倒地鈴乙酸乙酯提取物體外抗氧化活性研究

梁華益　吳開(kāi)慧　馮霞

摘要：為研究倒地鈴（Cardiospermum halicacabum）乙酸乙酯提取物的體外抗氧化作用，用乙酸乙酯加熱回流提取倒地鈴中的有效成分，采用紫外分光光度計(jì)法，測(cè)定其消除DPPH自由基能力，并以丁基羥基茴香醚（BHA）作為參照測(cè)定螯合Fe2+能力以及還原Fe3+能力。結(jié)果表明，倒地鈴乙酸乙酯的提取物對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除能力，對(duì)Fe2+的螯合能力及還原Fe3+的能力也較強(qiáng)，說(shuō)明倒地鈴乙酸乙酯提取物的抗氧化性較強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：倒地鈴（Cardiospermum halicacabum）；乙酸乙酯；抗氧化；自由基

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）19-3720-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.19.031

Abstract： To study the antioxidant effects of ethyl acetate extract from Cardiospermum halicacabum，refluxing the Cardiospermum halicacabum with ethyl acetate to extract the active components. The UV spectrophotometry was applied to determine the ability of eliminating DPPH radicals，chelating Fe2+ in comparing with butyl hydroxy anisole（BHA） and reducing Fe3+ to evaluate its antioxidant activity. Results showed that，the ethyl acetate extract of Cardiospermum halicacabum had strong ability to clear DPPH free radicals，the ability of chelating Fe2+ and the reduction of Fe3+ were also strong，showing the ethyl acetate extract from Cardiospermum halicacabum have strong antioxidant capacity.

Key words： Cardiospermum halicacabum；ethyl acetate extract；antioxidant

倒地鈴（Cardiospermum halicacabum）是無(wú)患子科植物，干燥全草，味苦、寒，具有清熱解毒、涼血、消腫之效，常用來(lái)治療百日咳、咽喉炎、糖尿病、疔瘡、濕疹等。相關(guān)研究表明，倒地鈴主要含有：十五烷酸、蒲公英賽醇、芹菜素、棕櫚酸、原兒茶酸、β-谷甾醇、原兒茶醛、正二十七烷、β-香樹(shù)脂醇、蘆丁、毛蕊異黃酮、槲皮素、β-香樹(shù)脂醇棕櫚酸酯、豆甾醇、β-胡蘿卜苷、金圣草黃素、豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷、3β-赤楊醇等成分[1]。倒地鈴中有黃酮、萜類(lèi)、甾醇和有機(jī)酸等多種化學(xué)成分。黃酮類(lèi)化合物具有抗氧化及抗自由基、抗腫瘤、抗人類(lèi)免疫缺陷病毒、抗炎及抗免疫、抗心血管疾病、雌激素樣與抗雌激素樣等功能[2]。目前，國(guó)內(nèi)外主要對(duì)倒地鈴的研究在成分和藥理方面上，但體外抗氧化方面研究較少，對(duì)倒地鈴的乙酸乙酯提取物體外抗氧化研究更少。因此，本試驗(yàn)對(duì)倒地鈴的乙酸乙酯提取物進(jìn)行研究，為倒地鈴的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

倒地鈴，購(gòu)于廣西百色市。

1.2 試劑

乙酸乙酯、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、無(wú)水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、過(guò)氧化氫、硫酸亞鐵、1，1-二苯基-2-三硝基苦肼（DPPH）（美國(guó)Sigma公司）、丁基羥基茴香醚（BHA）（上海晶純?cè)噭┯邢薰?，批?hào)：20452）、菲洛嗪等，均為AR。

1.3 儀器與設(shè)備

電子天平（GN2085型，上海民橋精密科學(xué)有限公司）；臺(tái)式離心機(jī)（TDL80-2B型，上海安亭科學(xué)儀器廠）；回流裝置；水浴鍋（HH-S型，鞏義市英峪予華儀器廠）；電熱恒溫旋風(fēng)干燥箱（DHG-9O70OA型，上海精密設(shè)備有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-300型，上海阿榮生化儀器廠）；紫外可見(jiàn)分光光度儀（755B型，上海精密儀器公司）。

1.4 方法

1.4.1 倒地鈴乙酸乙酯提取物的提取 精確稱(chēng)取粉碎過(guò)的倒地鈴粉末50.000 g，放入500 mL乙酸乙酯中浸泡1 h，加熱回流提取2 h，抽取濾液后放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮除去溶劑，烘干制成浸膏，稱(chēng)量，用乙酸乙酯溶解制備成所需濃度的倒地鈴樣品提取液，備用。

1.4.2 清除DPPH自由基能力 DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，與抗氧化劑發(fā)生反應(yīng)，提供H被還原，顏色由深紫色變?yōu)榈S色，可用紫外可見(jiàn)分光度法定量測(cè)定，以高濃度逐漸稀釋的方式檢測(cè)不同濃度樣品對(duì)自由基的清除率，以自由基清除率為50%時(shí)樣品的濃度（IC50）來(lái)衡量樣品對(duì)自由基的清除能力，IC50越小，表明樣品清除自由基的能力越強(qiáng)[3]。

取5只5 mL具塞比色管，加入0.5 mL新配置的6×10-4 mol/L DPPH溶液，然后加入1 mL濃度分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL的樣品溶液用無(wú)水乙醇定容至5 mL，室溫暗光下反應(yīng)30 min，以無(wú)水乙醇調(diào)零，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。

清除率=[（A1-A2）/A1]×100%

式中，A1為開(kāi)始反應(yīng)時(shí)空白吸光度，A2為反應(yīng)30 min時(shí)的吸光度。

1.4.3 對(duì)Fe2+螯合能力試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[4]，于10支5 mL具塞比色管中分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL濃度為0.2 mg/mL樣品溶液及標(biāo)準(zhǔn)品BHA溶液，再加入0.2 mol/L FeSO4 0.1 mL溶液混勻，加入5 mol/L菲啰嗪0.2 mL，無(wú)水乙醇定容到5 mL充分振蕩，室溫下放置10 min。以無(wú)水乙醇調(diào)零，562 nm處測(cè)定吸光度（進(jìn)行3次平行測(cè)定），吸光度越低表示金屬螯合能力越強(qiáng)。

螯合率=[（A0-A1）/A0]×100%

式中，A0為不加樣品時(shí)的吸光度，A1為加入樣品時(shí)的吸光度。

1.4.4 還原Fe3+能力試驗(yàn) 采用普魯士蘭法，測(cè)定樣品還原Fe3+能力，在5只5 mL具塞比色管中依次加入濃度分別為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的樣品溶液2.5 mL，0.2 mol/L pH為6.6 2.5 mL磷酸鹽緩沖液和2.5 mL鐵氰化鉀（1%），混勻后置于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，然后加入2.5 mL三氯乙酸（10%），混勻后將溶液離心（3 000 r/m）10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL（0.1%）三氯化鐵溶液，混勻，以試劑空白作參比，在700 nm處測(cè)定吸光度，吸光度增加表明還原能力增強(qiáng)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 清除DPPH自由基能力

倒地鈴乙酸乙酯提取物對(duì)DPPH自由基清除能力結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可知，倒地鈴乙酸乙酯提取物對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除作用，且隨著濃度的增加而增強(qiáng)，呈一定的量效關(guān)系。當(dāng)?shù)沟剽徧崛∥锏臐舛葹?.628 177 mg/mL時(shí)倒地鈴對(duì)DPPH自由基的清除率為50%，說(shuō)明倒地鈴乙酸乙酯提取物對(duì)DPPH自由基清除能力較強(qiáng)。

2.2 對(duì)Fe2+螯合能力

倒地鈴乙酸乙酯提取物對(duì)Fe2+螯合能力見(jiàn)圖2。從圖2可知，倒地鈴乙酸乙酯提取物和標(biāo)準(zhǔn)品BHA對(duì)Fe2+都具有較強(qiáng)的螯合能力，但螯合率與樣品濃度增加不成量效關(guān)系，且與BHA相比倒地鈴螯合Fe2+能力較弱。

2.3 還原Fe3+能力

倒地鈴乙酸乙酯提取物對(duì)Fe3+還原能力見(jiàn)圖3。從圖3可知，隨著濃度的增加，吸光度增加，說(shuō)明還原Fe3+能力也隨著增強(qiáng)，還原Fe3+能力隨濃度的增加呈量效關(guān)系，證明倒地鈴具有一定的抗氧化作用。

3 討論

天然產(chǎn)物成為現(xiàn)代重要的抗氧化劑，具有低毒、高效的清除人體多余的自由基，能預(yù)防衰老以及治療自由基引發(fā)的相關(guān)疾病，對(duì)保護(hù)人類(lèi)的身體健康起著重要的保障作用，所以從天然產(chǎn)物中探索新的清除人體自由基的抗氧化劑成為醫(yī)藥、保健事業(yè)發(fā)展的趨勢(shì)[6]。天然植物是體外抗氧化物質(zhì)的重要資源，其提取物的抗氧化作用研究受到人們關(guān)注。不同天然植物提取成分的性質(zhì)及抗氧化機(jī)制不同，其抗氧化機(jī)制主要有直接清除或抑制自由基，提供質(zhì)子、電子，作用于與自由基有關(guān)的酶，抑制氧化酶的活性[7]。自由基是人體在新陳代謝中不斷產(chǎn)生的，具有極強(qiáng)的的氧化能力，如果積累過(guò)多，可以通過(guò)一系列氧化反應(yīng)破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，從而造成人體因氧化作用而誘發(fā)多種損傷，如動(dòng)脈粥樣硬化、心血管疾病、糖尿病、腫瘤等，因此清除過(guò)多的自由基，對(duì)自由基因發(fā)生氧化作用引起的相關(guān)疾病能起到預(yù)防的作用，研究表明，天然植物中的黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、鞣質(zhì)、有機(jī)酸等有較強(qiáng)的抗氧化作用[8]。隨著醫(yī)藥事業(yè)的飛速發(fā)展，尋找天然無(wú)害的抗氧化保健藥是人們所追求的。而倒地鈴中有黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、鞣質(zhì)、有機(jī)酸等化學(xué)成分。通過(guò)本試驗(yàn)可知，倒地鈴乙酸乙酯提取物對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除作用，隨著濃度的增加而增強(qiáng)，對(duì)金屬離子Fe2+螯合能力較強(qiáng)，還原Fe3+能力隨著濃度的增加而增強(qiáng)，這證明倒地鈴乙酸乙酯提取物的體外抗氧化作用較強(qiáng)，表明它在保健藥品上有潛在開(kāi)發(fā)利用價(jià)值，本試驗(yàn)可為倒地鈴的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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