縉云黃芩的快速繁殖與搶救性保護(hù)

吳思婧　熊安琪　易子琳

摘要：采用組織培養(yǎng)法和枝條扦插法對(duì)縉云黃芩（Scutellaria tsinyunensis C. Y. Wu et S. Chow）進(jìn)行誘導(dǎo)和繁殖。組織培養(yǎng)通過對(duì)縉云黃芩外植體進(jìn)行消毒，獲得無(wú)菌苗后將其莖段及葉片分別接種于添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA、1.0 mg/L 2，4-D+0.25 mg/L KT的2種MS培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，60 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)情況；采用20、50、80 mg/L IAA和NAA 6種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理縉云黃芩枝條切口進(jìn)行扦插繁殖，30 d后統(tǒng)計(jì)生根情況，將繁殖的幼苗進(jìn)行野外移栽試驗(yàn)。結(jié)果表明，縉云黃芩可通過組織培養(yǎng)和扦插進(jìn)行繁殖，其莖段是直接誘導(dǎo)出芽的良好外植體，2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L的IAA誘導(dǎo)不定芽，可達(dá)75%的出芽率；50、80 mg/L IAA處理的縉云黃芩扦插苗成活率明顯高于其他處理；原生境野外回歸可以實(shí)現(xiàn)其搶救性保護(hù)。

關(guān)鍵詞：縉云黃芩（Scutellaria tsinyunensis C. Y. Wu et S. Chow）；扦插繁殖；組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：R282 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）19-3723-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.19.032

Abstract： The tissue culture method and shoot cutting method were used to induce and propagate Scutellaria tsinyunensis C. Y. Wu et S. Chow. The tissue culture was carried out by disinfecting the explants of Scutellaria tsinyunensis C. Y. Wu et S. Chow. The stem and leaves were inoculated into different MS mediums（added 2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA or 1.0 mg/L 2，4-D+0.25 mg/L KT）and induced adventitious buds. Then we statistics the rate of induction after 60 days. The cutting propagation of Scutellaria tsinyunensis C. Y. Wu et S. Chows branches was treated with different concentration of IAA and NAA （20，50，80 mg/L） and the rooting rate after 30 days was counted. The seedlings will be transplanted to the wild. The results showed that Scutellaria tsinyunensis C. Y. Wu et S. Chow could be propagated through tissue culture and cutting， and the stem segments can directly induce budding. The germination rate reached 75% under the induction of 2.0 mg/L 6-BA and 0.2 mg/L IAA. The survival rate of the cuttings of Scutellaria tsinyunensis C. Y. Wu et S. Chow was significantly higher than that of other treatments at 50， 80 mg/L IAA. Field regression can achieve its rescue protection.

Key words： Scutellaria tsinyunensis C. Y. Wu et S. Chow；cutting propagation；tissue culture

縉云黃芩（Scutellaria tsinyunensis C. Y. Wu et S. Chow），唇形科黃芩屬多年生草本植物，其根莖可入藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芩屬植物的提取物和單體化合物具有抗腫瘤、保肝、抗氧化、抗炎、抗驚厥、抗菌、抗病毒等作用[1]?？N云黃芩是重慶市縉云山特有的分布種[2]，主要生長(zhǎng)于海拔330～820 m的林下或林間空隙，尤喜水溝邊或路旁林沿等陰濕但又有一定光照的環(huán)境，居群面積小且呈相互隔離的嶼狀分布，現(xiàn)存?zhèn)€體數(shù)量較少。該物種于1966年被首次發(fā)現(xiàn)，由于在形態(tài)上接近同屬的云南黃芩，當(dāng)時(shí)僅將其作為云南黃芩的一個(gè)新變種——云南黃芩短柄變種，后于1977年作為新種收錄入中國(guó)植物志第65卷第2分冊(cè)，定名為縉云黃芩[3]。

林長(zhǎng)松等[4]研究表明，縉云黃芩種群數(shù)量及個(gè)體數(shù)量呈減少趨勢(shì)，分布范圍和個(gè)體數(shù)量不斷減少，已經(jīng)處于瀕危狀態(tài)。李俊敏等[5]從縉云黃芩與其他瀕危植物的生態(tài)位研究發(fā)現(xiàn)，縉云黃芩主要面臨的是在一定的生境中與其伴生物種對(duì)資源利用的相似性程度較高、生境及種群遭人為破壞嚴(yán)重的問題，這也是導(dǎo)致其瀕危的重要因素。由于縉云黃芩小堅(jiān)果萌發(fā)率低，其有性生殖能力亦較低。因此，對(duì)縉云黃芩的保護(hù)迫在眉睫，應(yīng)盡快采用人工栽培幫助其復(fù)壯和擴(kuò)大居群。本研究通過對(duì)縉云黃芩快速繁殖的探究，初步建立縉云黃芩組織培養(yǎng)和扦插培育體系，以期為縉云黃芩的搶救性保護(hù)提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

縉云黃芩取自重慶市縉云山洛陽(yáng)橋（N 29°50′，E 106°23′，海拔高度726 m），選取健康、長(zhǎng)勢(shì)一致的枝條。

6-芐氨基嘌呤（6-BA）、吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、6-糠氨基嘌呤（KT）、萘乙酸（NAA）均為成都市科龍化工試劑廠產(chǎn)品。腐殖土、珍珠巖、蛭石等購(gòu)自重慶北碚花鳥市場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 縉云黃芩組織培養(yǎng)

1）外植體的消毒：將縉云黃芩枝條去除葉片，保留腋芽和頂芽，用自來水加適量洗衣粉清洗，再用自來水洗凈，后流水沖洗1 h，75%乙醇浸泡30 s，后用無(wú)菌水沖洗，再用0.1%升汞消毒6 min，最后用無(wú)菌水沖洗。

2）無(wú)菌苗的獲得：將處理好的枝條剪成1.0～1.5 cm的帶頂芽或腋芽的莖段，接入pH 5.8的MS培養(yǎng)基（其中添加蔗糖30 g/L，瓊脂6.2 g/L）。每瓶植入2～3 個(gè)外植體，共10瓶，在光照度5 000 lx，光照時(shí)間14 h/d，溫度25 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 d，統(tǒng)計(jì)污染和存活情況，獲得無(wú)菌苗，用于不定芽的誘導(dǎo)。

3）不定芽的誘導(dǎo)：將無(wú)菌苗莖段和葉片在無(wú)菌操作臺(tái)上切成0.5～1.0 cm長(zhǎng)度莖段和0.5～1.0 cm2的葉片，接種于2種不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方的MS培養(yǎng)基（2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA和1.0 mg/L 2，4-D+0.25 mg/L KT）中，在光照度5 000 lx，光照時(shí)間14 h/d，溫度25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 d后，統(tǒng)計(jì)生長(zhǎng)狀況。

1.2.2 縉云黃芩的扦插

1）插穗的采集和處理。陰天早上8：00～10：00采集插穗，采穗前用噴壺給葉面灑水，防止穗條失水。用修枝剪把穗條截成長(zhǎng)10 cm左右，每根插條保留最頂端兩葉和一芽，除去基部葉片，切口為直角，平滑無(wú)破裂。

2）植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及濃度對(duì)縉云黃芩生根的影響。試驗(yàn)以IAA和NAA為外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，分別設(shè)置低濃度（20 mg/L）、中等濃度（50 mg/L）和高濃度（80 mg/L）6個(gè)試驗(yàn)組，以清水為對(duì)照，將縉云黃芩切口部位在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑溶液中浸泡 2 h后進(jìn)行扦插。扦插基質(zhì)為腐殖土∶蛭石∶珍珠巖= 3∶1∶1，扦插深度3 cm，插穗間距10 cm。在25 ℃、光照度3 000 lx、光照時(shí)間14 h/d的溫室中培養(yǎng)，每天澆水并觀察生長(zhǎng)情況，30 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 縉云黃芩的組織培養(yǎng)

2.1.1 無(wú)菌苗的獲得 縉云黃芩的生長(zhǎng)環(huán)境大多陰暗潮濕，采集的枝條附帶大量微生物，難以徹底消毒。獲得無(wú)菌材料時(shí)，外植體消毒時(shí)既要?dú)⑺乐l表面的全部微生物，使污染率降到最低，又要保持外植體的活力。本試驗(yàn)采用的二次消毒法，培養(yǎng)18 d后統(tǒng)計(jì)污染與生長(zhǎng)狀況。污染率降低到66.7%，存活率達(dá)到33.3%。

MS培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)元素全面，能夠提供組織生長(zhǎng)所需的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)[6]。培養(yǎng)40 d后，結(jié)果表明，縉云黃芩無(wú)菌苗能夠在MS培養(yǎng)基上較好地生長(zhǎng)，莖較粗壯、直立，頂部少量褐化，新葉呈健康綠色，葉片伸展，少數(shù)無(wú)菌苗長(zhǎng)出須根（圖1）。

2.1.2 不定芽誘導(dǎo) 縉云黃芩無(wú)菌苗培養(yǎng)40 d后，用莖段和葉片為外植體誘導(dǎo)不定芽，60 d后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1和圖2?？N云黃芩莖段在不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配方的MS培養(yǎng)基中的出芽率差異明顯，以2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA誘導(dǎo)時(shí)，莖段出芽率達(dá)到75.0%，褐化率僅為25.0%；以1.0 mg/L 2，4-D+0.25 mg/L KT誘導(dǎo)時(shí)未長(zhǎng)出不定芽，外植體全部褐化。2種配方處理下葉片均不能直接誘導(dǎo)出不定芽，而是先形成愈傷組織，但愈傷組織100.0%褐化。以上結(jié)果表明，縉云黃芩莖段是直接誘導(dǎo)出芽的良好外植體，其在添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA的MS培養(yǎng)基中能夠較好地產(chǎn)生不定芽。

2.2 縉云黃芩的扦插繁殖

2.2.1 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及濃度對(duì)縉云黃芩扦插生根的影響 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及濃度對(duì)縉云黃芩扦插生根的影響結(jié)果見表2和圖3。與對(duì)照組相比，所有添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的處理均不同程度地提高了縉云黃芩插條的生根率。在相同濃度下，IAA處理的插條生根率均高于NAA處理。說明IAA更適合用于縉云黃芩的扦插生根。對(duì)于不同濃度的IAA處理，50、80 mg/L的IAA刺激下縉云黃芩插條生根率均較高，為75.0%。但從節(jié)約資源的角度考慮，50 mg/L的IAA濃度是提高縉云黃芩扦插生根率的較優(yōu)選擇。

2.3 縉云黃芩扦插苗的野外回歸

將縉云黃芩扦插苗移栽至發(fā)現(xiàn)地（原生境）。通過移栽后的7、30 d，一季度等時(shí)間段的觀察，認(rèn)為扦插苗已經(jīng)適應(yīng)了野外環(huán)境，扦插苗野外回歸存活率100.0%（圖4）。在后續(xù)研究中需要進(jìn)一步跟蹤其品質(zhì)變化，確認(rèn)其搶救性保護(hù)可以通過組織培養(yǎng)和扦插進(jìn)行快速繁殖、原生境野外回歸來實(shí)現(xiàn)。

3 結(jié)論

1）研究表明，縉云黃芩可以通過組織培養(yǎng)和扦插進(jìn)行快速繁殖，原生境野外回歸的成功證實(shí)可實(shí)現(xiàn)其搶救性保護(hù)。

2）縉云黃芩以葉片進(jìn)行組織培養(yǎng)未誘導(dǎo)出不定芽，而縉云黃芩莖段是直接誘導(dǎo)出芽的良好外植體，其出芽率可達(dá)75.0%以上，褐化率較低（25.0%以下）。

3）IAA適用于縉云黃芩的扦插。50、80 mg/L的IAA刺激下插條生根率均可達(dá)到75.0%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 厙士芳.黃芩屬植物的藥用價(jià)值研究[J].中醫(yī)藥信息，2012， 29（3）：139.

[2] 張家輝，楊 蕊，鄧洪平.縉云黃芩HPLC指紋圖譜的建立及其不同部位活性成分含量研究[J].中國(guó)中藥雜志，2009，34（19）：2485-2487.

[3] 楊 牟.縉云山黃芩屬（Scutellaria Linn.）植物的細(xì)胞學(xué)與葉表皮微型態(tài)分析[D].重慶：西南大學(xué)，2015.

[4] 林長(zhǎng)松，何 平，鄧洪平.縉云山特有植物縉云黃芩的遺傳多樣性研究[J].西北植物學(xué)報(bào)，2003，23（4）：566-571.

[5] 李俊敏，何 平，林永慧，等.縉云山特有植物縉云黃芩種群生態(tài)位研究[J].西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，29（3）： 451-455.

[6] 楊秀平，劉莉麗.植物組織培養(yǎng)常用基本培養(yǎng)基的數(shù)量分析[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25（1）：97-100.