛為母本雜交培育而成的我國第一個(gè)肉牛品種，具有耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)、生長發(fā)育快、肉質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的推廣應(yīng)用前景[20]。夏南牛中既有有角牛，也存在無角牛。目前夏南牛依舊采用人工方法去角，但人工去角法往往伴隨著應(yīng)激和疼痛，還有可能對(duì)牛的生長發(fā)育造成影響[21]，所以培育夏南牛無角新品系是一種更為有效的途徑。本研究利用PCR方法對(duì)113頭夏南牛(其中93頭為無角牛，20頭為有角牛)單倍型P202ID位點(diǎn)進(jìn)行檢測，快速有效鑒定其無角與有角性狀及相應(yīng)的基因型，結(jié)果顯示113頭夏南牛基因檢測結(jié)果與其無角與有角性狀完全相符，表明本方法可以用于夏南牛與其他黃牛品種無角與有角性狀基因的分子鑒定，具有重要實(shí)踐意義。

4 應(yīng)用

利用本研究的分子遺傳學(xué)技術(shù)可以快速鑒定雜合無角牛、純合無角牛與有角牛，因此，該技術(shù)可以直接用于夏南牛無角品系的培育，加快選育進(jìn)程。

(1)利用純合無角種公牛與純合無角母牛(基因型均為PC/PC，只有1條擴(kuò)增帶571 bp)進(jìn)行交配，后代均為純合無角牛，這是最佳的夏南牛無角品系選育方案。

(2)鑒于夏南無角母牛95.6%(87/91)均為雜合無角牛的事實(shí)，利用純合無角種公牛(基因型均為PC/PC，只有1條擴(kuò)增帶571 bp)與雜合無角母牛(基因型為PC/Prs，有2條擴(kuò)增帶571 bp和369 bp)交配，后代100%為無角牛，但有50%為雜合無角牛。

(3)在培育夏南牛無角品系時(shí)，優(yōu)先推薦純合無角夏南牛作種公牛，禁止有角夏南牛作種公牛，也不建議使用雜合無角夏南牛作種公牛。但目前鑒定的2頭夏南種公牛均為無角雜合子，因此需要對(duì)其它夏南種公?；蚝髠浞N公牛進(jìn)行PCR鑒定，選出無角夏南種公牛與純合子或雜合子無角母牛進(jìn)行交配，以加快夏南無角牛新品系的培育進(jìn)程。

(4)本研究的優(yōu)點(diǎn)是省錢、省時(shí)、工作量小。從提取DNA到有角牛與無角牛性狀的鑒定，1天時(shí)間即可完成，無需測序，大大降低了成本和工作量，提高了工作效率。

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MolecularIdentificationandApplicationofPolledTraitinXiananCattle

ZENG Lu-lan1,HAO Xin-xing2,QI Xing-lei2,LING Feng-peng2,HUANG Yong-zhen1,Dang Rui-hua1,LAN Xian-yong1,CHEN Hong1,LEI Chu-zhao1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi. 712100,China; 2.AnimalHusbandryBureauinBiyangCounty,Biyang,Henan, 463700,China)

[Objective]The aim of this study was to identify the genotype about polled and horned traits of Xianan cattle, which would provide molecular genetics basis for further selection and breeding of polled Xianan cattle.[Method] PCR amplification and agarose gel electrophores methods were used to detect the genotype of individuals.[Result]After detecting the haplotype P202ID in Xianan cattle, three genotypes were detected. The frequencies of PC/PC, PC/Prs and Prs/Prs genotypes in 113 Xianan cattle were 3.54%, 78.76% and 17.70%, respectively. Importantly, the results showed that the genotypes of 113 Xianan cattle samples were completely consistent with the corresponding polled and horned traits.[Conclusion]The haplotype P202ID is an easy and effective marker to identify the polled and horned traits of Xianan cattle, and it can be used for the breeding of polled Xianan cattle, which is worth of extending and applying in cattle breeding.

Xianan cattle; polled trait; genotype; molecular identification

2017-05-05接收日期2017-05-25

國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-38)資助。

曾璐嵐(1994-)，女，湖南常寧人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物遺傳資源研究。

*通訊作者：雷初朝(1968-)，男，湖南常寧人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事牛遺傳資源研究。

S823

A

1001-9111(2017)04-0027-03