高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定不同來(lái)源水翁花中的2種活性成分

邱宏聰 陳 昭 柴 玲 劉布鳴

(1 廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西中醫(yī)藥研究院)，南寧，530001； 2 廣東省第二中醫(yī)院(廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院)，廣州，510095； 3 廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州，510095)

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定不同來(lái)源水翁花中的2種活性成分

邱宏聰1陳 昭2,3柴 玲1劉布鳴1

(1 廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西中醫(yī)藥研究院)，南寧，530001； 2 廣東省第二中醫(yī)院(廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院)，廣州，510095； 3 廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州，510095)

目的：對(duì)水翁花中的熊果苷和2′,4′-二羥基-6′-甲氧基-3′-5′-二甲基查耳酮進(jìn)行含量測(cè)定研究，建立藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用高效液相色譜(HPLC)法：以Diamonsil-C18(5 μm，250×4.6 mm)為色譜柱，以乙腈-0.05%磷酸(60:40)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃；結(jié)果：采用HPLC法建立了8批藥材的指標(biāo)性成分指紋圖譜并進(jìn)行準(zhǔn)確定量；結(jié)論：該方法快速、高效、準(zhǔn)確，能夠全面、有針對(duì)性地對(duì)水翁花藥材的質(zhì)量?jī)?yōu)劣進(jìn)行評(píng)價(jià)。

水翁花；高效液相色譜法；活性成分

水翁花(FlosCleistocalycisOperculati)為桃金娘科植物水翁(Cleistocalyxoperculatus(Roxb.)Merr.Et Perry)的花蕾，始載于《嶺南采藥錄》，為《廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(第一冊(cè))收載品種[1]。主分布于廣東、海南、廣西、福建等省區(qū)。具有清熱解暑、生津止渴、去濕消滯之功效，用于夏天暑濕食滯所致的發(fā)熱、咽干、口渴腹脹或嘔吐泄瀉[1-2]。常作為夏季消渴解暑的中藥復(fù)方“清熱涼茶”的主要原料之一，在民間使用非常廣泛。是嶺南地區(qū)的代表藥之一。

迄今為止，對(duì)于水翁花的相關(guān)研究中，除有成分提取分離。陳建等[2]利用水蒸汽蒸餾(SDE)和超臨界CO2萃取技術(shù)(SFE)提取水翁花的揮發(fā)油。Chun-Lin Ye等[3]運(yùn)用氣相色譜以及氣質(zhì)聯(lián)合色譜等分析技術(shù)從水翁花中提取分離5種黃酮類化合物。還有藥理學(xué)方面的研究，除了傳統(tǒng)的清熱解暑的療效外，水翁花還具有其他藥理活性。羅清等[4]通過(guò)研究表明，水翁花具有鎮(zhèn)痛，抗內(nèi)毒素的作用；程少璋等[5]的研究證實(shí)，其具有抗炎鎮(zhèn)痛解熱的作用；葉春林[6]等通過(guò)研究表明，水翁花中的成分2′,4′-二羥基-6′-甲氧基-3′-5′-二甲基查耳酮(2′,4-Dihydroxy-3-Methoxychalcone，DMC)能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡，為水翁花在抗腫瘤方向提供了一定的試驗(yàn)和理論基礎(chǔ)[7]。熊果苷則具有抗菌、鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰、抗氧化、利尿、抗?jié)?、抗腫瘤、抑制胰島素降解、增強(qiáng)免疫等作用[8-11]。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道，上述2種成分在水翁花中有較高的含量，因此可以作為控制該藥材質(zhì)量的指標(biāo)性成分。但是有關(guān)水翁花的藥理作用仍停留在其傳統(tǒng)功效“清熱解暑”，并未得到很好的利用。除提取分離與含量測(cè)定外，對(duì)水翁花中所含化學(xué)成分也無(wú)相關(guān)深入性的研究報(bào)道[12]。羅清[13]雖然對(duì)水翁花所含的活性成分進(jìn)行了大致的分離和鑒定，但仍未對(duì)這些化合物中與療效關(guān)系最為密切的化合物進(jìn)行篩選和確定，與此同時(shí)，也沒(méi)有以此為基礎(chǔ)形成與現(xiàn)有技術(shù)條件相適宜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。綜上所述，選取熊果苷和DMC作為水翁花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的指標(biāo)性成分，能夠更為貼近其功效主治，并準(zhǔn)確反應(yīng)其內(nèi)在的質(zhì)量信息。

本文對(duì)水翁花的主要有效成分進(jìn)行提取分離及對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，通過(guò)運(yùn)用柱色譜、薄層色譜、高效液相色譜等現(xiàn)代化分離分析技術(shù)，尋找并準(zhǔn)確測(cè)定相關(guān)的活性化合物。同時(shí)，根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的各類活性成分提取工藝[13,15-17]，結(jié)合其所含化合物理化性質(zhì)，完善相關(guān)化合物的提取工藝并最終形成質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。建立全面、實(shí)用、專屬性強(qiáng)、能夠反映水翁花質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，使其得到更多的使用和發(fā)展，進(jìn)一步促進(jìn)地方特色藥材與常見病治療藥材的資源保護(hù)和可持續(xù)利用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Waterse2695-2489);色譜柱Diamonsil-C18(5 μm，250×4.6 mm)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52AA)；MilliPore Advantage A10自動(dòng)純水機(jī)；Mettler XS205DU電子分析天平;ADAM CB101天平(1 000 g×0.1 g)；CAMAG ATS4型薄層自動(dòng)點(diǎn)樣儀；CAMAG REPROSTAR3薄層色譜自動(dòng)成像系統(tǒng)；HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋；電DHG-9203A熱恒溫古風(fēng)干燥箱；KQ-700DE超聲波清洗器。

1.2 試藥和試劑 熊果苷對(duì)照品(批號(hào)：110742-200314)、2′,4′-二羥基-6′-甲氧基-3′-5′-二甲基查耳酮(DMC)單體為自制、D101-大孔樹脂，由廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院提供。提取和液相色譜所使用的水均為MilliPore超純水，其他試劑均屬于(廣州化學(xué)制劑廠)分析純。流動(dòng)相磷酸(Fisher)、甲醇(Merck)、乙腈(Merck)等為色譜純。

1.3 分析樣品 水翁花藥材(產(chǎn)地批號(hào)見表1)共8批，均購(gòu)于廣州市中芝源中藥有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定為桃金娘科植物水翁。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以Diamonsil-C18(5 μm，250×4.6 mm為色譜柱，以乙腈(B)-0.05%磷酸(D)為流動(dòng)相,采用梯度洗脫，梯度程序?yàn)?～10 min，10%B：90%D；10～20 min，30% B:70%D；20～50 min，60% B:40%D；50～60 min，10%B:90%D。所檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；所有樣品進(jìn)樣量均為10 μL。對(duì)照品色譜圖見圖1。

圖1 熊果酸和DMC對(duì)照品色譜圖

注：1為熊果酸，2為DMC，含量均為20 μg/mL

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取熊果酸對(duì)照品、DMC對(duì)照品各10 mg，精密稱定，置同一10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得含2種化合物均為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品3 g，加入70%甲醇75 mL，室溫下靜置提取1 d。過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取2.3項(xiàng)下2種對(duì)照品溶液適量，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，分別配制成5、10、20、50、100 μg/mL的溶液。分別精密吸取上述溶液10 μL進(jìn)樣，記錄各濃度點(diǎn)色譜峰峰面積積分值，結(jié)果如表3、表4所示。以對(duì)照品溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)X，峰面積積分值為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖6、圖7，回歸方程為：熊果酸：Y=22 045X-27 676，r2=0.999 3；DMC：Y=10 018X +2 656.5 r2=0.999 1。2種對(duì)照品溶液濃度在5～100 μg/mL范圍內(nèi)線性良好。能夠?qū)λ袒ㄋ幉闹械?個(gè)目標(biāo)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

2.5 精密度和準(zhǔn)確度 精密吸取同一批號(hào)藥材供試品溶液10 μL，照4.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄熊果酸、DMC峰面積積分值，并計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果顯示，方法準(zhǔn)確度和精密度良好。

表1 準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批號(hào)的樣品(批號(hào)：141001—5)6份，按2.2項(xiàng)供試品溶液的制備方法處理，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，熊果酸和DMC的RSD分別為1.5%和1.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收實(shí)驗(yàn) 取同一批已知含量的藥材樣品(批號(hào)：141001—4)3 g，精密稱定5份，按照2.2項(xiàng)供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理，精密吸取續(xù)濾液5 mL，再精密加入100 μg/mL對(duì)照品溶液1 mL，用甲醇稀釋至刻度。精密吸取上述溶液10 μL，進(jìn)HPLC，照4.2項(xiàng)下色譜條件分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量及回收率，結(jié)果顯示(表2，表3)，方法回收率良好，能夠?qū)λ袒ㄖ械男芄岷虳MC進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

表2 熊果酸加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

表3 DMC加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8 樣品含量測(cè)定結(jié)果 取不同產(chǎn)地，批次的水翁花藥材，共8批(表4)，按照4.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法處理，得供試品溶液，分別精密吸取上述供試品溶液10 μL，注入HPLC，按2.4項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄熊果酸和DMC峰面積并計(jì)算含量。含量測(cè)定結(jié)果見表4，8批藥材的HPLC指紋圖見圖2。

表4 不同產(chǎn)地、批次水翁花含量測(cè)定給結(jié)果

圖2 8批藥材供試品色譜圖

3 討論

3.1 提取分離條件的考察和優(yōu)化 為確保水翁花的目標(biāo)化合物成分能在指紋圖譜中體現(xiàn)，本文根據(jù)其理化性質(zhì)以及查閱文獻(xiàn)[15-16]，分別采用了70%甲醇、乙醇、水等溶劑對(duì)其進(jìn)行提取。最后選用70%甲醇作為溶劑，再利用柱色譜的原理，將提取液用不同比例的甲醇-水溶液進(jìn)行洗脫，分離有效成分，進(jìn)行測(cè)定，可知其提取液中目標(biāo)化合物提取率較高，色譜峰信息較豐富。

3.2 HPLC指紋圖譜的建立和優(yōu)化 本課題根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水翁花中所含活性成分多為黃酮類，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，有機(jī)相采用乙腈時(shí)，較甲醇分離效果更佳，且出峰時(shí)間較短，故選用；在水相選擇方面，研究發(fā)現(xiàn)，向水相中加入一定濃度的磷酸能夠有助于改善峰型，提高分離度，但磷酸濃度過(guò)高易對(duì)色譜柱產(chǎn)生損傷，因此，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，將磷酸濃度固定在0.5%(v/v)。

洗脫程序選擇方面，鑒于水翁花中所含活性成分較多，且結(jié)構(gòu)較為類似，單純的等度洗脫很難將待測(cè)物與其他干擾性成分成功區(qū)分，因此選擇梯度洗脫。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，2.4項(xiàng)下所述的色譜條件能夠成功區(qū)分待測(cè)物與其他干擾性成分，故選用。

3.3 不同產(chǎn)地、批次藥材指紋圖譜及質(zhì)量信息研究 由2.5項(xiàng)下各不同批次、產(chǎn)地藥材中熊果酸和DMC的測(cè)定結(jié)果可知，廣東產(chǎn)水翁花藥材中上述成分含量最高，海南產(chǎn)藥材中上述成分含量最低。提示水翁花可能受種植地氣候、土壤、地理環(huán)境等因素的影響，造成上述差異，在后續(xù)的規(guī)范化種植及藥材選用中，應(yīng)謹(jǐn)慎選擇產(chǎn)地，確保藥材質(zhì)量。

3.4 結(jié)論 本研究采用柱層析和HPLC法，對(duì)水翁花中的活性成分進(jìn)行了分離和測(cè)定，該方法快速、高效，能夠較為準(zhǔn)確全面地反映水翁花中活性成分的含量信息，并用于對(duì)不同來(lái)源、產(chǎn)地和采收時(shí)節(jié)的藥材質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。

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SimultaneousDeterminationofTwoActiveComponentsinFlosCleistocalycisOperculatibyHighPerformanceLiquidChromatography

Qiu Hongcong1, Chen Zhao2,3,Chai Ling1, Liu Buming1

(1GuangxiKeyLaboratoryofTCMQualityStandards(GuangxiInstituteofChineseMedicineandPharmaceuticalScience),Nanning530001,China; 2GuangdongSecondTCMHospital(GuangdongProvincialEngineeringTechnologyResearchInstituteofTCM),Guangzhou510095,China; 3GuangdongProvincialKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentinTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510095,China)

Objective:To evaluate the quality of Flos Cleistocalycis Operculati by quantitatively determining arbutin and 2′,4′-dihydroxy-6′-methoxy-3′-5′-dimethylchalcone.MethodsHPLC was used for determination, with Diamonsil-C18(5 μm,250×4.6 mm) column and a mobile phase containing acetonitrile-0.05% phosphoric acid; the detection wavelength was 254 nm, column temperature 25 ℃ and the elution mode was gradient, with a flow rate of 1.0 mL/min;ResultsEight batches of herb samples were accurately determined and established fingerprints.ConclusionThe proposed method was fast, efficient and accurate, which can be used in quality evaluation of Flos Cleistocalycis Operculati comprehensively and specifically.

Flos Cleistocalycis Operculati; High performance liquid chromatography; Active components

廣西中醫(yī)藥研究院系統(tǒng)研究課題(桂中重自201401)

邱宏聰(1983.11—)，男，碩士，助理研究員，研究方向：中藥和藥物分析及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作,E-mail：364374130@qq.com

劉布鳴(1953.06—)，男，本科，研究員，研究方向：有機(jī)、天然產(chǎn)物化學(xué)成分以及新藥開發(fā)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，E-mail：zybzzdsys@163.com

R286

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.10.050

(2016-08-01收稿 責(zé)任編輯：徐穎)